白藝蘭，楊顯超，劉 健，夏爐明，陳偉鋒，龔國(guó)華，朱曉英，陶田谷晟，常曉靜，桂亞萍，李增強(qiáng)，王 建，趙洪進(jìn)

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

狂犬?。╮abies）俗稱“瘋狗病”，是一種主要在犬科動(dòng)物中傳播和流行的人獸共患傳染病。患病動(dòng)物或者人一旦發(fā)病，死亡率幾乎為100%[1]。在狂犬病預(yù)防和控制中，疫苗免疫是主要措施[2]。目前，我國(guó)廣泛使用的狂犬病滅活疫苗均為注射劑，對(duì)流浪犬及野生動(dòng)物適用性不強(qiáng)，而狂犬病口服疫苗已在部分發(fā)達(dá)國(guó)家野生動(dòng)物狂犬病防控中起到重要作用。因此對(duì)流浪犬采用狂犬病口服疫苗免疫，提高免疫合格率，是控制狂犬病在流浪犬中流行的可行措施之一[3]。

以犬2 型腺病毒（canine adenovirus type 2，CAV-2）為載體表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白（RABV-G）的重組活疫苗，因其自身優(yōu)點(diǎn)得到越來越多的研究應(yīng)用[4]。CAV-2 能夠高效轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因，刺激呼吸道及消化道，誘發(fā)黏膜免疫，增強(qiáng)機(jī)體免疫原性[5]。此外，CAV-2 不能在人體內(nèi)復(fù)制，其生產(chǎn)及使用安全系數(shù)高[6]。CAV2-ΔE3-CGS 是以CAV-2 缺失E3基因?yàn)檩d體表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的重組病毒疫苗，經(jīng)口服可使犬產(chǎn)生狂犬病病毒糖蛋白抗體，已于2007 年獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書（生產(chǎn)應(yīng)用）。為了解CAV2-ΔE3-CGS 口服疫苗在流浪犬體內(nèi)產(chǎn)生的抗體水平，探索抗體的產(chǎn)生規(guī)律，選取上海市收容的流浪犬進(jìn)行CAV2-ΔE3-CGS 口服疫苗免疫試驗(yàn)，測(cè)定狂犬病病毒ELISA 抗體，以期為流浪犬狂犬病免疫提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物來源 上海市公安局犬類留驗(yàn)所收容的流浪犬。

1.1.2 疫苗和主要試劑 狂犬病口服疫苗CAV2-ΔE3-CGS 及誘餌原料（肉骨粉、面粉、犬糧、魚粉），由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所扈榮良老師惠贈(zèng)；傳統(tǒng)狂犬病疫苗，購自默沙東動(dòng)物保健品（上海）有限公司；食品級(jí)腸衣，購自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；MDCK 細(xì)胞，由上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存；犬腺病毒（CAV）IgG 抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)D031521），購自荷蘭EVL 公司；狂犬病病毒抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)19ZEAW010），購自美國(guó)SYNBIOTICS 公司；犬瘟熱病毒RT-PCR 檢測(cè)試劑盒（EC20200601）、犬細(xì)小病毒PCR 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)EC20200602-01），均購自上海爾創(chuàng)生物技術(shù)有限公司。

1.2 口服疫苗病毒株病毒滴度TCID50 測(cè)定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MDCK 細(xì)胞，以胰酶消化后用DMEM 培養(yǎng)基重新懸浮，接種至96 孔板，每孔100 μL（2×106個(gè)細(xì)胞/mL）；待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄去上清，每孔加入100 μL 10 倍倍比稀釋的CAV2-ΔE3-CGS 病毒液，共11 個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度重復(fù)8 個(gè)孔，最后一列為空白對(duì)照，混勻后置于37 ℃感作1 h；棄去培養(yǎng)液，加入2% DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h；通過顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，按Reed-Muench 法計(jì)算病毒TCID50，將病毒液按照每頭份1×108個(gè)TCID50的規(guī)格進(jìn)行分裝，凍干，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 口服疫苗誘餌制備

