胡婧 李愛紅 馮金榮

(1. 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，南通 226001；2. 南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南通 226001)

真菌感染臨床常見，主要包括淺部感染和深部感染，一般侵犯皮膚黏膜、指甲等，組織反應(yīng)較輕，但嚴(yán)重時(shí)可侵染組織和內(nèi)臟，引起全身播散性感染，甚至引起免疫受損人群的死亡[1]。白念珠菌是一種常見的真菌病原，其導(dǎo)致的感染占所有念珠菌屬感染的50%左右[2]。研究發(fā)現(xiàn)，白念珠菌的致病性與多種致病因子相關(guān)，包括黏附分子(纖連蛋白)、形態(tài)改變(單細(xì)胞酵母細(xì)胞和菌絲態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)換)、菌體分泌蛋白水解酶類(天冬酰胺蛋白酶、磷脂酶)、生物膜的形成等[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾與白念珠菌的形態(tài)調(diào)控存在密切聯(lián)系。其中，SUMO(small ubiquitin-like modifier)是一種小分子泛素樣修飾蛋白，作為翻譯后修飾的重要手段，可在不同生理?xiàng)l件下與蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)連接，以調(diào)節(jié)其生物學(xué)功能。釀酒酵母中，SMT3是SUMO家族的唯一成員，為必需基因，但通過表達(dá)人類SUMO-1可以回復(fù)SMT3純合子缺失突變體的致死性[4]。釀酒酵母SUMO蛋白酶Ulp2的缺失會(huì)逆轉(zhuǎn)SUMO蛋白的修飾作用，嚴(yán)重影響細(xì)胞的適應(yīng)性[5]。白念珠菌中，SUMO連接酶(E3)Wos1與細(xì)胞白-灰轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)因子Wor1相互作用并調(diào)節(jié)Wor1的SUMO化修飾[6]。目前，白念珠菌中單一的SUMO編碼基因SMT3已被鑒定，其缺失影響細(xì)胞形態(tài)，對(duì)氧化脅迫和細(xì)胞壁脅迫敏感。但SMT3的這些生物學(xué)功能對(duì)其在致病性過程中的影響卻尚未知[7]。

白念珠菌毒力研究常用的動(dòng)物模型包括小鼠、線蟲等。近來，大蠟螟(Galleriamellonella)幼蟲作為宿主研究病原體的致病作用，逐漸受到學(xué)者的重視[8]。相對(duì)于小鼠等，大蠟螟具有操作簡(jiǎn)便、購(gòu)買便捷且價(jià)格低廉、生命周期短等優(yōu)勢(shì)，且其毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果與哺乳動(dòng)物模型有很好的均一性。目前，大蠟螟幼蟲作為宿主研究病原體的致病作用已在國(guó)際上有較多報(bào)道[9-11]，但國(guó)內(nèi)學(xué)者利用大蠟螟模型研究白念珠菌的致病作用卻相對(duì)較少。本文主要建立大蠟螟感染白念珠菌模型，并探索SMT3基因在白念珠菌致病性調(diào)控中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株與質(zhì)粒 白念珠菌野生型菌株SN148、pV1093和pFA-HA-ARG4質(zhì)粒由加拿大康考迪亞大學(xué)Whiteway教授饋贈(zèng)。

培養(yǎng)基 酵母浸膏蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract pentose dextrose medium，YPD medium)、酵母氮源培養(yǎng)基(yeast nitrogen base medium，YNB medium)和合成培養(yǎng)基(synthetic defined medium，SD medium)等均按標(biāo)準(zhǔn)配方配制；固體培養(yǎng)基中添加2%瓊脂粉。SD-Arg-Ura選擇性培養(yǎng)基中缺少精氨酸、尿嘧啶。

主要試劑 常規(guī)Taq酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司；OneTaq購(gòu)自NEB公司，StuⅠ內(nèi)切酶購(gòu)自TAKARA公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自北京天漠生物科技公司；LiAC、ssDNA等常規(guī)生化試劑購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；DNA Marker購(gòu)自上海捷瑞生物工程公司；大蠟螟購(gòu)自河南科云生物公司。

1.2 方法

引物設(shè)計(jì)與合成 白念珠菌SMT3基因核酸序列來自白念珠菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.candidagenome.org/)，序列分析和引物設(shè)計(jì)經(jīng)由Benchling網(wǎng)站(http://www.benchling.com)在線分析完成。引物由上海捷瑞生物工程公司合成。本研究相關(guān)引物見表1。

