陳淵泉

（仙游縣畜牧獸醫(yī)局，福建仙游 351200）

禽流感（avian influenza，AI）是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一種禽類傳染病，不僅對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重危害，而且具有重要公共衛(wèi)生學(xué)意義[1]。AIV 是一種單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA 病毒，其基因組由PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS8 個(gè)基因片段組成，編碼11 種蛋白。根據(jù)AIV 表面抗原血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的抗原性差異，其可進(jìn)一步分為若干亞型。目前除在蝙蝠中發(fā)現(xiàn)的兩種新亞型A 型流感病毒（H17N10 和H18N11）外，其余的16 種HA 亞型和9 種NA 亞型均能在野禽或家禽中分離到[2]。20世紀(jì)90 年代中期以前，鴨和鵝等水禽被認(rèn)為僅攜帶AIV，可排毒但不發(fā)病。但之后的研究[3]發(fā)現(xiàn)，水禽不僅是AIV 的天然貯存庫(kù)，同時(shí)其本身也已成為對(duì)AIV 高度易感、高發(fā)病率與高死亡率的禽類。家禽和野生鳥類的H5N1 AIV 疫情長(zhǎng)期監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)[4]顯示，我國(guó)南方鴨群H5 亞型AIV 陽性率較高，表明H5N1 AIV 在水禽中往往表現(xiàn)低致病性，并通過“水禽—陸生家禽—水禽”循環(huán)維持病毒存在，促成了H5N1 AIV 的傳播。2017 年初，H7N9 高致病性AIV 在廣東省出現(xiàn)，并很快形成9 種基因型，雖然接種疫苗減少了感染，但一些H7N9 AIV 對(duì)鴨的致病性有逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)[5-6]。因此，水禽（鴨）在AI 的發(fā)生、傳播、流行及病毒變異和跨種傳播中起著重要作用，而疫苗免疫仍是加強(qiáng)水禽AI 疫情防控的首選策略[7]。

臨床研究[8]表明，接種重組滅活疫苗對(duì)預(yù)防我國(guó)養(yǎng)殖水禽高致病性AI 具有十分積極的意義。種鵝和蛋鴨在14 日齡接種重組AIV（H5N1 Re-11株+Re-12 株，H7N9 Re-2 株）三價(jià)滅活疫苗，在45 日齡進(jìn)行二次免疫后，產(chǎn)生的H5N1 Re-11/Re-12 株、H7N9 Re-2 株抗體滴度都較高，對(duì)產(chǎn)蛋前種鵝和蛋鴨都有較好的保護(hù)力[9]。石永勝等[10]評(píng)價(jià)重組AIV 滅活疫苗雞胚源H5N1 Re-6 株、雞胚源H5N1 Re-6+Re-8 株、細(xì)胞源Re-6+Re-8 株及水禽專用H5N2 D7 株等4 個(gè)產(chǎn)品對(duì)番鴨的免疫效果，發(fā)現(xiàn)4 種疫苗免疫效果由高至低依次為雞胚源H5N1 Re-6+Re-8 株、細(xì)胞源Re-6+Re-8 株、H5N2 D7 株、雞胚源H5N1 Re-6 株。另外，不同劑量AIV 疫苗免疫肉鴨的效果分析[11]表明，加大免疫劑量并不能使麻鴨AIV 抗體效價(jià)增加，嚴(yán)格按照生產(chǎn)廠家的說明使用劑量足量接種即可達(dá)到免疫效果要求。我國(guó)強(qiáng)制免疫的亞型主要是H5N6、H7N9、H5N1。但各亞型也會(huì)隨著時(shí)間推移發(fā)生進(jìn)化，比如2017 年農(nóng)業(yè)部決定全國(guó)統(tǒng)一用重組AIV二價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-8+H7N9 H7-Re1 株）替代H5 二價(jià)或三價(jià)滅活疫苗[12]，2018 年又決定全國(guó)統(tǒng)一使用重組AIV 三價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-11+Re-12 株、H7N9 Re-2 株）[13]。

本研究采用重組AIV（H5N1 Re-11+Re-12 株、H7N9 Re-2 株）三價(jià)滅活疫苗進(jìn)行了麻鴨與番鴨免疫試驗(yàn)，對(duì)免疫麻鴨和番鴨的抗體水平進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，旨在為該疫苗的進(jìn)一步推廣應(yīng)用以及水禽AI 免疫程序的制定提供數(shù)據(jù)支撐與理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)水禽

莆田麻鴨、番鴨各120 羽，在選定的養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)按常規(guī)方法飼養(yǎng)至出欄。

1.2 試驗(yàn)疫苗

重組AIV（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-11+Re-12 株、H7N9 Re-2 株），由莆田 市仙游縣動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心提供，批號(hào)為190084900，購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司。

1.3 檢測(cè)試劑

AIV 血凝抑制（HI）試驗(yàn)抗原H5 亞型（Re-11、Re-12 株）、H7 亞型（Re-2 株）以及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清，由哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司提供。

