李芳源，王常安，劉紅柏，徐奇友

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 210000；3.湖州師范學(xué)院，浙江 湖州 313000）

【研究意義】魚粉作為優(yōu)質(zhì)蛋白源是魚類飼料的重要組成部分。在魚粉量少價(jià)高的情況下，為滿足魚類對蛋白質(zhì)的需求，尋求魚粉的可替代物成為飼料研究中的熱點(diǎn)[1]。在許多植物蛋白中，大豆蛋白因具有較高的蛋白質(zhì)和相對均衡的氨基酸已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要的魚粉替代品[2]。然而，大豆蛋白含有的抗?fàn)I養(yǎng)因子（凝集素、寡糖、皂苷和胰蛋白酶抑制劑）可能會阻礙蛋白質(zhì)消化、削弱免疫反應(yīng)并引起腸道炎癥，從而阻礙魚類生長[3-4]。【前人研究進(jìn)展】目前，大豆蛋白飼料在南方鲇（Silurus meridionalis）[5]、尼羅羅非魚（nile tilapia）[6]、軍曹魚（Rachycentron canadum）[7]、歐洲鱸魚（Dicentrarchus labrax）[8]、黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）[9]，斑馬魚（Danio rerio）[10]、星突江鰈（Platichthys stellatus）[11]，大西洋牙鲆（Paralichthys dentatus）[12]，黃金鱸（Perca flavescens）[13]等多種水產(chǎn)動(dòng)物中使用，并且發(fā)現(xiàn)大豆蛋白部分替代魚粉能夠促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長，高比例替代魚粉會對腸道健康造成影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大豆經(jīng)熱處理后加工生成膨化大豆，不僅保留了大豆本身的營養(yǎng)成分，還降低了大豆中對熱敏感的抗?fàn)I養(yǎng)因子，能夠促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物對大豆蛋白的消化吸收。左亞男等[14]研究發(fā)現(xiàn)用添加了蛋氨酸的膨化全脂大豆粉替代20%魚粉蛋白時(shí)，烏鱧（Channa argus）的平均增重率顯著高于80%和100%替代組。在鯉魚（Cyprinus carpio）[15]和雜交鱘[16]研究中也有類似結(jié)果。因此，有關(guān)膨化大豆替代魚粉促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長的研究受到很多人關(guān)注?！緮M解決的關(guān)鍵問題】魚的生長與體內(nèi)消化酶活性及腸道性能相關(guān)，本試驗(yàn)旨在研究膨化大豆替代魚粉后對雜交鱘消化能力及腸道結(jié)構(gòu)影響，以期為雜交鱘飼料配制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

對照組飼料以膨化大豆、豆粕、進(jìn)口蒸汽魚粉、大豆?jié)饪s蛋白、進(jìn)口肉骨粉、噴霧干燥血粉、玉米蛋白為蛋白源。用膨化大豆分別替代100%（G1）、75%（G2）、50%（G3）、25%（G4）和0%（G5）魚粉，配制成5種等氮等能飼料。試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平見表1[16]。配制飼料前，將所有原料粉碎過80 目篩，混勻后加入豆油和魚油充分混合，再加入適量水混合，用鼓型混合機(jī)混合后膨化制成直徑為3 mm 的顆粒，置于-20 ℃冰箱中備用。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平Tab.1 Formula and nutritional level of the experiment feed

