尚葛礎(chǔ)，王瀟永，高燕

本研究價(jià)值：

（1）目前糖尿病的發(fā)病率不斷增加，各類藥物對(duì)腎臟的影響亟須獲得更高程度的關(guān)注，然而他汀類藥物對(duì)腎臟的保護(hù)作用還未得到充分研究，尤其現(xiàn)在關(guān)于他汀類藥物是否引發(fā)新發(fā)糖尿病還存在一定爭議。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀鈣聯(lián)合二甲雙胍對(duì)2型糖尿?。═2DM）大鼠腎臟具有保護(hù)作用，可能與調(diào)控腎臟葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）mRNA及蛋白的表達(dá)有關(guān)。

（2）本研究通過研究不同劑量瑞舒伐他汀鈣聯(lián)合二甲雙胍對(duì)T2DM大鼠腎臟的組織學(xué)（HE染色、PAS染色、Masson染色）變化及GLUT4 mRNA、GLUT4蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)其可通過改善胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、腎臟纖維化、抑制細(xì)胞凋亡等作用保護(hù)腎臟，從蛋白與mRNA角度觀察劑量與腎臟病理性改變的關(guān)系，且保護(hù)作用與藥物劑量呈正相關(guān)。

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、老年人比例的增加及超重、肥胖等患病率的增加，我國2型糖尿病（T2DM）發(fā)病率顯著上升［1］。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和胰島素抵抗等是T2DM發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［2］。瑞舒伐他汀鈣是一種強(qiáng)效的降脂藥物，親水性優(yōu)于其他同類藥物，對(duì)肝臟損害較小。有研究表明，瑞舒伐他汀鈣對(duì)腎臟同樣具有保護(hù)作用，可降低炎性因子水平、改善血管內(nèi)皮功能、抗氧化及提高胰島素敏感性［3-4］。二甲雙胍是臨床治療T2DM的常見藥物，可通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），保護(hù)腎小管細(xì)胞免受炎癥、凋亡、活性氧（ROS）應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響，還具有抑制系膜細(xì)胞凋亡和腎小管細(xì)胞衰老的作用［5］。章超等［6］研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀聯(lián)合二甲雙胍能改善T2DM患者血糖、血脂水平，控制炎性反應(yīng)，緩解胰島素抵抗（insulin resistance，IR），具有重要的臨床價(jià)值。本研究觀察了瑞舒伐他汀鈣聯(lián)合二甲雙胍對(duì)鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的T2DM大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)學(xué)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）mRNA及蛋白表達(dá)的影響，以探討其在T2DM大鼠腎臟損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2021年7—10月選用清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司〔SCXK（魯）2019-0003〕，動(dòng)物合格證號(hào)：370726210100677087，飼養(yǎng)于中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六〇醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心〔SYXK（魯）2012-0043〕，將大鼠飼養(yǎng)于室溫21～25 ℃、空氣流通的環(huán)境中進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)由中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六〇醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過（20210123）。動(dòng)物飼料由北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司配制，主要營養(yǎng)成分：蛋白質(zhì)24.2%，碳水化合物42.1%，脂肪25.4%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 瑞舒伐他汀鈣（商品名：可定），阿斯利康藥業(yè)（中國）有限公司生產(chǎn)。二甲雙胍（商品名：格華止），中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)。中性樹膠、無水乙醇與二甲苯由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。乙二胺四乙酸（EDTA）（pH 8.0）抗原修復(fù)液、EDTA（pH 9.0）抗原修復(fù)液、檸檬酸（pH 6.0）抗原修復(fù)液、磷酸鹽緩沖液（PBS）、自發(fā)熒光淬滅劑、牛血清白蛋白、DAPI染色劑、一抗、熒光二抗、抗熒光淬滅封固劑均購自武漢谷歌生物科技有限公司。蘇木素-伊紅（HE）染色液、分化液、返藍(lán)液、RNA提取液及引物均由Servicebio廠家提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 糖尿病動(dòng)物模型建立、分組及喂藥

1.3.1.1 糖尿病動(dòng)物模型建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，建模大鼠給予高糖、高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)6周，采取腹腔一次性注射STZ（40 mg/kg）的方法建造模型，空腹8 h后采用尾靜脈穿刺法檢測大鼠基線血糖水平，若空腹血糖（FBG）>11.1 mmol/L，則提示成功建立STZ誘導(dǎo)的T2DM模型。

