王會(huì)偉 姜偉偉 徐媛,3 李穎芳,4 李航 朱信霖 陳天楊 王啟龍 陳敏 潘煒華 廖萬(wàn)清

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)上海長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科，上海 200003；2.上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200003；3. 杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科，杭州 310009；4.上海市皮膚病醫(yī)院皮膚科，上海 200443；5. 69218部隊(duì)醫(yī)院，喀什 844799)

Fonsecaeaspp.所致的暗色真菌病(dark fungal disease，DFD) 是累及皮膚、皮下、內(nèi)臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等部位的慢性真菌感染性疾病[1]。近20年來(lái)，F(xiàn)onsecaeaspp.感染的發(fā)病率逐年增加[2]，感染后需要長(zhǎng)期系統(tǒng)的藥物治療[1]，尤其是合并腦部感染患者預(yù)后差，死亡率高達(dá)90%[3-4]。DFD 臨床表現(xiàn)的多樣性，給診斷帶來(lái)很大困難。而大部分Fonsecaeaspp.菌株對(duì)兩性霉素B、氟康唑這些藥物的敏感性較低，有不同程度的抗藥性[5-7]，導(dǎo)致Fonsecaeaspp.感染后病程時(shí)間長(zhǎng)、復(fù)發(fā)率高，進(jìn)而又增加耐藥性。目前Fonsecaeaspp.感染的治療方案尚無(wú)統(tǒng)一的“金標(biāo)準(zhǔn)”，即使聯(lián)合治療，有些患者仍然效果欠佳，該病的治療一直困擾著臨床醫(yī)生與廣大的患者[8]。擬對(duì)收集自我國(guó)的Fonsecaeaspp.臨床菌株進(jìn)行體外藥敏檢測(cè)研究與系統(tǒng)分析，為精準(zhǔn)治療方案的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源

32株Fonsecaeaspp.臨床株來(lái)自上長(zhǎng)征醫(yī)院真菌室菌種庫(kù)(2株)，部分由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院劉維達(dá)教授(10株)、南方醫(yī)科大學(xué)孫逸仙醫(yī)院席麗艷教授(10株)、復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院章強(qiáng)強(qiáng)教授(2株)和廣西醫(yī)科大學(xué)曹存巍教授(10株)惠贈(zèng)。所有菌株均分離自各地患者皮膚感染部位，其中Fonsecaeamonophora18株，F(xiàn)onsecaeanubica7株，F(xiàn)onsecaeapedrosoi9株(2株菌活化后期發(fā)現(xiàn)污染，排除)。

1.2 研究方法

采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦的絲狀菌標(biāo)準(zhǔn)的肉湯微量稀釋法(CLSI M38-A2 法)，對(duì)Fonsecaeaspp.分離株進(jìn)行11種臨床抗真菌藥物的體外敏感性試驗(yàn)[8]。

表1 本研究中使用的抗真菌藥物列表的詳細(xì)信息

將Fonsecaeaspp.菌株接種于PDA培養(yǎng)基(全部使用第2次活化菌株)，置于35℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中孵育，5 d后觀察，以近平滑念珠菌(ATCC 22019)作為參考菌株。

藥敏板的制備[8]使用96孔板(U型底)作為藥敏板，每塊藥敏板為同1種抗真菌藥物，每株菌重復(fù)1次(共2排)，故一塊藥敏板可對(duì)4株Fonsecaeaspp.菌株的抗真菌藥物敏感性進(jìn)行檢測(cè)。藥敏板中每列抗真菌藥物的濃度相同，1～10孔以2倍的濃度遞減，11孔為陽(yáng)性對(duì)照孔不含藥物，第12孔為陰性對(duì)照，藥母液濃度為1 600 μg/mL，第1孔的中間濃度應(yīng)為16 μg/mL。本實(shí)驗(yàn)研究藥敏板的2孔至10孔不使用伏立康唑母液直接配制，先用DMSO對(duì)1 600 μg/mL的伏立康唑母液稀釋至藥敏板上對(duì)應(yīng)孔所需濃度的50倍，然后使用1 640培養(yǎng)基將50倍濃度的伏立康唑藥調(diào)整為該孔所需濃度。最后分別往陽(yáng)性、陰性對(duì)照孔中每孔加入100 μL、 200 μL上述溶液用作后續(xù)對(duì)照。將配制好的伏立康唑藥敏板標(biāo)注日期及藥物名稱后放入-40℃冰箱備用。見(jiàn)圖1。

