陳宏博，張?zhí)m濤，袁俊霞，黨 磊，印 紅，鄒樂洋，徐侃彥

（1. 航天神舟生物科技集團(tuán)有限公司； 2. 中國航天科技集團(tuán)有限公司 空間生物工程研究中心；3. 北京市空間生物工程技術(shù)研究中心：北京 100086； 4. 北京空間飛行器總體設(shè)計(jì)部，北京 100094）

0 引言

探索和尋找地外生命一直是宇宙生物學(xué)的主要科學(xué)目標(biāo)之一。在深空探測任務(wù)中，避免造成對目標(biāo)星體的“前向污染”是行星保護(hù)工作任務(wù)的重要目標(biāo)。在深空探測器研制過程中，通過對探測器硬件進(jìn)行清潔、滅菌以及二次污染防護(hù)等微生物控制措施可以保障探測器的生物負(fù)載符合行星保護(hù)要求?！昂１I號”火星探測器采取了美國深空探測任務(wù)以來最嚴(yán)苛的微生物控制措施，組裝完成后在(111.7±1.7) ℃的高溫條件下進(jìn)行了23～30 h 的整器干熱滅菌。然而，隨著深空探測任務(wù)的復(fù)雜性增加，對現(xiàn)代探測器進(jìn)行系統(tǒng)級干熱滅菌已不適用，因此，在研制過程中持續(xù)對探測器硬件中可能存在的生物負(fù)載數(shù)量和種類進(jìn)行檢測顯得更加重要。產(chǎn)芽孢微生物是行星保護(hù)任務(wù)中重點(diǎn)關(guān)注的微生物類群，探測器硬件負(fù)載的芽孢數(shù)量也被用于表征探測器的微生物污染程度。

自“海盜號”任務(wù)起，NASA 逐漸建立了一套標(biāo)準(zhǔn)操作文件（NASA-HDBK-6022）用于指導(dǎo)航天器硬件表面的微生物采樣與檢測。其中的具體操作程序是：使用采樣拭子或采樣擦巾從航天器硬件表面采集微生物樣本，經(jīng)過洗脫后將樣品進(jìn)行熱激處理（80 ℃，15 min）以殺死營養(yǎng)體細(xì)胞，然后利用TSA（胰蛋白胨大豆瓊脂）培養(yǎng)基對微生物進(jìn)行培養(yǎng)和計(jì)數(shù)。大量的研究表明：硬件材料表面特征和拭子選型是影響微生物采樣和檢測效率的兩種主要因素。在早期任務(wù)中，NASA 采用的拭子主要為棉拭子，而利用棉拭子采集痕量微生物時(shí)，大部分樣品被捕獲在拭子頭部的纖維基質(zhì)中而不易釋放，樣品回收率降低。近年來，棉拭子已逐漸被植絨拭子取代。植絨拭子通過靜電電荷將尼龍纖維垂直固定，使拭子采集區(qū)域內(nèi)部無吸收孔，樣品不會分散滯留在纖維中，有利于更高效的洗脫。植絨拭子在微生物采集的準(zhǔn)確性、精密度、檢測限等方面的優(yōu)勢已得到驗(yàn)證。ESA 在深空探測任務(wù)中，針對探測器硬件負(fù)載的微生物數(shù)量也進(jìn)行了系列檢測工作，以植絨拭子為對象，制定了標(biāo)準(zhǔn)操作文件ECSS-Q-ST-70-55C。

我國近年也在航天器研制任務(wù)中開展了一系列微生物采集與檢測工作，并建立了相應(yīng)的試驗(yàn)體系。本文結(jié)合我國深空探測器硬件表面微生物采樣工作的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)與需求，以拭子的采集效率為重點(diǎn)關(guān)注指標(biāo)，對比了兩種植絨拭子（一種歐洲產(chǎn)，一種國產(chǎn)）對不同材料表面、不同產(chǎn)芽孢菌的采集效率。研究結(jié)果將為我國開展深空探測器硬件表面微生物檢測提供數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 拭子選型

本文共選用兩種植絨拭子進(jìn)行測試（見圖1）：一種為意大利Copan 公司產(chǎn)的FLOQSwabs Copan 552C 尼龍植絨拭子，是ESA 在探測器硬件表面微生物采樣中常用的植絨拭子；另一種為型號CY-93050T 的國產(chǎn)植絨拭子。每個(gè)植絨拭子都是無菌單獨(dú)包裝，且預(yù)置斷裂點(diǎn)以能夠輕松折斷從而直接進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)處理。對兩種拭子的掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，拭子上的單纖維從拭子頭突出，大小均勻；FLOQSwabs Copan 552C 植絨拭子的尼龍纖維平均直徑(19.01±0.25) μm（見圖1(a)），CY-93050T 植絨拭子頭結(jié)構(gòu)更緊湊，尼龍纖維分布更規(guī)整，平均直徑(17.89±0.44) μm（見圖1(b)）。掃描電鏡的型號為FEI Quanta250 環(huán)境掃描電子顯微鏡。