表1 引物序列

白念珠菌的轉(zhuǎn)化 參考前文方法[12]，將白念珠菌野生型菌株SN148過夜培養(yǎng)后用于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子涂布于固體SD-Arg選擇培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2～3 d后檢查轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)情況。

白念珠菌菌落PCR 挑取純化后的新鮮轉(zhuǎn)化子，采用NEB公司的OneTaq酶直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。

SMT3基因缺失菌株的構(gòu)建 采用瞬時(shí)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建SMT3缺失菌株：利用引物P7和P8，以pV1093質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增Ca9基因；利用引物P1和SMT3-sg-R擴(kuò)增sgRNA-1片段，利用引物SMT3-sg-F和P4擴(kuò)增sgRNA-2片段，并以sgRNA-1和sgRNA-2片段為模板，以P5和P6為引物，PCR擴(kuò)增完整的sgRNA片段；以pFA-HA-ARG4為模板，SMT3-Re-F和SMT3-Re-R為引物，PCR擴(kuò)增出修復(fù)片段。將Cas9、sgRNA和修復(fù)片段共轉(zhuǎn)化白念珠菌野生型菌株，將轉(zhuǎn)化子純化后，利用SMT3-Te-F和SMT3-Te-R進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)。

SMT3基因缺失菌株的形態(tài)檢測(cè) 將白念珠菌野生型菌株SN148和SMT3缺失株分別接種至YPD液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)至穩(wěn)定期后于光鏡下觀察菌體形態(tài)。同時(shí)，將菌液進(jìn)行1/10梯度稀釋，分別取3 μL原液、10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀釋液點(diǎn)接到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)2～3 d，觀察菌株生長(zhǎng)情況。隨后，用流水沿平板表面緩慢沖洗(不直接沖洗菌落)，直至無明顯菌體被洗下，檢查菌體侵入培養(yǎng)基的情況。

SMT3基因缺失株的生物被膜形成試驗(yàn) 根據(jù)前文方法[13]，檢測(cè)白念珠菌野生型SN148和SMT3缺失株的生物被膜形成情況。

毒力實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)使用的大蠟螟幼蟲體重均為300～400 mg，舍棄活力較弱有黑色斑點(diǎn)的不健康幼蟲，保留體態(tài)勻稱、色澤瑩白的健康幼蟲。隨機(jī)挑選10條健康幼蟲置于同一培養(yǎng)皿中為一組。將白念珠菌過夜培養(yǎng)物，進(jìn)行超聲處理以離散黏連細(xì)胞，并用生理鹽水稀釋后涂布YPD固體培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)2～3 d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并將原液用生理鹽水稀釋至5×107CFU/mL。微量注射器(高鴿，25 μL)用75%乙醇浸泡滅菌10 min，用無菌水沖洗3次。用微量注射器吸取10 μL白念珠菌懸液，從大蠟螟幼蟲倒數(shù)第二足刺入完成注射。注射后觀察幼蟲，如出現(xiàn)5～8 h內(nèi)迅速惡化的幼蟲則視為注射失敗并剔除出實(shí)驗(yàn)。注射完成后，將幼蟲置于30 ℃避光培養(yǎng)，每天觀察生存情況并記錄。將瀕死蟲體置于10%中性福爾馬林固定液中浸泡48 h，取出后置于30%蔗糖溶液中脫水48 h，進(jìn)行冰凍切片，并利用PAS糖原染色試劑盒(北京索萊寶)進(jìn)行染色。

大蠟螟幼蟲血細(xì)胞分析 為觀察大蠟螟血細(xì)胞中白念珠菌，利用CAI4-GFP (ura3::imm434/ura3::imm434 pAM5.6)菌株，其自身已攜帶GFP綠色熒光標(biāo)記。為研究白念珠菌感染大蠟螟幼蟲后的血細(xì)胞，隨機(jī)挑選4條健康幼蟲于同一培養(yǎng)皿中為一組，分別將10 μL白念珠菌野生型菌株SN148、SMT3缺失株懸液(5×107CFU/mL)注射大蠟螟幼蟲，20 h后取血淋巴。將20 μL血淋巴與20 μL的臺(tái)酚藍(lán)染液混勻，于光鏡下用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)并分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 SMT3基因缺失菌株構(gòu)建