2 方法

2.1 麻鴨免疫試驗(yàn)

選取120 羽21 日齡的莆田麻鴨（AIV 母源抗體均衰減至4log2 以下），隨機(jī)均分成3 組（一免組、二免組、對(duì)照組）。將重組AIV（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-11+Re-12 株、H7N9 Re-2 株）參照國(guó)家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫指導(dǎo)意見（2022—2025年）以及福建省蛋鴨疫苗免疫程序[14-15]開展免疫。一免組于21 日齡免疫1 次，劑量為1.0 mL/羽，采用頸部皮下免疫注射；二免組分別于21、35 日齡各免疫1 次，劑量均為1.0 mL/羽，頸部皮下注射；對(duì)照組麻鴨不免疫。

2.2 番鴨免疫試驗(yàn)

120 羽孵化至21 日齡的莆田番鴨（AIV 母源抗體均衰減至4log2 以下），隨機(jī)均分成3 組（一免組、二免組、對(duì)照組）。參照國(guó)家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫指導(dǎo)意見（2022—2025 年）以及福建省蛋鴨疫苗免疫程序[14-15]，將重組AIV（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-11+Re-12 株、H7N9 Re-2 株）按推薦劑量進(jìn)行免疫接種，一免組于21 日齡免疫1 次，劑量為0.5 mL/羽，頸部皮下注射；二免組分別于21、35 日齡各免疫1 次，劑量分別為0.5、1.0 mL/羽，頸部皮下注射；對(duì)照組番鴨不免疫。

2.3 抗體檢測(cè)

試驗(yàn)水禽（麻鴨、番鴨）于21 日齡接種重組AIV 疫苗前分別翅靜脈采血2.0 mL/羽，接種疫苗后分別于35、49、63 日齡采集血樣。按照常規(guī)方法分離血清，用于統(tǒng)一檢測(cè)H5 和H7 亞型AIV HI抗體滴度。

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936—2003）中HI 試驗(yàn)方法，對(duì)同一份血清樣品檢測(cè)H5N1 Re-11、Re-12 株和H7N9 Re-2株HI 抗體滴度。按照國(guó)家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫計(jì)劃要求，待檢樣品血清HI 抗體滴度≥4.00log2 判定為抗體合格，合格率（抗體合格的樣品數(shù)占同組樣品總數(shù)的比率）≥70%為群體免疫合格。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 軟件進(jìn)行整理，應(yīng)用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 麻鴨免疫效力試驗(yàn)

3.1.1 重組AIV 三價(jià)滅活疫苗HI 抗體效價(jià)檢測(cè)疫苗免疫后，麻鴨血清中H5N1 Re-11、Re-12 株和H7N9 Re-2 株HI 抗體滴度消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)分別見圖1～3。一免組、二免組麻鴨在35、49、63 日齡，3 種抗體平均水平總體均呈上升趨勢(shì)，且二免組各日齡抗體水平均高于一免組。一免組麻鴨在35、49、63 日齡產(chǎn)生的H5N1（Re-11、Re-12 株）和H7N9 Re-2 株HI 抗體效價(jià)均低于5.70log2，二免組麻鴨針對(duì)三種抗原的抗體滴度均大于6.00log2。一免組、二免組麻鴨在35 日齡3 種抗體滴度均分別達(dá)到5.00log2、6.00log2 以上；二免組麻鴨在49、63 日齡3 種抗體滴度均大于7.00log2；對(duì)照組麻鴨血清中3 種抗體滴度均低于保護(hù)臨界值（4.00log2）。

3.1.2 抗體平均合格率 重組AIV 三價(jià)滅活疫苗免疫后，麻鴨抗體平均合格率檢測(cè)結(jié)果（圖4～6）顯示：一免、二免組麻鴨在35、49、63 日齡3 種抗體平均合格率均呈上升趨勢(shì)，均超過農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求的最低標(biāo)準(zhǔn)（70%），且二免組麻鴨各日齡抗體平均合格率均高于一免組；一免組麻鴨在35、49、63 日齡產(chǎn)生的3 種抗體平均合格率為73%～89%，二免組均大于86%，對(duì)照組則均低于10%。

3.2 番鴨免疫效力試驗(yàn)

3.2.1 重組AIV 三價(jià)滅活疫苗HI 抗體效價(jià)檢測(cè) 疫苗免疫接種后，一免組番鴨在35、49、63 日齡3 種抗體平均滴度均高于5.50log2，在21～49 日齡之間均呈上升趨勢(shì)，63 日齡后開始下降。二免組番鴨在35、49、63 日齡3 種抗體滴度均高于一免組，63 日齡時(shí)抗體水平仍保持在7.00log2 以上。對(duì)照組3 種抗體滴度均呈下降趨勢(shì)，且均低于4.00log2。具體結(jié)果分別見表1～3。

