江京洋，韋旭航，朱軍莉，吳 敏，馮立芳*

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

大黃魚（Larimichthys crocea）又稱黃魚、黃花魚、黃瓜魚，是我國四大傳統(tǒng)海產(chǎn)品（大黃魚、小黃魚、帶魚、烏賊）之一，其2019年的全國養(yǎng)殖量22.6萬 t，居海水養(yǎng)殖魚類之首，為我國東南沿海的重要經(jīng)濟(jì)魚類[1]。大黃魚體色金黃，含有豐富的微量元素、維生素、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸，肉質(zhì)細(xì)致滑嫩，深受消費(fèi)者喜愛，因此大黃魚的市場需求極大。大黃魚常因運(yùn)輸工具的顛簸導(dǎo)致死亡，故其常以冷藏方式進(jìn)行運(yùn)輸和銷售。隨著冷藏時間的延長，大黃魚在內(nèi)源酶作用下發(fā)生自溶、脂肪氧化、以及耐冷細(xì)菌的繁殖并代謝，導(dǎo)致魚體腐敗和產(chǎn)生臭味變質(zhì)，這部分適合生存和繁殖的細(xì)菌就是水產(chǎn)品貯藏過程中的特定腐敗菌[2]。

波羅的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）為革蘭氏陰性桿菌，隸屬交替單胞菌目（Alteromonadales）希瓦氏菌科（Shewanellaceae）希瓦氏菌屬[3]，能還原氧化三甲胺（trimethylamineN-oxide，TMAO）為三甲胺（trimethylamine，TMA），產(chǎn)生胺類化合物、硫化氫，具有較強(qiáng)的致腐能力，是大黃魚、南美白對蝦等海產(chǎn)品在冷藏過程中常見的特定腐敗菌[4-5]。在海產(chǎn)品腐敗過程中，特定腐敗菌會合成并釋放群體感應(yīng)信號分子——自誘導(dǎo)物（autoinducer，AI），以調(diào)控菌體密度和生理行為，并加速海產(chǎn)品腐敗變質(zhì)[6]。在波羅的海希瓦氏菌中已鑒定到兩種信號分子——二酮哌嗪類化合物（diketopiperazines，DKPs）和AI-2，二者均參與細(xì)菌的群體感應(yīng)事件[7-8]。

RNA噬菌體Qβ復(fù)制酶的宿主因子Hfq是一種RNA分子伴侶蛋白，亦是一個結(jié)構(gòu)保守的六聚體蛋白，存在于革蘭氏陽性和陰性菌[9]。Hfq通過正向和負(fù)向兩種調(diào)控方式，調(diào)節(jié)細(xì)菌的小RNA（sRNA）和信使RNA（mRNA）的堿基配對，從而影響翻譯的進(jìn)程和RNA的穩(wěn)定性[10]。Hfq調(diào)控細(xì)菌多種代謝通路，影響的生理生化表型包括：生長速率、泳動能力、趨化能力、毒力、抗逆境能力以及群體感應(yīng)現(xiàn)象等[11]。例如，在哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）的群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)中，Hfq在細(xì)胞密度較低的情況下與群體調(diào)控RNA（quorum regulatory RNAs，Qrr RNA）結(jié)合，抑制LuxR的轉(zhuǎn)錄和降低群體感應(yīng)現(xiàn)象[12]。在單核細(xì)胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）中，hfq基因缺失株的毒力和生物被膜形成能力顯著降低[13]。在奧奈達(dá)希瓦氏菌（S.oneidensis）中，hfq基因缺失株的指數(shù)期生長速率變慢、穩(wěn)定期細(xì)胞密度降低[14]。在大腸桿菌（Escherichia coliK-12）中，hfq基因突變株不僅表現(xiàn)為生長速率變慢和穩(wěn)定期細(xì)胞密度降低，還表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大、滲透敏感性增強(qiáng)、抗紫外線能力減弱等[15]。但在金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中，hfq基因表達(dá)水平較低，且hfq基因缺失株的生長速率和抗逆境能力與對照組無差異[16]。這說明Hfq在不同物種中存在功能趨異現(xiàn)象。

目前有關(guān)波羅的海希瓦氏菌中Hfq功能的研究還鮮見報(bào)道，亦未知Hfq與水產(chǎn)品腐敗的相關(guān)性。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)從波羅的海希瓦氏菌SB-19株中鑒定到1個hfq基因，并構(gòu)建hfq基因敲除株，通過分析細(xì)菌的生長速率、群體感應(yīng)現(xiàn)象、抗逆境能力、致腐能力，旨在為海產(chǎn)品腐敗菌的Hfq功能研究和明晰其致腐機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

波羅的海希瓦氏菌SB-19株為本課題組前期分離自冷藏大黃魚，經(jīng)生化鑒定和全基因組測序[17]，菌株保存于-80 ℃冰箱[17]。

所有培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增、RNA抽提、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量PCR（realtime PCR）檢測試劑盒 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；其余生化試劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司；7890/5975氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀 美國安捷倫科技有限公司；970CTR熒光分光光度計(jì) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；Victor X酶標(biāo)儀 美國PerkinElmer公司；UV2550紫外分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 Hfq序列分析