準(zhǔn)備1 kg 誘餌原料（肉骨粉40%、面粉25%、犬糧30%和魚粉5%），加入200 g 純凈水后充分混勻成面團(tuán)狀，用骨型模具壓制成骨頭形狀，60 ℃烘干12 h 后成型。誘餌規(guī)格為骨型，長(zhǎng)10.0 cm，中間寬1.5 cm；中空，空腔長(zhǎng)、寬、高分別為5.0、1.0、0.3 cm，中間放入腸衣包裹的狂犬病口服疫苗CAV2-ΔE3-CGS，并用食用蠟密封。其中狂犬病口服疫苗CAV2-ΔE3-CGS 制作流程：將腸衣制成長(zhǎng)、寬、高分別為5.0、1.0、0.3 cm 規(guī)格的密封袋，每個(gè)里面裝有1×108個(gè)TCID50的口服疫苗凍干粉。

1.4 試驗(yàn)犬只確定及免疫分組

1.4.1 狂犬病病毒抗體ELISA 檢測(cè) 從犬類留驗(yàn)所收容的流浪犬中隨機(jī)挑選32 只（編號(hào)為1～32），采集血清，應(yīng)用狂犬病病毒抗體ELISA試劑盒開展檢測(cè)，剔除狂犬病抗體陽性犬只。

1.4.2 CAV IgG 抗體ELISA 檢測(cè) 對(duì)剔除狂犬病抗體陽性犬后的剩余犬只，應(yīng)用CAV IgG 抗體ELISA 試劑盒開展檢測(cè)，剔除CAV 抗體陽性犬只。

1.4.3 犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒病原學(xué)檢測(cè) 采集流浪犬肛拭子，應(yīng)用犬瘟熱病毒RT-PCR 檢測(cè)試劑盒、犬細(xì)小病毒PCR 檢測(cè)試劑盒，進(jìn)行犬瘟熱、犬細(xì)小病毒檢測(cè)，剔除犬瘟熱、犬細(xì)小病毒病原學(xué)檢測(cè)陽性犬只。

1.4.4 流浪犬分組 對(duì)12 只檢測(cè)合格的流浪犬進(jìn)行分組標(biāo)記，其中CAV2-ΔE3-CGS口服免疫組5只、傳統(tǒng)疫苗注射組5 只、陰性對(duì)照組2 只。統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)犬只犬種、月齡、性別等基本信息。

1.5 免疫程序

1.5.1 口服疫苗CAV2-ΔE3-CGS 組 CAV2-ΔE3-CGS疫苗對(duì)犬只進(jìn)行兩次口服免疫，首次免疫（首免）2 周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫（二免）。首次免疫后每周采集血清1 次，二免后第3 周停止采血。

1.5.2 傳統(tǒng)疫苗注射組 按照免疫注射要求，將傳統(tǒng)狂犬病注射疫苗對(duì)犬只進(jìn)行1 次注射免疫，免疫后每周采集血清1 次，采集至注射疫苗二免后第3 周。

1.5.3 陰性對(duì)照組 陰性對(duì)照組犬只口服不含CAV2-ΔE3-CGS 疫苗的誘餌，同樣進(jìn)行兩次口服。首次口服后每周采集血清1 次，二次口服后第3 周停止采血。

1.6 狂犬病抗體檢測(cè)

按照免疫程序采集試驗(yàn)犬只血清（包括免疫前血清），使用狂犬病病毒抗體ELISA 試劑盒進(jìn)行抗體檢測(cè)，評(píng)估疫苗免疫效果。

2 結(jié)果

2.1 狂犬病抗體水平ELISA 檢測(cè)