1.3.1.2 分組及喂藥 40只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（C組）、二甲雙胍組（M組）、瑞舒伐他汀鈣低劑量+二甲雙胍組（M+RL組）及瑞舒伐他汀鈣高劑量+二甲雙胍組（M+RH組）4組，每組10只。給予各組藥物灌胃：C組：10 mg·kg-1·d-10.9%氯化鈉溶液；M組：二甲雙胍（200 mg·kg-1·d-1）；M+RL組：二甲雙胍（200 mg·kg-1·d-1）混懸液+瑞舒伐他汀鈣（0.42 mg·kg-1·d-1）；M+RH組：二甲雙胍（200 mg·kg-1·d-1）混懸液+瑞舒伐他汀鈣（0.83 mg·kg-1·d-1）。干預(yù)6周，末次給藥后，次日大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（1 mg/300 g），切開腹腔并摘取腎臟，留取腎臟組織標(biāo)本送檢。

1.3.2 HE染色 HE染色步驟如下：（1）將腎臟組織進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)脫蠟至水；（2）蘇木素染色5 min后，使用蒸餾水沖洗；（3）伊紅染色1 min，再次蒸餾水浸泡沖洗；（4）脫水，并使用中性樹膠封固；（5）在光鏡下對(duì)腎臟組織切片進(jìn)行觀察和分析。

1.3.3 高碘酸-無色品紅（PAS）染色 PAS染色步驟如下：（1）將組織薄片常規(guī)脫蠟至水；（2）加入高碘酸染色10 min，蒸餾水沖洗；（3）用雪弗試劑孵育15 min，流水沖洗5 min，組織變?yōu)樯罘奂t色后蒸餾水沖洗；（4）蘇木素復(fù)染2 min，梯度乙醇脫水；（5）二甲苯透明，中性樹脂封固。各切片隨機(jī)挑選至少3個(gè)200倍視野并拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件測量區(qū)域紫紅色陽性面積百分比。

1.3.4 Masson染色 Masson染色步驟如下：（1）腎臟石蠟切片鉻酸鉀染色；（2）鐵蘇木素染核10 min，蒸餾水沖洗；（3）麗春紅酸性品紅染色10 min，冰醋酸水溶液短暫浸泡；（4）磷鉬酸染色5 min；（5）苯胺藍(lán)染色5 min，進(jìn)行分化與透明封固。使用Image-Pro Plus 6.0軟件檢測200倍視野區(qū)域藍(lán)色膠原纖維面積百分比。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA表達(dá)水平 取100 mg大鼠的腎臟組織，抽提RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)ΔΔCt法對(duì)大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA進(jìn)行基因定量。PCR擴(kuò)增引物序列見表1。

1.3.6 Western-blotting法檢測藥物對(duì)大鼠腎臟組織GLUT4蛋白表達(dá)的影響 將腎臟組織徹底勻漿并完全裂解，收集總蛋白溶液，按4∶1的比例加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴變性，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，通過Western-blotting法檢測腎臟組織中GLUT4蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 HE染色可見：C組大鼠腎臟組織無病理樣改變，腎小管排列緊密，腎小球未見明顯異常。M組大鼠腎小球萎縮，腎小管數(shù)量減少，腎臟組織內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤，伴有間質(zhì)水腫與出血，腎實(shí)質(zhì)可見褐色素沉著。M+RL組腎小球及腎間質(zhì)均有大量炎性細(xì)胞浸潤，腎小管輕度水腫，管腔內(nèi)可見嗜伊紅蛋白樣物質(zhì)，胞核固縮深染，腎小管間質(zhì)血管淤血。M+RH組腎小管擴(kuò)張，部分腎小球肥大，基膜增厚（圖1）。

圖1 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)變化（HE染色）Figure 1 Morphological changes of kidney tissues stained with H&E in control rats and streptozotocin-induced T2DM rats

2.2 PAS染色結(jié)果 PAS染色可見：C組大鼠腎小球均勻光滑，腎小管基膜及系膜基質(zhì)無明顯病理性改變，腎小球血管袢薄，未見腎小球肥大及腎小管管型。M組大鼠腎組織損傷明顯，腎小球基底膜明顯增厚，系膜細(xì)胞及基質(zhì)增多，部分腎小管出現(xiàn)空泡樣病變，管腔擴(kuò)張，可見腎間質(zhì)水腫。M+RL組可見腎小管毛細(xì)血管壁增厚，可見毛細(xì)血管袢塌陷，腎小管基底膜增厚，可見腎小管管型。M+RH組腎小球基底膜較C組增厚，腎小管管腔擴(kuò)張，系膜細(xì)胞明顯增多（圖2）。

圖2 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)變化（PAS染色）Figure 2 Morphological changes of kidney tissues stained with periodicacid schiff in control rats and streptozotocin-induced T2DM rats