圖1 兩種植絨拭子的掃描電鏡圖像Fig. 1 SEM images of two kinds of nylon flocking swabs

1.2 受試材料

本文共針對兩種不同表面光潔度的硬件材料（見圖2）進(jìn)行測試，分別是表面光潔度高的鋁合金5A06 和表面光潔度較差的阻燃混紡斜紋布（規(guī)格205 g/m）。

圖2 鋁合金5A06 和阻燃混紡斜紋布的掃描電鏡圖像Fig. 2 SEM images of 5A06 aluminum alloy and flame retardant blended twill

試驗(yàn)前，將受試材料剪裁為表面積為50 mm×50 mm 的測試片，分別用含有1%非離子去污劑Triton X-100 的熱水、蒸餾水對受試材料進(jìn)行表面清洗，采用99.5%試劑純級的異丙醇再次沖洗并瀝干，用鋁箔紙包好，175 ℃干熱滅菌80 min 后備用。

1.3 菌種選擇

本文選擇2 種產(chǎn)芽孢菌的芽孢態(tài)休眠體（見圖3）進(jìn)行測試，即萎縮芽孢桿菌ATCC 9372和解淀粉芽孢桿菌B30175。其中：ATCC 9372 是常用的標(biāo)準(zhǔn)測試菌株，同時(shí)也是我國AIT 廠房環(huán)境中常見的微生物類群；B30175 是從我國AIT 環(huán)境中分離的優(yōu)勢微生物菌株。試驗(yàn)過程中，受試芽孢的出發(fā)菌液濃度控制在4×10CFU/m。

圖3 兩種芽孢桿菌的圖像Fig. 3 Images of the two kinds of bacillus

1.4 試驗(yàn)方法

所有的微生物采樣操作均在生物安全柜中進(jìn)行。將100 μL 菌液（約100 CFU）均勻滴在材料片的表面區(qū)域，在生物安全柜中晾干。取出無菌植絨拭子，將拭子的頭部在無菌蒸餾水中潤濕后，以“S”型在材料表面進(jìn)行微生物采樣，完成后，將拭子頭折斷放入無菌蒸餾水中。

用超聲波清洗儀對拭子超聲洗脫2 min 后用無菌水梯度稀釋洗脫液，取0.5 mL 稀釋洗脫液加到培養(yǎng)皿中，向洗脫液中加入約20 mL 熔化的R2A瓊脂培養(yǎng)基，室溫下放置至培養(yǎng)基凝固，32 ℃下倒置培養(yǎng)，于24 h、48 h 和72 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

試驗(yàn)過程中，分別設(shè)置陽性與陰性對照組。陽性對照組不進(jìn)行采樣操作，將等體積的出發(fā)芽孢菌液直接進(jìn)行培養(yǎng)，計(jì)算出發(fā)菌落數(shù)量；陰性對照組是將拭子在生物安全柜的空氣中揮動2～4 s 后進(jìn)行洗脫、培養(yǎng)與計(jì)數(shù)。

本研究所有的試驗(yàn)組均進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，每次試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行樣品。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)試驗(yàn)組中采集效率=(試驗(yàn)組微生物菌落數(shù)/對照組菌落數(shù)值)×100%，菌落數(shù)使用培養(yǎng)72 h后的累計(jì)菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)算。平均采集效率以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±）表示。使用SPSS21.0 軟件對每個(gè)試驗(yàn)組的采集效率進(jìn)行獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)，進(jìn)一步采用多重方差分析評估拭子、受試材料和菌種對微生物采集效率的影響。兩種拭子的采集效率差異水平用值描述：若＜0.001，表示差異達(dá)到極顯著水平；若＜0.05，表示差異達(dá)到顯著水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

將兩種產(chǎn)芽孢菌的菌液分別分散在受試材料表面，并按照1.4 節(jié)所述方法分別用Copan 552C 植絨拭子和CY-93050T 植絨拭子進(jìn)行微生物采集。經(jīng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)分析后的采集效率結(jié)果如圖4所示：Copan 552C 植絨拭子的采集效率為13.43%～42.78%，平均采集效率為29.43%±8.2%；CY-93050T植絨拭子的采集效率介于17.87%～63.78%，平均采集效率為45.38%±13.46%。CY-93050T 植絨拭子的采集效率高于Copan 552C 植絨拭子，顯著性分析結(jié)果顯示：除斜紋布+組外，其余處理組內(nèi)Copan 552C 植絨拭子與CY-93050T植絨拭子的微生物采集效率差異均達(dá)到顯著水平。

圖4 不同拭子的微生物采集效率比較Fig. 4 Comparison of the collection efficiency among different swabs

2.1 拭子種類對采集效率的影響

拭子是影響微生物采集效率的主要因素之一。尼龍纖維材料的拭子可促進(jìn)微粒和微生物的釋放，從而顯著提高微生物采集效率，展現(xiàn)出比棉拭子更優(yōu)良的性能。NASA 標(biāo)準(zhǔn)程序中棉拭子的采集效率僅為13.2%；Rose 等利用棉拭子對芽孢桿菌的芽孢采集效率可達(dá)到 41.7%，但由于棉拭子有一定的有機(jī)性質(zhì)，可能會引起探測器硬件表面出現(xiàn)殘留問題；Probst 等使用兩種植絨拭子從不銹鋼試樣中采集萎縮芽孢桿菌芽孢，采集效率分別達(dá)到了達(dá)到45.4%和49.0%。本文采用的CY-93050T 植絨拭子對鋁合金表面的采集效率可達(dá)54.90%±6.93%，高于幾種國外拭子的采集效率，在后續(xù)工作中可作為我國開展相關(guān)探測器硬件表面生物采集工作的備選拭子。