以本課題組前期測序、組裝、預(yù)測后的波羅的海希瓦氏菌SB-19株基因組為對象，構(gòu)建本地BLAST數(shù)據(jù)庫，將從NCBI網(wǎng)站查找并下載的波羅的海希瓦氏菌、奧奈達(dá)希瓦氏菌、腐敗希瓦氏菌（S.putrefaciens）以及大腸桿菌Hfq的氨基酸序列進(jìn)行比對，篩選條件為E-value＞103。使用Clustalx軟件對篩選所得波羅的海希瓦氏菌SB-19株、希瓦氏菌屬和大腸桿菌的Hfq序列進(jìn)行同源序列比對。

1.3.2 real-time PCR的檢測

將活化菌株按照體積分?jǐn)?shù)1‰的接種量接入LB肉湯中，并在30 ℃搖床160 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，每隔4 h取樣一次，提取細(xì)菌總RNA，樣品中DNA殘留消化后即反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以16S rRNA為內(nèi)參基因，進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt法計(jì)算hfq基因的相對表達(dá)水平[18]。

1.3.3 波羅的海希瓦氏菌hfq基因敲除株的構(gòu)建

根據(jù)波羅的海希瓦氏菌SB-19株的hfq基因及其兩側(cè)序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增hfq基因上游和下游的同源臂片段引物（表1），然后用PCR擴(kuò)增和回收純化。巢式PCR將hfq基因上、下游片段與Cm基因表達(dá)框進(jìn)行連接，按照本課題組前期操作過程[17]進(jìn)行PCR片段的轉(zhuǎn)染和敲除株的篩選。

表1 實(shí)驗(yàn)所用PCR引物Table 1 Primers used for PCR in this study

1.3.4 細(xì)菌生長曲線的測定

將活化的波羅的海希瓦氏菌SB-19株野生型（wide type，WT）與hfq基因敲除株（knock out，KO）分別接種到去離子水中，調(diào)整菌體濃度107CFU/mL，10 倍梯度稀釋至菌體濃度為106CFU/mL后轉(zhuǎn)接至裝LB肉湯的試管中，使起始菌體密度約為105CFU/mL，在30 ℃或4 ℃搖床160 r/min進(jìn)行培養(yǎng)。每隔4 h取100 μL進(jìn)行平板涂布，在30 ℃培養(yǎng)24 h、4 ℃培養(yǎng)144 h計(jì)數(shù)，繪制細(xì)菌的生長曲線。細(xì)菌的生長動力學(xué)模型參考李學(xué)英等[19]提出的修正后Gompertz方程：

1.3.5 DKPs和AI-2的檢測

將活化的WT和KO菌株按照1‰接種于LB肉湯中，并在30 ℃搖床160 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，每隔6 h取樣一次。

DKPs的檢測：10 000 r/min離心10 min后取上清液，用等體積氯仿萃取并收集有機(jī)相，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后再次用氯仿溶解提取物，定容至1 mL后用GC-MS檢測，色譜和質(zhì)譜條件同本課題組前期操作[20]。DKPs生成量以μg/mL表示。

AI-2的檢測：10 000 r/min離心3 min，上清液用0.22 μm濾紙過濾，另將活化后培養(yǎng)至穩(wěn)定期的哈維氏弧菌BB170用AB培養(yǎng)基作1∶5 000稀釋，分別將10 μL待測上清液和90 μL稀釋的BB170菌液添加至96 孔酶標(biāo)板。在30 ℃孵育0.5 h，用熒光分光光度計(jì)在490 nm波長處檢測熒光強(qiáng)度[8]。AI-2水平以哈維氏弧菌BB170誘導(dǎo)熒光強(qiáng)度表示。

1.3.6 生物被膜的檢測

將活化后培養(yǎng)至穩(wěn)定期的WT和KO菌株按照體積比1∶100分別接種至含LB培養(yǎng)基的96 孔板中，在30 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。將96 孔板中菌液傾倒干凈，隨后用無菌水清洗3次，置于超凈臺風(fēng)干。每孔加入0.2%結(jié)晶紫溶液200 μL，靜置染色15 min。棄去結(jié)晶紫溶液，用無菌水清洗干凈，再用33%冰醋酸溶液溶解，最后用酶標(biāo)儀測量595 nm處吸光度。

1.3.7 胞外蛋白酶活性的檢測

將1.5%瓊脂與10%脫脂牛奶混勻后滅菌制備脫脂牛奶瓊脂平板，取活化后培養(yǎng)至穩(wěn)定期的WT和KO菌液5 μL點(diǎn)樣，隨后置于30 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，測量蛋白水解圈直徑。