C組PAS染色陽性面積百分比為（1.67±0.41）%，M組為（5.32±1.72）%，M+RL組為（4.91±0.83）%，M+RH組 為（4.55±0.27）%， 各 組 PAS染 色 陽 性面積百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.509，P=0.007）； 其 中M組、M+RL組、M+RH組PAS染色陽性面積百分比均高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.3 Masson染色 Masson染色結(jié)果顯示：C組腎小球基底膜、系膜基質(zhì)均正常，無壞死性病變，未觀測到間質(zhì)纖維化。M組腎小管嚴(yán)重萎縮，腎小球內(nèi)免疫復(fù)合物沉積，出現(xiàn)大量藍(lán)色膠原纖維、纖維素樣壞死及血管血栓。M+RL組有大量腎小球基底膜空泡，出現(xiàn)間質(zhì)纖維化，腎小球內(nèi)可檢測到大量藍(lán)色膠原纖維。M+RH組腎小球存在少量特殊沉積物，腎小管輕度萎縮，間質(zhì)有較多藍(lán)色膠原纖維（圖3）。

圖3 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)變化（Masson染色）Figure 3 Morphological changes of kidney tissues stained with Masson's trichrome in control rats and streptozotocin-induced T2DM rats

C組藍(lán)色膠原纖維面積百分比為（2.33±0.82）%，M組為（21.26±1.55）%，M+RL組為（14.08±6.40）%，M+RH組為（9.86±2.19）%，各組藍(lán)色膠原纖維面積百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.423，P=0.001）；其中M組、M+RL組、M+RH組藍(lán)色膠原纖維面積百分比均高于C組，M+RL組、M+RH組藍(lán)色膠原纖維面積百分比均低于M組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 4組大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA表達(dá)水平比較 C組大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA表達(dá)水平為（1.06±0.39），M 組 為（0.27±0.03），M+RL組 為（0.62±0.21），M+RH組為（1.02±0.34），4組大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.526，P<0.001）；其中M組、M+RL組大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA表達(dá)水平均低于C組，M+RL組、M+RH組大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA表達(dá)水平均高于M組，M+RH組大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA表達(dá)水平高于M+RL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.5 4組大鼠腎臟組織GLUT4蛋白表達(dá)水平比較 C組大鼠腎臟組織GLUT4蛋白表達(dá)水平為（0.80±0.10），M 組 為（0.23±0.04），M+RL組 為（0.41±0.10），M+RH組為（0.53±0.04），4組大鼠腎臟組織GLUT4蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=50.764，P<0.001）；其中M組、M+RL組、M+RH組大鼠腎臟組織GLUT4蛋白表達(dá)水平均低于C組，M+RL組、M+RH組大鼠腎臟組織GLUT4蛋白表達(dá)水平高于M組，M+RH組大鼠腎臟組織GLUT4蛋白表達(dá)水平高于M+RL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖4）。

圖4 各組大鼠GLUT4蛋白相對(duì)表達(dá)量Figure 4 The relative expression levels of glucose transporter 4 protein in control rats and streptozotocin-induced T2DM rats

3 討論

T2DM是一種以血糖水平升高為主要特征的代謝類疾病，近年來，糖尿病患病率不斷上升，死亡率也居高不下［7］。受胰島素分泌不足、胰島功能缺陷等影響，糖尿病有發(fā)展為慢性腎臟疾病（CKD）的風(fēng)險(xiǎn)，而CKD是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的重要原因之一［8］。

他汀類藥物具有抗炎作用，可減少炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子的數(shù)量，降低C反應(yīng)蛋白水平［9］。瑞舒伐他汀通過甲羥戊酸-類異戊二烯途徑抑制與缺血/再灌注（I/R）相關(guān)的超氧化物歧化酶（SOD）的形成，抑制炎性細(xì)胞浸潤［10］。本研究結(jié)果表明，瑞舒伐他汀鈣聯(lián)合二甲雙胍具有抗炎作用，HE染色與PAS染色的結(jié)果從組織形態(tài)學(xué)角度顯示，藥物緩解了腎小球與腎小管的炎性細(xì)胞浸潤進(jìn)程，腎間質(zhì)水腫與出血程度、腎小球與腎小管損傷程度均有所減輕，且藥物劑量增加后，腎臟組織病變程度減輕。

他汀類藥物可通過抗炎作用，抑制腎臟組織氧化應(yīng)激，延緩腎小球的損傷，促使足細(xì)胞與限制系膜細(xì)胞增殖，發(fā)揮其對(duì)腎臟的保護(hù)作用。瑞舒伐他汀是一種親水性他汀，相較于阿托伐他汀在血漿中14 h左右的t1/2，瑞舒伐他汀的t1/2可達(dá)19 h，單藥可使低密度脂蛋白下降30%～50%，抗炎及抑制氧化應(yīng)激方面療效更突出［11］。