3.2.2 抗體平均合格率 一免組、二免組番鴨在35、49、63 日齡時(shí)3 種抗體平均合格率均呈上升趨勢(shì)；對(duì)照組番鴨抗體平均合格率在21 日齡僅為20%～60%，在35～63 日齡均降至0，具體結(jié)果分別見表1～3。

表1 番鴨H5N1 Re-11 株免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

4 討論

H5 與H7 亞型AIV 的自然宿主依舊以禽類為主，而水禽在AIV 傳播中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[16]。在我國(guó)許多地區(qū)，存在水禽與雞戶外混養(yǎng)或水禽與雞同場(chǎng)分隔飼養(yǎng)的現(xiàn)象[17]。因此要預(yù)防和消滅AI，控制水禽AI 是非常重要的一環(huán)。我國(guó)應(yīng)用最廣泛的AIV 疫苗為全病毒滅活疫苗，其優(yōu)點(diǎn)在于安全性好，抗原組分齊全，免疫原性好，可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高抗體效價(jià)，具有保護(hù)周期長(zhǎng)等特點(diǎn)[18]。免疫抗體水平監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性、可靠性、代表性等對(duì)高致病性AI（HPAI）防控起著非常關(guān)鍵的作用。本次水禽臨床試驗(yàn)表明，重組AIV（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗對(duì)麻鴨、番鴨均具有良好的免疫效果，可以滿足臨床生產(chǎn)需要，符合國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

表2 番鴨H5N1 Re-12 株免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

表3 番鴨H7N9 Re-2 株免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

目前在我國(guó)，特別是在商品化禽類養(yǎng)殖密度高的地區(qū)，針對(duì)HPAI 的非疫苗接種控制措施成本非常高。AIV 油乳劑滅活疫苗可用于鴨群二次免疫加強(qiáng)接種，會(huì)產(chǎn)生更高更持久的免疫抗體，以防止在秋冬季高發(fā)季節(jié)暴發(fā)AI 疫情。鴨群HPAI 免疫一般需要2 次接種才能得到較高的免疫抗體水平，種鴨產(chǎn)生的免疫抗體可通過卵黃傳遞給雛鴨，起到天然被動(dòng)免疫作用，保護(hù)雛鴨免受AIV 侵襲。因此水禽AIV 疫苗免疫時(shí)機(jī)、劑量選擇顯得尤為重要。研究[19,20]表明，重組AIV（H5N1 Re-11+Re-12 株、H7N9 Re-2 株）三價(jià)滅活疫苗對(duì)雞、鴨具有良好免疫效果，大部分家禽機(jī)體內(nèi)能同時(shí)產(chǎn)生H5、H7 免疫抗體。本次麻鴨臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，二免劑量達(dá)到1.0 mL 的免疫效果更好。試驗(yàn)番鴨免疫重組AIV 三價(jià)滅活疫苗后，免疫番鴨在35 日齡抗體合格率就達(dá)到90%，超過了國(guó)家強(qiáng)制免疫的群體合格率標(biāo)準(zhǔn)（70%）。試驗(yàn)表明，該疫苗能夠刺激番鴨產(chǎn)生有效免疫保護(hù)抗體，適用于番鴨免疫預(yù)防。一免組番鴨的平均免疫抗體滴度呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，說明一次免疫的抗體持續(xù)時(shí)間較短。相比而言，二免組番鴨免疫抗體持續(xù)上升，3 種抗體平均免疫滴度均高于一免組，同時(shí)二次免疫的抗體持續(xù)時(shí)間優(yōu)于一免組。

相對(duì)于養(yǎng)殖陸生禽，水禽H5N1（Re-11、Re-12 株）、H7N9（Re-2 株）產(chǎn)生的抗體滴度相對(duì)低一些，因此臨床上對(duì)蛋鴨免疫AIV 疫苗時(shí)建議適當(dāng)增加免疫劑量，推薦一免與二免的免疫總量達(dá)到1.5～2.0 mL。我國(guó)水禽飼養(yǎng)量大，飼養(yǎng)水禽與候鳥經(jīng)常共享同一水系，商品鴨感染野鳥源AIV的概率較高，因此除了進(jìn)行科學(xué)有效的疫苗免疫外，還應(yīng)重視推行生物安全飼養(yǎng)模式，真正從防控水禽AI 的傳染源、傳播途徑與易感宿主等3 個(gè)方面有計(jì)劃分步驟著手開展HPAI的監(jiān)測(cè)與免疫預(yù)防工作。

本研究分別選擇21 日齡麻鴨和番鴨各120羽，分組進(jìn)行了重組AIV（H5N1 Re-11+Re-12 株、H7N9 Re-2 株）三價(jià)滅活疫苗免疫試驗(yàn)，對(duì)各免疫組與對(duì)照組麻鴨、番鴨在不同日齡進(jìn)行HI 平均抗體水平檢測(cè)。研究表明，兩次免疫對(duì)于提高AIV（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗的免疫效果，彌補(bǔ)免疫空白期，提升AIV 特異性免疫抗體，盡早發(fā)揮臨床保護(hù)作用具有重要意義。