圖1 兩性霉素B的藥敏實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果示例

菌懸液的制備[8]用槍頭吸取10 μL孢子懸液滴在血球計(jì)數(shù)板蓋玻片邊緣，在顯微鏡下觀察血球計(jì)數(shù)板上的Fonsecaeaspp.孢子分布是否均勻，然后進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算4個(gè)頂角和最中間方格中的Fonsecaeaspp.孢子數(shù)量(壓線部位計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”)，數(shù)得Fonsecaeaspp.孢子數(shù)為N，則Fonsecaeaspp.菌的總濃度=5×N×104CFU/mL，最終菌的總濃度應(yīng)控制在3×106CFU/mL[8]。使用1 640培養(yǎng)基對(duì)計(jì)數(shù)得到的Fonsecaeaspp.孢子懸液進(jìn)行稀釋，最終將孢子懸液濃度稀釋至4×104～5×103CFU/mL(3×104CFU/mL)后，加入配制好的96孔抗真菌藥板中，1～11孔各加入100 μL孢子懸液，每種菌加兩排進(jìn)行重復(fù)對(duì)照[8]。ATCC 22019質(zhì)控菌株菌懸液的配制：挑取單菌落至裝有Tween 20生理鹽水的EP管渦旋震蕩充分混勻，取菌懸液計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法同上述Fonsecaeaspp.計(jì)數(shù)方法[8]。用1 640培養(yǎng)液將該質(zhì)控菌株菌懸液濃度調(diào)整至1×103～5×103CFU/mL(3×103CFU/mL)后，接種至藥敏板(接種方法同F(xiàn)onsecaeaspp.)[8]

1.3 全球Fonsecaea spp.感染病例相關(guān)臨床株藥敏數(shù)據(jù)收集

搜索PubMed、中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)服務(wù)系統(tǒng)(SinoMed)。研究方案獲得PROSPERO注冊(cè)號(hào)：CRD42021275308[9]。主要診斷標(biāo)準(zhǔn)：①用10%的KOH直接觀察，發(fā)現(xiàn)樣本中深色的厚壁硬殼小體(“copper pennies)[9]；②患者組織中分離、培養(yǎng)后ITS 測(cè)序鑒定。結(jié)局變量為好轉(zhuǎn)與未好轉(zhuǎn)。統(tǒng)計(jì)報(bào)道的時(shí)間點(diǎn)Fonsecaea感染預(yù)后為：①治愈(臨床治愈與真菌學(xué)檢查治愈)或者好轉(zhuǎn)；②未好轉(zhuǎn)或致死。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

連續(xù)變量(年齡和時(shí)間等)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；分類變量(包括性別等)以計(jì)數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，組間差異比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn) Wilcoxon。統(tǒng)計(jì)假設(shè)的所有檢驗(yàn)都是雙向，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用R語(yǔ)言(版本3.6.3 /Windows 64位)分析所有數(shù)據(jù)并作KM曲線。

2 結(jié) 果

2.1 Fonsecaea spp.臨床分離菌株的體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)32株Fonsecaeaspp.的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，F(xiàn)onsecaeaspp.對(duì)POS(MIC50=0.25 μg/mL，MIC90=0.5 μg/mL)，ISA (MIC50=0.25 μg/mL, MIC90=0.5 μg/mL)，VOR(MIC50=0.125 μg/mL, MIC90=0.25 μg/mL)等二代唑類的抗真菌藥對(duì)Fonsecaeaspp.臨床株活性最高，而AmB(MIC50=4 μg/ml；MIC90=8 μg/mL)、FLU(MIC50=8 μg/mL，MIC90>8 μg/mL)、棘白菌素類(MEC50=8 μg/mL, MEC90>8 μg/mL)對(duì)Fonsecaeaspp.的抗菌活性較低。POS>ISA>VOR>ITR>FLU；Ani>CAS> MCF。

表2 Fonsecaea spp.臨床分離菌株的體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 Fonsecaea spp.藥敏系統(tǒng)分析

搜索到已報(bào)道的83個(gè)Fonsecaeaspp.病例的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中Fonsecaeapedrosoi34株(34/83，40.96%)，F(xiàn)onsecaeamonophora36株(36/83，43.37%)，F(xiàn)onsecaeanubica13株(13/83，15.66%)，統(tǒng)計(jì)分析MIC50結(jié)果見(jiàn)表3。在Fonsecaeaspp.(n=83)的藥敏結(jié)果中POS> TRB> VOR> ITR >CAS> AmB>5-FC> FLU。在Fonsecaeamonophora(n=36)的體外藥敏實(shí)驗(yàn)中，POS> TRB> VOR> ITR >CAS> AmB>5-FC> FLU。在Fonsecaeapedrosoi(n=34)的體外藥敏實(shí)驗(yàn)中，TRB> POS> VOR> ITR> AmB> CAS> 5-FC>FLU。在Fonsecaeanubica(n=13)的體外藥敏實(shí)驗(yàn)中，POS> TRB> VOR> ITR> CAS> AmB>5-FC> FLU。