腎臟組織纖維化是導(dǎo)致腎功能下降的重要病理機(jī)制，有研究表明，高脂血癥可導(dǎo)致腎小球硬化與腎纖維化，瑞舒伐他汀可通過減少三酰甘油的積累，達(dá)到降脂的目的，同時(shí)抑制肌成纖維細(xì)胞功能，減少細(xì)胞外間質(zhì)（ECM）的產(chǎn)生，抑制腎小管對(duì)蛋白質(zhì)的再吸收，進(jìn)而抑制小管間質(zhì)纖維化，并通過Smad依賴與Smad獨(dú)立通路緩解腎纖維化的進(jìn)程［12-14］。本研究的Masson染色結(jié)果顯示，瑞舒伐他汀鈣聯(lián)合二甲雙胍可顯著改善T2DM大鼠腎臟組織中膠原纖維排列紊亂、間隙增加、纖維樣壞死增加的情況，減少血管血栓，發(fā)揮其抑制腎臟組織纖維化的作用。

他汀類藥物具有多效性，可通過穩(wěn)定腎血管內(nèi)皮細(xì)胞和清除氧自由基來發(fā)揮抗氧化特性，進(jìn)而預(yù)防腎缺血［15］。有研究表明，瑞舒伐他汀鈣通過抑制依賴還原型輔酶Ⅱ（NADPH）的超氧陰離子（O2·-），上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑如谷胱甘肽，緩解氧化應(yīng)激，發(fā)揮抗氧化的作用，此外瑞舒伐他汀鈣還可降低活化的caspase-3的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)腎臟具有保護(hù)作用［16-17］。

GLUT4是定位于腎小球、髓袢升支粗段、血管平滑肌部分的跨膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，受胰島素調(diào)節(jié)，以胰島素依賴的方式攝取葡萄糖，在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用［18］。研究表明，他汀類藥物可誘導(dǎo)胰島素抵抗，降低脂肪組織中GLUT4的表達(dá)，造成胰島素增敏激素分泌不足，降低胰島素細(xì)胞功能，誘發(fā)新發(fā)糖尿?。╪ew onset diabetes，NODM），且瑞舒伐他汀鈣對(duì)胰島素誘導(dǎo)的蛋白激酶b磷酸化和GLUT4向脂肪細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響比匹伐他汀更為顯著［19］。目前關(guān)于他汀類藥物劑量與NODM之間是否存在相關(guān)性還存在一定爭議，大量研究結(jié)果表明，高劑量他汀類藥物誘發(fā)NODM的風(fēng)險(xiǎn)更高，然而同樣有觀點(diǎn)認(rèn)為，劑量并非增加糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵因素，TAGUCHII等［20］通過一項(xiàng)包含13 054例患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量的匹伐他汀對(duì)NODM的發(fā)病率并無明顯影響。本研究結(jié)果顯示，相較C組，M組大鼠腎臟組織GLUT4 mRNA與GLUT4蛋白表達(dá)水平均有所下降；與M組相比，藥物治療后大鼠腎臟組織中GLUT4 mRNA與GLUT4蛋白表達(dá)明顯增加，提示兩藥聯(lián)合可通過調(diào)節(jié)GLUT4 mRNA與GLUT4蛋白表達(dá)，改善胰島素抵抗，影響血糖代謝。同時(shí)M+RH組的腎臟損傷程度低于M+RL組，GLUT4 mRNA與GLUT4蛋白表達(dá)水平均優(yōu)于M+RL組，提示藥物劑量與腎臟保護(hù)作用呈正相關(guān)。

總之，瑞舒伐他汀鈣聯(lián)合二甲雙胍通過減輕腎小球及腎小管炎性細(xì)胞浸潤，緩解腎小球基底膜增厚、腎小管水腫及腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，而這些保護(hù)作用可能與瑞舒伐他汀鈣聯(lián)合二甲雙胍調(diào)控腎臟GLUT4 mRNA的表達(dá)有關(guān)，兩藥聯(lián)用可顯著增加對(duì)T2DM大鼠腎臟的保護(hù)作用，且對(duì)腎臟的保護(hù)作用可隨藥物劑量的增加而上升。

作者貢獻(xiàn)：尚葛礎(chǔ)提出研究思路及主要研究指標(biāo)，負(fù)責(zé)研究的實(shí)施、統(tǒng)計(jì)分析、論文撰寫與修改、后期審查；王瀟永負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)整理、數(shù)據(jù)錄入、統(tǒng)計(jì)分析、圖片整理；高燕負(fù)責(zé)研究的設(shè)計(jì)、研究質(zhì)量控制、指導(dǎo)論文撰寫及論文內(nèi)容審校。

本文無利益沖突。