2.2 受試材料對采集效率的影響

兩種受試材料對微生物采集效率的影響分析結(jié)果如表1 所示，可見拭子對對鋁合金表面的平均采集效率高于斜紋布表面的。造成兩種受試材料表面采集效率差異的重要原因是鋁合金與斜紋布不同的表面光潔度。鋁合金具有較高的表面硬度和光潔度，在工程制造中通過拋光、表面涂層等方法可以大大降低微生物黏附，采集效率較高。相比之下，斜紋布表面的嵌套結(jié)構(gòu)、多孔結(jié)構(gòu)較多，進(jìn)行微生物采集難度較大，采集效率也會偏低。Buttner等研究也證明對產(chǎn)芽孢微生物的采集效率與材料表面的光潔度相關(guān)：在光滑的碳纖維增強(qiáng)塑料表面采樣時(shí)，采集效率可達(dá)到62.0%；但當(dāng)在粗糙表面采樣時(shí)，采集效率下降到26.6%；而在表面更粗糙的Vectran 纖維上采樣時(shí)，采集效率僅能達(dá)到5.9%～8.8%。針對這種表面粗糙的材料，在后續(xù)采樣過程設(shè)計(jì)中應(yīng)加強(qiáng)對拭子材質(zhì)和拭子頭尺寸形狀的關(guān)注，選擇在粗糙材料表面微生物采集效率較高的拭子。

表1 拭子對兩種材料的采集效率Table 1 The collection efficiency of flocking swabs on two kinds of materials

2.3 菌種對采集效率的影響

進(jìn)一步分析兩種不同芽孢桿菌對采集效率的影響，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表2 所示：拭子對B30175 的平均采集效率高于ATCC9372 的。由此可見，菌種也是影響受試材料表面微生物采集效率的重要因素。Dalmaso 等用拭子分別對接種了芽孢桿菌、念珠菌和曲霉菌的不銹鋼片進(jìn)行采樣，發(fā)現(xiàn)不同菌種對應(yīng)的采集效率范圍介于42%～66%，有明顯差異，分析其原因，是因?yàn)槲⑸锞戟?dú)特的理化特征，微生物在不同材料表面黏附的行為特征存在差別，如一些能夠分泌胞外物質(zhì)的微生物更易黏附在材料表面，這就加大了拭子采集的難度，也造成了不同菌種下采集效率的差異。

表2 拭子對兩種芽孢桿菌的采集效率Table 2 The collection efficiecy of flocking swabs for two kinds of Bacillus

2.4 影響微生物采集效率的因素交互作用分析

利用多因素方差分析評估拭子、受試材料和微生物菌種對采集效率的影響，結(jié)果如表3 所示，其中值為方差的統(tǒng)計(jì)量?？梢姡菏米印⑹茉嚥牧虾臀⑸锞N作為主效應(yīng)因子對微生物采集效率都有顯著性影響；此外，結(jié)果顯示受試材料與菌種間存在交互作用，兩者的交互效應(yīng)對微生物采集效率存在顯著影響。采樣拭子與受試材料之間、采樣拭子與微生物菌種之間以及采樣拭子、受試材料與微生物菌種三者之間則未檢測到存在交互作用。實(shí)際采樣過程中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注優(yōu)勢微生物類群的采集效率，選擇適用于我國探測器常用材料的采樣拭子，進(jìn)而保持試驗(yàn)體系、操作的穩(wěn)定性，降低系統(tǒng)誤差，確保對環(huán)境微生物追蹤數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可比較性。

表3 影響微生物采集效率的因素交互作用分析（樣本數(shù)n=3）Table 3 Interaction analysis of factors affecting microbial collection efficiency (n=3)

3 結(jié)束語

隨著我國深空探測任務(wù)的推進(jìn)，國外行星保護(hù)任務(wù)的既有技術(shù)體系與標(biāo)準(zhǔn)已不能完全適用于我國。在行星保護(hù)工作中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)——微生物采集與檢測中，未來應(yīng)加大對我國自產(chǎn)拭子的選型與測試：除了關(guān)注拭子的回收效率、洗脫效率等基礎(chǔ)參數(shù)外，還應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注拭子對航天器負(fù)載的微量/痕量微生物的采集性能。同時(shí)，應(yīng)以我國現(xiàn)有探測器研制任務(wù)為基礎(chǔ)，分析探測器的材料選型、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、研制流程等特征，逐步建立和完善適用于我國探測器常用材料與結(jié)構(gòu)的微生物采樣與檢測技術(shù)體系、規(guī)范與標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)我國在探測器研制過程中的生物負(fù)載量可檢測、可追溯、可控制的任務(wù)目標(biāo)。