lncRNA GHET1表達(dá)水平對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803增殖 遷移和侵襲的影響及其機(jī)制研究

唐沐希，賴銘裕，程若溪

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]，全球每年新發(fā)胃癌患者約100萬例[2]。早期胃癌的5年生存率可達(dá)95%以上，但大多數(shù)患者在診斷時(shí)已是晚期，錯(cuò)過了最佳手術(shù)窗口期[3]。探究胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制對(duì)胃癌的早期診斷及治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding ribonucleic acid,lncRNA)是非蛋白編碼的RNA，其長度超過200個(gè)核苷酸[4]。lncRNA在癌癥中可以作為腫瘤抑制因子或癌基因發(fā)揮作用，可調(diào)節(jié)腫瘤生長、代謝和轉(zhuǎn)移等癌癥特征[5]。胃癌高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本1(gastric carcinoma high expressed transcript 1，GHET1)是近年來新發(fā)現(xiàn)的致癌lncRNA，在多種惡性腫瘤中高度表達(dá)[6]。但lncRNA GHET1對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移等生物學(xué)行為的影響及分子機(jī)制尚不十分明確。miR-105是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種microRNA(miRNA)，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-105在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)[7]。但lncRNA GHET1是否通過下調(diào)miR-105的表達(dá)影響胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲尚不明確。本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)和沉默lncRNA GHET1的胃癌細(xì)胞株，旨在探究lncRNA GHET1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人胃癌細(xì)胞株MGC-803購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，特級(jí)胎牛血清購自BI公司，胰酶、青霉素-鏈霉素溶液購自新賽美公司。lncRNA GHET1過表達(dá)慢病毒、lncRNA GHET1過表達(dá)陰性對(duì)照慢病毒、lncRNA GHET1干擾慢病毒、lncRNA GHET1干擾陰性對(duì)照慢病毒均購自上海吉?jiǎng)P公司。總RNA提取試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(RR820A)均購自Takara公司。CCK-8試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。T25培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔板、24孔板、96孔板均購自美國康寧公司。熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 于50 ml離心管中加入5 ml胎牛血清、0.5 ml青霉素-鏈霉素溶液，其余部分用RPMI-1640培養(yǎng)基補(bǔ)足，輕柔混勻配制為完全培養(yǎng)基。T25培養(yǎng)瓶中加入約3.5 ml完全培養(yǎng)基及細(xì)胞懸液，后將培養(yǎng)瓶放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，注意觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，及時(shí)傳代、換液。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染 取狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長期的第2代MGC-803細(xì)胞，按5×104cells/ml接種于6孔板中，24 h后待細(xì)胞完全貼壁。設(shè)置lncRNA GHET1過表達(dá)組(過表達(dá)組)、lncRNA GHET1過表達(dá)陰性對(duì)照組(過表達(dá)對(duì)照組)、lncRNA GHET1沉默組(沉默組)、lncRNA GHET1沉默陰性對(duì)照組(沉默對(duì)照組)，每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。吸出孔板中的舊培養(yǎng)基。嚴(yán)格按照慢病毒試劑轉(zhuǎn)染說明書，根據(jù)MGC-803細(xì)胞MOI值計(jì)算出各孔需加入慢病毒感染試劑量。按照分組加入對(duì)應(yīng)的慢病毒感染試劑和感染增強(qiáng)試劑。轉(zhuǎn)染12 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72 h后在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功(轉(zhuǎn)染效率>90%)后，將各組細(xì)胞在含2 μg/ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，之后繼續(xù)用含1 μg/ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)lncRNA GHET1和miR-105的相對(duì)表達(dá)量 應(yīng)用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和質(zhì)量合格后，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒對(duì)GHET1、miR-105進(jìn)行檢測(cè)。引物由上海生工公司合成，引物序列見表1。分別以GAPDH、U6作為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算lncRNA GHET1、miR-105的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

表1 引物序列

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力 收集各組細(xì)胞，分別以5×103cells/孔接種至96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別于種板后22 h、46 h、70 h、94 h向每孔加入10 μl CCK-8試劑，避光孵育2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長處的OD值。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力 收集各組細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以5×104cells/孔接種于上室，下室加入700 μl完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用棉簽擦去小室內(nèi)未穿膜細(xì)胞，小室采用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下拍照并用image J軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞。侵襲實(shí)驗(yàn)需提前在上室中加入用無血清培養(yǎng)基稀釋的Matrigel膠并于培養(yǎng)箱放置3 h，其余操作步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1過表達(dá)和沉默lncRNA GHET1的MGC-803細(xì)胞模型的構(gòu)建結(jié)果 熒光顯微鏡下觀察見各組細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)染率均高于90%。見圖1。

2.2各組lncRNA GHET1表達(dá)水平比較 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)組lncRNA GHET1的相對(duì)表達(dá)量顯著高于過表達(dá)對(duì)照組(P<0.05)。沉默組lncRNA GHET1相對(duì)表達(dá)量顯著低于沉默對(duì)照組(P<0.05)。見圖2。結(jié)合慢病毒轉(zhuǎn)染效率結(jié)果，提示實(shí)驗(yàn)成功建立了過表達(dá)和沉默lncRNA GHET1的MGC-803細(xì)胞模型。

2.3各組細(xì)胞增殖情況比較 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)組OD值增長較過表達(dá)對(duì)照組快速，提示細(xì)胞增殖更快。沉默組OD值增長較沉默對(duì)照組慢，提示細(xì)胞增殖更慢。見圖3。