采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除SMT3基因[12]：分別于體外擴(kuò)增Cas9基因、SMT3基因sgRNA和帶有ARG4標(biāo)記的修復(fù)DNA片段，轉(zhuǎn)化后通過菌落PCR直接鑒定轉(zhuǎn)化子基因型(見圖1A)。利用檢測(cè)引物SMT3-Te-F和SMT3-Te-R，在野生型菌株中能擴(kuò)出約1.0 kb條帶，而SMT3基因被ARG4替換后，則能擴(kuò)出約3.0 kb的片段。如圖1A所示，1～4泳道中轉(zhuǎn)化子能擴(kuò)出單一的約3.0 kb片段，表明SMT3基因敲除成功。

2.2 SMT3基因缺失對(duì)形態(tài)發(fā)生和生物被膜形成的影響

研究表明，SMT3基因缺失導(dǎo)致液體培養(yǎng)基中白念珠菌呈菌絲狀生長(zhǎng)[7]，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了SMT3基因缺失株在固體培養(yǎng)基中的侵入生長(zhǎng)能力。在YPD液體培養(yǎng)基中，SMT3缺失株細(xì)胞串珠樣比例明顯上升，細(xì)胞普遍伸長(zhǎng)；而野生型菌株在鏡下呈典型的酵母態(tài)(見圖1B)。在YPD固體培養(yǎng)基上，野生型菌株SN148菌落較為平整；而SMT3缺失株菌落表面和邊緣粗糙；用流水緩慢沖洗后，SMT3缺失株幾乎不能被洗去，呈現(xiàn)較強(qiáng)的侵入生長(zhǎng)能力(見圖1C)。

鑒于白念珠菌菌絲態(tài)生長(zhǎng)和生物被膜形成有一定的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)通過生物被膜形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，SMT3缺失株的生物被膜形成能力明顯增強(qiáng)，A595值=1.0，約為野生型菌株的2.5倍(見圖1D)。

圖1 SMT3缺失株的基因型檢測(cè)及形態(tài)分析. A. SMT3敲除與檢測(cè); B. 液體培養(yǎng)基中SMT3缺失株的形態(tài); C. SMT3缺失株在固體培養(yǎng)基上的浸入生長(zhǎng)分析; D. SMT3缺失株的生物被膜形成實(shí)驗(yàn)(成對(duì)樣本t檢測(cè))

2.3 SMT3基因缺失菌株的毒力檢測(cè)

為檢測(cè)SMT3基因缺失對(duì)白念珠菌毒力的影響，本研究建立了大蠟螟感染模型，檢測(cè)了SMT3缺失株的毒力，并以野生型菌株為對(duì)照。注射10 d后，生理鹽水組大蠟螟幼蟲(n=5)全部保持存活，表明注射不會(huì)明顯傷及大蠟螟的存活；感染野生型菌株的幼蟲注射后逐漸死亡，10 d時(shí)仍有3只蟲體保持存活，平均存活期為8.5 d；注射SMT3缺失株的幼蟲9 d時(shí)全部死亡，平均存活期僅為3.5 d(見圖2A、2B)。這一結(jié)果表明，SMT3基因的缺失導(dǎo)致白念珠菌致病能力上升。通過組織切片也發(fā)現(xiàn)(見圖2C)，白念珠菌SMT3缺失株和野生型菌株均能在大蠟螟幼蟲體內(nèi)以菌絲態(tài)形式存在。

圖2 SMT3基因缺失對(duì)白念珠菌致病性的影響. A. 感染白念珠菌大蠟螟幼蟲的生存曲線； B. 受感染大蠟螟幼蟲的存活情況； C. 受感染大蠟螟幼蟲組織切片(糖原染色) 圖3 SMT3缺失對(duì)血細(xì)胞的破壞作用. A大蠟螟血細(xì)胞與白念珠菌互作； B. 大蠟螟幼蟲血細(xì)胞總數(shù)測(cè)定(成對(duì)樣本t檢測(cè))

2.4 SMT3缺失對(duì)大蠟螟血細(xì)胞的破壞作用檢測(cè)

為進(jìn)一步分析SMT3缺失株對(duì)大蠟螟的致病作用，我們檢測(cè)了感染白念珠菌后大蠟螟血細(xì)胞的存活情況。將帶有GFP熒光標(biāo)記的白念珠菌野生型菌株注射大蠟螟后，發(fā)現(xiàn)其血細(xì)胞中帶有綠色熒光信號(hào)；隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，較多數(shù)量的血細(xì)胞攜帶綠色熒光信號(hào)，說明大蠟螟血細(xì)胞可以吞噬白念珠菌(見圖3A)。隨后，我們分析了感染白念珠菌野生型菌株和SMT3缺失株后大蠟螟的血細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染SMT3缺失株的大蠟螟幼蟲中存活的血細(xì)胞數(shù)約為1.4×107/mL，明顯低于野生型組(2.9×107/mL,P<0.05)，說明SMT3缺失導(dǎo)致白念珠菌對(duì)大蠟螟幼蟲血細(xì)胞的破壞作用增強(qiáng)(見圖3B)。