采集試驗(yàn)犬只血清，使用ELISA 試劑盒測(cè)定狂犬病病毒血清抗體水平，檢測(cè)結(jié)果見表1。口服疫苗組犬只抗體產(chǎn)生速度較慢，8、10 和13 號(hào)犬只在二免后第3 周抗體水平分別達(dá)0.87、1.23、1.68 IU/mL，超過了國(guó)標(biāo)GB/T 34739—2017 中要求的0.50 IU/mL，即產(chǎn)生了完全保護(hù)力；7、15 號(hào)犬只在兩次免疫后抗體水平最高僅分別為0.20 和0.07 IU/mL，未產(chǎn)生完全保護(hù)力。傳統(tǒng)疫苗注射組中，26、27 和28 號(hào)犬只在免疫后1周即產(chǎn)生了抗體，其中26、27 號(hào)犬只抗體水平均超過0.50 IU/mL，28 號(hào)犬只在免疫后第2 周抗體水平超過0.50 IU/mL；21 號(hào)犬只抗體產(chǎn)生較慢，在免疫后第5 周抗體水平才達(dá)0.52 IU/mL；23 號(hào)犬只免疫后抗體水平最高僅為0.22 IU/mL，沒有產(chǎn)生完全保護(hù)力。陰性對(duì)照組犬只抗體水平均為0，對(duì)照成立。

表1 流浪犬狂犬病病毒抗體水平ELISA 檢測(cè)結(jié)果

2.2 狂犬病病毒抗體水平消長(zhǎng)趨勢(shì)

口服疫苗組60%犬只狂犬病病毒抗體達(dá)到保護(hù)水平（抗體合格率60%），其平均抗體水平在二免后呈直線上升趨勢(shì)（圖1）。首免后1 周，抗體水平基本為0，但是首免2 周后平均抗體水平達(dá)到0.23 IU/mL；二免后抗體水平首先呈下降趨勢(shì)，在二免后第3 周抗體水平快速上升，平均抗體水平達(dá)0.81 IU/mL。傳統(tǒng)疫苗注射組犬只狂犬病抗體水平合格率為80%，平均抗體水平在免疫后第1 周即能達(dá)到0.30 IU/mL，免疫后2 周可達(dá)0.68 IU/mL，然后保持在較高水平。

3 討論

人和犬的狂犬病在大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家和部分發(fā)展中國(guó)家都已消除，其措施主要是對(duì)家養(yǎng)犬進(jìn)行大面積疫苗免疫并采取嚴(yán)格預(yù)防措施，對(duì)野生動(dòng)物進(jìn)行誘餌口服免疫，切斷野生動(dòng)物狂犬病傳播至犬而再度傳播至人的途徑，最終達(dá)到持久性消除狂犬病效果[7]。在口服疫苗對(duì)野生動(dòng)物免疫成功的基礎(chǔ)上，世界衛(wèi)生組織（WHO）提出并建議采用誘餌口服免疫流浪犬，以提高犬的免疫覆蓋率，從而達(dá)到控制和消除狂犬病的目的[8-9]。2009—2019 年，上海市人間狂犬病病例傳染源主要來自流浪犬[10]，雖然沒有直接證據(jù)表明流浪貓是狂犬病的直接傳染源，但流浪貓依然是狂犬病的潛在宿主。因此，口服疫苗免疫是城市流浪動(dòng)物狂犬病免疫的主要手段之一，也是傳統(tǒng)注射免疫的重要補(bǔ)充。

上海市公安局犬類留驗(yàn)場(chǎng)內(nèi)收留流浪犬只多為田園犬。本試驗(yàn)選取健康流浪犬作為試驗(yàn)動(dòng)物，飼喂口服疫苗前，應(yīng)用狂犬病病毒ELISA 試劑盒進(jìn)行抗體檢測(cè)，剔除了抗體水平≥0.50 IU/mL 的抗體陽性犬只，免疫前血清中存在的低量狂犬病病毒抗體不會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。受流浪犬留驗(yàn)場(chǎng)環(huán)境及工作人員數(shù)量限制，最終選取12 只流浪犬作為試驗(yàn)動(dòng)物開展初步評(píng)估，試驗(yàn)結(jié)果對(duì)后續(xù)口服疫苗優(yōu)化及免疫程序制定將起到參考作用。