注：綠色熒光提示轉(zhuǎn)染成功

圖2 各組lncRNA GHET1表達(dá)水平比較圖

圖3 各組不同時(shí)間點(diǎn)OD值情況圖

2.4各組細(xì)胞遷移及侵襲能力比較 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)多于過表達(dá)對(duì)照組，而沉默組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)少于沉默對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2～3，圖4～5。

表2 過表達(dá)組和過表達(dá)對(duì)照組細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)比較

表3 沉默組和沉默對(duì)照組細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)比較

圖4 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(×10)

圖5 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(×10)

2.5各組miR-105表達(dá)水平比較 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)組miR-105表達(dá)水平低于過表達(dá)對(duì)照組；沉默組miR-105表達(dá)水平高于沉默對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組miR-105表達(dá)水平比較圖

3 討論

3.1胃癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因[8]，超過90%為腺癌，預(yù)后不佳，平均5年生存率不足20%。如果患者在腫瘤侵入胃肌層之前得到確診并接受治療，其5年生存率可達(dá)90%[9]。因此，胃癌分子機(jī)制研究對(duì)于胃癌的早期診斷和治療至關(guān)重要。在人類基因組轉(zhuǎn)錄的大量RNA中，蛋白質(zhì)編碼序列僅占總轉(zhuǎn)錄物的一小部分，其余的轉(zhuǎn)錄物是非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)，它們?nèi)狈幋a能力[10]。lncRNA是一組異質(zhì)的非蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本，長度超過200個(gè)核苷酸，可參與基因表達(dá)及多種生理、病理過程。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA通過充當(dāng)癌因子或抑癌因子，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著復(fù)雜而精確的調(diào)節(jié)作用，它們不僅可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移，還可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的代謝重編程[11]。據(jù)估計(jì)，人類體內(nèi)有超過60 000個(gè)lncRNA，而且所發(fā)現(xiàn)的lncRNA的數(shù)目還在不斷增加[12]。GHET1位于染色體7q36.1，最初被發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中高表達(dá)[13]。近年來，lncRNA GHET1也被發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌等其他腫瘤中呈高表達(dá)[14]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)lncRNA GHET1的MGC-803細(xì)胞株具有更強(qiáng)的增殖、遷移及侵襲能力；而沉默lncRNA GHET1后，MGC-803細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲能力下降，提示lncRNA GHET1具有促進(jìn)胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用。

3.2miRNA是長度為17～25個(gè)核苷酸的小型非編碼調(diào)控RNA，其通過識(shí)別mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)中的互補(bǔ)靶位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄后抑制基因表達(dá)[15]。miRNA與細(xì)胞內(nèi)幾乎所有信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)，并且它們的失調(diào)已被證明在癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中起重要作用[16]。miRNA調(diào)控環(huán)節(jié)幾乎涵蓋已知的所有腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)鍵步驟，包括參與調(diào)控細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)、細(xì)胞表面分子表達(dá)等[17]。miR-105是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA。Jin等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-105在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，而過表達(dá)miR-105可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，提示miR-105對(duì)胃癌具有抑制作用。近年來的研究表明，lncRNA可作為一種競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)與miRNA相互作用，參與靶基因的表達(dá)調(diào)控。此外，一些lncRNA還編碼某些促進(jìn)腫瘤發(fā)生的miRNA。這種lncRNA與miRNA相互作用而導(dǎo)致基因表達(dá)失調(diào)的現(xiàn)象在包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病中發(fā)生[19]。有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中存在由lncRNA/miRNA/mRNA相互作用形成的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，并在肝轉(zhuǎn)移、EMT、炎癥以及放化療抗性等方面發(fā)揮作用[20]。Shao等[21]也發(fā)現(xiàn)，lncRNA-線粒體RNA加工核糖核酸內(nèi)切酶RNA組份(RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease，RMRP)通過充當(dāng)miR-206海綿促進(jìn)癌變并被用作胃癌的新型生物標(biāo)志物。

3.3生物信息學(xué)分析表明，lncRNA GHET1能夠靶向miR-105而發(fā)揮作用。Xiao等[22]發(fā)現(xiàn)，lncRNA GHET1通過靶向miR-105調(diào)控急性髓系白血病的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，lncRNA GHET1過表達(dá)組中miR-105的表達(dá)水平顯著低于其陰性對(duì)照組，而lncRNA GHET1沉默組miR-105的表達(dá)水平顯著高于其陰性對(duì)照組，提示胃癌細(xì)胞中miR-105的表達(dá)水平可能與lncRNA GHET1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。本研究通過構(gòu)建慢病毒載體介導(dǎo)的lncRNA GHET1過表達(dá)和沉默的MGC-803細(xì)胞株，完善了此前研究中僅用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法敲低lncRNA GHET1表達(dá)進(jìn)行胃癌相關(guān)實(shí)驗(yàn)的缺陷，為進(jìn)一步研究lncRNA GHET1在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制提供了更為可靠的方法。但本研究僅通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法驗(yàn)證lncRNA GHET1和miR-105表達(dá)水平的相關(guān)性，仍需進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行更準(zhǔn)確的驗(yàn)證。

綜上所述，lncRNA GHET1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，其機(jī)制可能與下調(diào)miR-105的水平有關(guān)，為胃癌的早期診斷與治療提供了參考。