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)雜交鱘體質(zhì)量為（75.0±4.3）g由黑龍江省撫遠(yuǎn)縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站提供。試驗(yàn)在哈爾濱市魚苗種場進(jìn)行。試驗(yàn)魚用試驗(yàn)飼料馴化15 d 后，挑選體質(zhì)健壯、大小均勻的雜交鱘600 尾，隨機(jī)分成5 個(gè)處理，每處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)120 尾，飼養(yǎng)于室內(nèi)水族箱（220 L）中，每水槽取30 尾經(jīng)饑餓24 h 后的魚測量其體質(zhì)量和體長作為生長指標(biāo)初始值。試驗(yàn)用水為循環(huán)混合水（電場余熱水和深井水混合），水溫19.0～23.0 ℃，溶氧大于6 mg/L。每天投喂6次，飽食投喂。試驗(yàn)共進(jìn)行42 d，結(jié)束后，魚空腹24 h，稱量每水槽魚總質(zhì)量，取30尾測量體質(zhì)量和體長作為生長指標(biāo)結(jié)束值。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)水槽中隨機(jī)選取4 尾魚，在冰盤上分別取胃、腸道（不含內(nèi)容物）和胰腺，液氮速凍，分裝保存于-80 ℃超低溫冰箱。樣品分析前于4 ℃冰箱內(nèi)解凍，在冰盤迅速準(zhǔn)確稱取一定量的組織，按1∶9 重量體積比（w/v）加入預(yù)冷生理鹽水，用高速組織勻漿機(jī)勻漿（15 000 r/min，3 min）稀釋，4 ℃下4 500 r/min離心15 min，取上清液測定消化酶活性。

1.4 消化酶活性測定和組織切片觀察

消化酶活性測定：蛋白酶以福林-酚法測定，脂肪酶用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法測定，淀粉酶測定以淀粉-碘比色法[17]。

組織切片：每重復(fù)隨機(jī)取4 尾魚的中腸、瓣腸于Bouin’s 液中固定48 h，常規(guī)石蠟包埋后，用KD1508型切片機(jī)對樣本進(jìn)行橫方向連續(xù)切片，切片厚度為6μm，蘇木精-伊紅染色法染色，中性樹膠封片，Motic光學(xué)顯微鏡下觀察腸道結(jié)構(gòu)病理變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS19.0過程進(jìn)行單因素方差分析和Duncan’s多重比較，顯著性水平P值為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 膨化大豆替代魚粉對雜交鱘蛋白酶活性的影響

從表2可見，飼料中膨化大豆水平對雜交鱘消化系統(tǒng)的蛋白酶活性影響不大（P＞0.05）。隨著飼料中膨化大豆水平的增加，中腸、瓣腸、幽門盲囊、胃的蛋白酶活性無顯著性差異；且與對照組（G5）相比，中腸、瓣腸、幽門盲囊、胃的蛋白酶活性有所下降。

表2 膨化大豆替代魚粉對雜交鱘蛋白酶活性的影響Tab.2 Effects of fish meal replacement by full-fatty extruded soybean on protease activities of hybrid sturgeon

2.2 膨化大豆替代魚粉對雜交鱘脂肪酶活性的影響

從表3可見，飼料中膨化大豆水平對雜交鱘消化系統(tǒng)的蛋白酶活性影響不大（P＞0.05）。隨著飼料中膨化大豆水平的增加，中腸、瓣腸、幽門盲囊、胃的脂肪酶活性無顯著性差異；與對照組（G5）相比，中腸、瓣腸、幽門盲囊、胃的脂肪酶活性有所下降。

表3 膨化大豆替代魚粉對雜交鱘脂肪酶活性的影響Tab.3 Effects of fish meal replacement by full-fatty extruded soy bean on lipase activities of hybrid sturgeon n=3SD

表3 膨化大豆替代魚粉對雜交鱘脂肪酶活性的影響Tab.3 Effects of fish meal replacement by full-fatty extruded soy bean on lipase activities of hybrid sturgeon n=3SD

2.3 膨化大豆替代魚粉對雜交鱘淀粉酶活性的影響

試驗(yàn)結(jié)果見表4。飼料中膨化大豆水平對雜交鱘消化系統(tǒng)的淀粉酶活性影響不顯著（P＞0.05）。隨著飼料中膨化大豆水平的增加，中腸、瓣腸、幽門盲囊、胃的淀粉酶活性無顯著性差異；與對照組（G5）相比，中腸、瓣腸、幽門盲囊、胃的淀粉酶活性有所上升。