口服疫苗組中，不同品種、性別、月齡的犬只平均抗體水平總體呈波浪狀上升趨勢(shì)。首免后抗體水平雖快速上升，但是幅度不大，只有13 號(hào)犬只抗體水平達(dá)到0.61 IU/mL；二免后抗體水平開始下降，二免第2 周后迅速升高，第3 周后平均抗體水平達(dá)到0.81 IU/mL，說明CAV2-ΔE3-CGS 疫苗口服一次不能完成免疫，應(yīng)進(jìn)行兩次才能達(dá)到較好保護(hù)水平?？诜呙鏑AV2-ΔE3-CGS 免疫抗體合格率為60%，說明CAV2-ΔE3-CGS 疫苗口服免疫可以使過半數(shù)流浪犬產(chǎn)生狂犬病病毒抗體，抗體水平高于國(guó)標(biāo)GB/T 34739—2017 所要求的0.50 IU/mL，可產(chǎn)生完全保護(hù)作用，符合狂犬病防控中對(duì)于狂犬病疫苗的要求[11]。陳奇等[12]以表達(dá)狂犬病病毒SRV9 株糖蛋白的重組桿狀病毒接種小鼠，發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗狂犬病病毒中和抗體，達(dá)到保護(hù)水平的小鼠比例可達(dá)100%。韓乃君等[6]研究顯示，口服和注射一次表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的CAV-2 活載體重組疫苗，可使中和抗體達(dá)到保護(hù)水平。此外，留驗(yàn)場(chǎng)收容犬的免疫狀態(tài)、生活環(huán)境和飼養(yǎng)條件均可能影響免疫效果。本試驗(yàn)中，7 號(hào)和15 號(hào)犬只抗體水平未能達(dá)到保護(hù)效價(jià)，推測(cè)可能與誘餌適口性[13]、流浪犬免疫狀態(tài)、個(gè)體差異、環(huán)境條件、營(yíng)養(yǎng)、溫度等因素有關(guān)。加之在進(jìn)行流浪犬口服免疫時(shí)，氣溫較低，飼養(yǎng)環(huán)境較差，犬只有不同程度感染和發(fā)病，可能也會(huì)間接導(dǎo)致口服免疫失敗。傳統(tǒng)疫苗注射組23 號(hào)犬只抗體未能達(dá)到保護(hù)水平以及21 號(hào)犬只抗體產(chǎn)生緩慢，也間接反映出部分流浪犬免疫狀態(tài)不佳，免疫應(yīng)答遲緩。

CAV2-ΔE3-CGS 疫苗為CAV-2 載體缺失重組活疫苗，免疫流浪犬后可產(chǎn)生狂犬病病毒G 蛋白抗體和CAV-2 抗體，流浪犬機(jī)體中帶有CAV 抗體會(huì)嚴(yán)重影響免疫效果。因此，在有專人集中管理、有條件進(jìn)行群體免疫的流浪犬收容場(chǎng)所，建議對(duì)流浪犬CAV 本底抗體進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估犬群是否可免疫CAV2-ΔE3-CGS 口服疫苗，以提高免疫效果[14]。同時(shí)要加強(qiáng)流浪犬群體疫病防控和飼養(yǎng)管理，防止免疫過程中產(chǎn)生應(yīng)激或繼發(fā)其他疫病。CAV2-ΔE3-CGS 口服疫苗雖然能使流浪犬產(chǎn)生保護(hù)性抗體，但是免疫犬抗體本底情況、飼養(yǎng)條件、健康狀況、誘餌劑型、免疫程序等都會(huì)影響免疫效果，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步研發(fā)合理的誘餌劑型，探索腸溶型誘餌制劑，提高腸黏膜免疫[15]，摸索最佳免疫程序，制定合理免疫方案，從而使口服疫苗達(dá)到最佳免疫效果。