3 討 論

白念珠菌的菌體形態(tài)與其致病性存在密切聯(lián)系，探索其形態(tài)發(fā)生機(jī)制對(duì)闡明白念珠菌的致病機(jī)理及臨床白念珠菌病的防治具有重要的指導(dǎo)意義。本實(shí)驗(yàn)通過CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)快速構(gòu)建了SMT3純合子缺失菌株，發(fā)現(xiàn)SMT3基因缺失導(dǎo)致細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中呈菌絲狀生長(zhǎng)，在固體培養(yǎng)基中呈現(xiàn)侵入生長(zhǎng)，這一結(jié)果與SUMO聚合酶UBC9和連接酶MMS21等基因缺失株細(xì)胞形態(tài)類似，說明SUMO修飾相關(guān)基因在形態(tài)調(diào)控中發(fā)揮類似的作用[13-14]。但迄今未有對(duì)SUMO修飾相關(guān)基因在白念珠菌致病性調(diào)控中的作用進(jìn)行研究。本文發(fā)現(xiàn)SMT3缺失導(dǎo)致白念珠菌在大蠟螟模型中毒力顯著增強(qiáng)，通過分析大蠟螟血細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，其對(duì)血細(xì)胞的破壞作用也顯著增強(qiáng)。白念珠菌的菌絲狀生長(zhǎng)對(duì)于其逃逸宿主免疫細(xì)胞的殺傷以及深部感染有重要作用[15]。本文發(fā)現(xiàn)，SMT3缺失導(dǎo)致細(xì)胞呈菌絲狀生長(zhǎng)，可能增強(qiáng)了其通過菌體延伸逃逸并破壞大蠟螟血細(xì)胞的作用，表現(xiàn)出毒力增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中，SMT3缺失導(dǎo)致血細(xì)胞數(shù)量減少也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一推測(cè)。需要指出的是，由于SMT3缺失株呈現(xiàn)菌絲狀生長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞黏連，難以通過常規(guī)的血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，而通過平板CFU計(jì)數(shù)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)偏大，部分影響其毒力情況。此外，本實(shí)驗(yàn)中敲除SMT3基因時(shí)引入了ARG4標(biāo)記，也可能會(huì)對(duì)毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響。后續(xù)仍需進(jìn)一步驗(yàn)證SUMO修飾其他相關(guān)基因如SUMO聚合酶UBC9、SUMO連接酶MMS21、SIZ1等在致病性調(diào)控中的作用，以明確SUMO修飾相關(guān)途徑對(duì)白念珠菌致病性的調(diào)控作用。

哺乳動(dòng)物的先天免疫反應(yīng)與真菌病原體的防御有關(guān)，這種免疫反應(yīng)也同樣存在于昆蟲體內(nèi)，因此分析昆蟲對(duì)真菌病原體的應(yīng)答對(duì)研究真菌毒力有一定意義[16]。相對(duì)于小鼠等動(dòng)物模型，大蠟螟幼蟲易于購(gòu)買和接種，無需投入大量資金和進(jìn)行復(fù)雜操作；由于幼蟲體積小、生命周期短，它們易于處理且能在短期內(nèi)提供結(jié)果；幼蟲的死亡率、血細(xì)胞(免疫細(xì)胞)數(shù)量的變化及幼蟲血細(xì)胞內(nèi)病原體的增殖程度，都是檢測(cè)菌體毒性和蟲體免疫反應(yīng)的良好指標(biāo)。因此，大蠟螟幼蟲為測(cè)定微生物毒性提供了一種簡(jiǎn)便快速的方法，也成為了此類實(shí)驗(yàn)中哺乳動(dòng)物模型的有效替代品[8,17]。本文的結(jié)果，對(duì)進(jìn)一步將大蠟螟模型廣泛應(yīng)用于白念珠菌及其他致病微生物毒力和致病機(jī)制研究具有一定的指導(dǎo)意義。