表4 膨化大豆替代魚粉對雜交鱘淀粉酶活性的影響Tab.4 Effects of fish meal replacement by full-fatty extruded soybean on amylase activities of hybrid sturgeon n=3；SD

表4 膨化大豆替代魚粉對雜交鱘淀粉酶活性的影響Tab.4 Effects of fish meal replacement by full-fatty extruded soybean on amylase activities of hybrid sturgeon n=3；SD

2.4 膨化大豆替代魚粉對雜交鱘腸道結(jié)構(gòu)的影響

觀察中腸和瓣腸的組織切片發(fā)現(xiàn)，對照組粘膜上皮細(xì)胞排列整齊，上皮結(jié)構(gòu)完整性較好，絨毛發(fā)達(dá)，柱狀上皮細(xì)胞排列緊密整齊，杯狀細(xì)胞較多（圖1A、圖1D、圖1G、圖1J）；當(dāng)替代魚粉水平為75%時(shí)，腸道組織結(jié)構(gòu)完整性被破壞，部分紋狀緣融合、脫落，細(xì)胞空泡化嚴(yán)重（圖1H、圖1K），雜交鱘腸道絨毛排列不規(guī)律，邊緣模糊，褶皺相對稀疏且寬度較大，部分褶皺受到破壞（圖1B、圖1E）；魚粉替代水平為100%時(shí)，腸道組織結(jié)構(gòu)被破壞，微絨毛基本脫落，腸道腸壁增厚，褶皺短而粗、分布稀疏，且多處褶皺受到損傷（圖1C、圖1F）；杯狀細(xì)胞減少，柱狀上皮細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞核偏移（圖1I、圖1L）。

圖1 膨化大豆替代魚粉為雜交鱘腸道結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of fish meal replacement by full-fatty extruded sogbean on the intestinal structure of hyhrid sturgeon

3 討論

3.1 膨化大豆替代魚粉對雜交鱘消化酶活性的影響

前期研究表明，部分膨化大豆（25%）替代魚粉后不影響雜交鱘的增重率及存活率[16]。當(dāng)豆粕替代比例為75%時(shí)對非洲鯰魚（Clarias Gariepinus）[18]及尼羅羅非魚[6]的生長性能無顯著影響。用30%的大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉降低了黃尾獅幼魚（Seriola lalandi）的體質(zhì)量[19]。這表明膨化大豆對不同品種魚類的生長影響不同。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)膨化大豆替代魚粉對雜交鱘消化系統(tǒng)中的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性影響不顯著，與對照組相比，消化系統(tǒng)中的蛋白酶及脂肪酶的活性均有所降低，且胃中蛋白酶及幽門盲囊的脂肪酶活性下降最多；而消化系統(tǒng)中的淀粉酶活性隨著膨化大豆替代比例的升高而升高。在凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）中同樣發(fā)現(xiàn)隨著酶解豆粕替代魚粉比例的升高，淀粉酶活性上升[20]。本試驗(yàn)中試驗(yàn)組魚的消化酶活性與對照組無顯著差異，可能與對照組中添加的豆粕有關(guān)，對照組的蛋白源由魚粉跟豆粕共同構(gòu)成，雜交鱘為肉食性魚類，腸道對純魚粉蛋白源的消化吸收能力強(qiáng)于對照組的混合型蛋白源，魚粉蛋白更加能增加腸道消化酶的活性，這也可能是各組間消化酶活性不顯著的原因。隨著日糧中豆粕含量的增加，尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）胃、前腸和后腸中的蛋白酶，脂肪酶和淀粉酶活性顯著降低[21]。與魚粉喂養(yǎng)的魚相比，豆粕喂養(yǎng)的紅鯛（Pagrus major）的腸道中胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，脂肪酶和淀粉酶活性顯著降低[22]。在大西洋鮭（Salmo salar）[23]和雜交羅非魚（Oreochromis niloticus×O.aureus）[24]中也有類似報(bào)道。這可能由于隨著膨化大豆比例的增加，大豆中的非淀粉多糖增加，非淀粉多糖可降低脂肪酶等的活性[3]。大豆中凝集素的存在會改變腸上皮粘膜分泌情況，導(dǎo)致粘液分泌過多，從而使魚體內(nèi)酶的活性下降[4]。唐濤等[25]研究發(fā)現(xiàn)膨化豆粕替代48%的魚粉后顯著降低了黃鱔（Monopterus albus）腸道脂肪酶活性。用大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉飼喂黃顙魚，各組間胃蛋白酶活性無顯著差異[26]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。這可能是因?yàn)榇蠖節(jié)饪s蛋白跟膨化大豆均為大豆的加工產(chǎn)品，大豆經(jīng)膨化后能夠降低抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，如胰蛋白酶抑制劑、抗原蛋白、大豆異黃酮等，胰蛋白酶抑制因子含量降低有益于胰蛋白酶對營養(yǎng)物質(zhì)的消化，從而提高雜交鱘的消化能力。