表3 已報(bào)道的83個(gè)Fonsecaea spp.病例的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 Fonsecaea spp.臨床分離菌株的種間臨床預(yù)后分析

根據(jù)收集的臨床病例資料進(jìn)行分析，如圖2所示，以目前的臨床治療措施，F(xiàn)onsecaeamonophora和Fonsecaeanubica的應(yīng)答率明顯好于Fonsecaeapedrosoi，對(duì)藥物的有效率依次由高到低位：Fonsecaeamonophora，F(xiàn)onsecaeanubica，F(xiàn)onsecaeapedrosoi。

圖2 Fonsecaea spp.所致的暗色真菌病的臨床有效情況

3 討 論

1911年，Pedroso在巴西首次報(bào)道了Fonsecaeapedrosoi感染的病例[9]。近20年來(lái)，全球報(bào)道的Fonsecaeaspp.感染的病例呈逐年上升的趨勢(shì)。我國(guó)已成為Fonsecaeaspp.感染最多的區(qū)域之一，尤其高發(fā)于我國(guó)華南、華東區(qū)域，長(zhǎng)江與黃河中下游流域等地區(qū)。鑒于DFD臨床表現(xiàn)的多樣性，其診斷依賴于實(shí)驗(yàn)室真菌學(xué)檢查結(jié)果，臨床醫(yī)生不僅需要排除許多常見(jiàn)的疾病，如疣狀結(jié)核、銀屑病、鱗癌等非真菌感染的常見(jiàn)疾病外，還需要與枝孢瓶霉屬(Cladophialophoraspp.)、瓶霉屬(Phialophoraspp.)、喙枝孢屬(Rhinocladiellaspp.)和外瓶霉屬(Exophialaspp.)等暗色真菌所致的暗色真菌病進(jìn)行鑒別[9]。本研究發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外Fonsecaeaspp.所致的暗色真菌病的診斷，仍然有很多病例誤診，另外也有很多病例不能進(jìn)行Fonsecaeaspp.種水平的鑒定，導(dǎo)致不能及時(shí)有效地“對(duì)菌下藥”。在目前的臨床治療方案下，F(xiàn)onsecaeamonophora(除神經(jīng)系統(tǒng)感染外)的應(yīng)答率明顯好于Fonsecaeapedrosoi和Fonsecaeanubica，對(duì)藥物的有效率依次由高到低位：Fonsecaeamonophora，F(xiàn)onsecaeanubica，F(xiàn)onsecaeapedrosoi(Fonsecaeapedrosoi與非Fonsecaeapedrosoi之間有差異)。Fonsecaeaspp.感染的致病菌種精確至種水平的診斷，有利于精準(zhǔn)選擇治療方案，提高患者治愈率。

本研究所收集的Fonsecaeaspp.菌株，幾乎所有的菌株均對(duì)AmB、FLU耐藥，且藥物敏感性較國(guó)外研究更低[6,10]，唑類抗真菌藥物對(duì)Fonsecaeaspp.的抗菌活性較高，除了氟康唑以外，其他唑類藥對(duì)Fonsecaeaspp.均有抗菌活性，尤其是POS對(duì)Fonsecaeaspp.的活性最強(qiáng)，表明POS在Fonsecaeaspp.感染的治療中有良好的應(yīng)用前景[11]。棘白菌素類藥物對(duì)Fonsecaeaspp.的抗菌活性略高于兩性霉素B，但低于大部分唑類藥物。由于棘白菌素類藥物作用于細(xì)胞壁及低毒性的特點(diǎn)，在聯(lián)合其他抗真菌藥物治療Fonsecaeaspp.時(shí)具有潛力。由于常用抗真菌藥對(duì)Fonsecaeaspp.的抗菌活性并不很理想，活性較高的二代唑類藥又價(jià)錢昂貴，進(jìn)一步研究針對(duì)Fonsecaeaspp.的聯(lián)合藥敏具有重要意義。有研究表明AmB與5-FC聯(lián)合使用對(duì)F.monophora菌株具有協(xié)同作用[10-11]。本研究分析也發(fā)現(xiàn)TRB與AmB可能有協(xié)同作用，有助于臨床治療率的提高，在降低不良反應(yīng)的同時(shí)可降低真菌耐藥率的發(fā)生。

綜上，本研究結(jié)果提示，針對(duì)Fonsecaeaspp.感染的抗真菌治療策略，首先推薦選擇POS, ISA, VOR等二代唑類藥物。其他抗真菌藥物TRB、ITR、AmB、FLU等對(duì)分離自我國(guó)的Fonsecaeaspp.臨床分離菌株的體外抗真菌活性有降低趨勢(shì)，需要持續(xù)監(jiān)測(cè)。Fonsecaeaspp.臨床分離菌株的體外聯(lián)合藥敏特征亦值得進(jìn)一步研究。