3.2 膨化大豆替代魚粉對雜交鱘腸道結(jié)構(gòu)的影響

廖珂[27]在研究不同處理豆粕對斷奶仔豬腸粘膜屏障影響中發(fā)現(xiàn)膨化大豆部分替代精料后，降低了仔豬的腹瀉率，改善了小腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)。用膨化大豆粉的代乳粉飼喂?fàn)倥?，其腸道黏膜絨毛變長，絨毛的完整性變好[28]。這表明飼喂少量的膨化大豆能夠提高家畜的腸道性能，而膨化大豆對魚類腸道結(jié)構(gòu)的影響鮮有研究。本試驗(yàn)中當(dāng)膨化大豆替代比例高于75%時(shí)，雜交鱘腸道結(jié)構(gòu)受到破壞，微絨毛排列散亂，腸道褶皺變短，細(xì)胞空泡化嚴(yán)重。用豆粕替代30%～60%的魚粉后，烏鱧（Channa argus）腸道損傷明顯，腸壁厚度不均勻，腸道褶皺短而稀疏[29]。大豆蛋白水平的提高也改變了虹鱒（Oncorhynchus mykiss）消化道的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，腸粘膜褶皺縮短，固有層粘膜腫脹，腸吸收性細(xì)胞核上空泡喪失，上皮固有層和粘膜下層出現(xiàn)白細(xì)胞浸潤[30]。碳水化合物、抗?fàn)I養(yǎng)因子（ANFs）的增加以及氨基酸含量的不平衡都會對魚類的消化系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)面影響，從而導(dǎo)致魚類的生產(chǎn)性能下降[31]。大豆中抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量與其對腸道的損傷成正相關(guān)。王彥飛等[32]研究發(fā)現(xiàn)隨著膨化豆粕替代魚粉比例的增加，斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）腸道褶皺高度降低，肌層厚度逐漸降低。當(dāng)大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉水平超過44%時(shí)，雜交石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatu♂s）小腸絨毛長度和肌肉厚度顯著降低[33]。豆粕過量替代魚粉會對鯉（Cyprinus carpio）腸道產(chǎn)生損傷同時(shí)也會降低肝胰臟蛋白酶的活性[34]。用豆粕替代魚粉會導(dǎo)致羅非魚[24]和鱸魚[13（]Perca flavescens）胃和腸中絨毛的高度降低，排列不規(guī)律。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。這可能跟大豆中存在的抗?fàn)I養(yǎng)因子有關(guān)，大豆經(jīng)膨化后并不能使抗?fàn)I養(yǎng)因子完全剔除，只能降低胰蛋白酶抑制因子、大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白等的含量，當(dāng)膨化大豆替代魚粉比例過高時(shí)，抗?fàn)I養(yǎng)因子對魚腸道結(jié)構(gòu)的影響也會增大，嚴(yán)重的會導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生。因此，在采用大豆蛋白作為飼料蛋白源時(shí)應(yīng)考慮替代比例在75%以下時(shí)對雜交鱘的生長及腸道不造成顯著影響。