1.3.8 細(xì)菌抗逆能力的檢測

將活化后培養(yǎng)至穩(wěn)定期的WT和KO菌株按照體積分?jǐn)?shù)1‰接種于不同脅迫條件中，以檢測細(xì)菌的抗逆境能力。NaCl脅迫：活化菌株接種至含不同質(zhì)量濃度NaCl（2、3、4 g/100 mL）的LB肉湯中；營養(yǎng)脅迫：活化菌株接種至用滅菌超純水稀釋（1∶2、1∶4、1∶8，V/V）的LB肉湯中；重金屬脅迫：活化菌株接種至含不同濃度Cu2+（0.05、0.15、0.3 mmol/L）的LB肉湯中；消毒劑脅迫：活化菌株接種至含不同質(zhì)量濃度NaClO（0.1、0.15、0.2 g/100 mL）的LB肉湯中。經(jīng)30 ℃搖床160 r/min培養(yǎng)24 h，然后用紫外分光光度計(jì)檢測菌液OD600nm。

1.3.9 滅菌魚汁中揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）和TMA的測定

滅菌魚汁的制作過程參照前期實(shí)驗(yàn)[17]，取新鮮大黃魚背部肌肉與純凈水按照1∶2（g/mL）混合，均質(zhì)機(jī)拍打成勻漿后煮至70 ℃以沉淀蛋白質(zhì)，上清液用定性濾紙過濾后煮沸15 min，然后在室溫下5 000 r/min離心30 min，再次過濾取上清液，每升上清液中添加終濃度0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（0.056 mol/L KH2PO4、0.044 mol/L K2HPO4，pH 6.6）、0.02 mol/L氧化三甲胺、0.4 mmol/LL-半胱氨酸、0.3 mmol/LL-甲硫氨酸，最后經(jīng)121 ℃高壓滅菌制備成滅菌魚汁。將活化后培養(yǎng)至穩(wěn)定期的WT和KO菌株按照體積分?jǐn)?shù)1‰接種于滅菌魚汁中，置于4 ℃生化培養(yǎng)箱。采用半微量定氮法測定魚汁中的TVB-N生成量，采用苦味酸法測定魚汁中的TMA生成量[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 波羅的海希瓦氏菌SB-19株hfq基因的鑒定與表達(dá)規(guī)律

Hfq在革蘭氏陰性和陽性菌中均有分布，是一個結(jié)構(gòu)保守的蛋白質(zhì)[9]。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)本地BLAST比對后從波羅的海希瓦氏菌SB-19株中篩選到1個Hfq，且其與目前已報(bào)道的波羅的海希瓦氏菌完全一致（圖1A），與奧奈達(dá)希瓦氏菌、腐敗希瓦氏菌以及大腸桿菌的Identity值分別為97.8%、98.9%和75.6%，這說明波羅的海希瓦氏菌hfq基因是一個結(jié)構(gòu)保守的基因。Hfq最早發(fā)現(xiàn)為大腸桿菌Qβ噬菌體在RNA復(fù)制過程中所必需的一種宿主因子，隨后又證實(shí)Hfq對細(xì)菌的生理活動大有裨益，如提高細(xì)菌的耐熱能力，hfq基因缺失株則表現(xiàn)出較低的環(huán)境適應(yīng)能力和抗逆能力等[22]。由此推測波羅的海希瓦氏菌SB-19株的hfq基因可能具有類似的生物學(xué)功能。

圖1 Hfq氨基酸序列比對（A）和hfq基 因表達(dá)水平在波羅的海希瓦氏菌生長期間的變化規(guī)律（B）Fig.1 Amino acid sequence alignment of Hfq (A) and relative expression level of hfq gene determined by qPCR in S.baltica during a 24 h culture period (B)

為分析波羅的海希瓦氏菌SB-19株hfq基因的功能，檢測其在遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期這3個重要的細(xì)菌生長階段的表達(dá)水平。由圖1B可知，在細(xì)菌培養(yǎng)至4 h的延緩期，hfq基因表達(dá)水平尚未發(fā)生顯著變化；在細(xì)菌進(jìn)入對數(shù)生長時期第8小時，hfq基因表達(dá)水平較起始提高了1 倍；此后hfq基因的表達(dá)水平持續(xù)升高，直至穩(wěn)定期第24小時，hfq基因表達(dá)水平較起始提高了3.7 倍。該現(xiàn)象與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和嗜肺軍團(tuán)菌（Legionella pneumophila）類似，hfq基因表達(dá)水平會隨著這兩種細(xì)菌生長時期的推進(jìn)而提高[23-24]。這說明hfq基因在波羅的海希瓦氏菌SB-19株生長的對數(shù)期和穩(wěn)定期發(fā)揮重要作用。

2.2 hfq基因缺失對波羅的海希瓦氏菌SB-19株生長速率的影響

WT株在30 ℃培養(yǎng)條件下生長迅速，一般在20 h左右即可進(jìn)入穩(wěn)定期，其最大比生長速率（μmax）為0.203 7，穩(wěn)定期的最大細(xì)菌數(shù)為8.31f0.11（lg（CFU/mL））。hfq基因KO株在30 ℃培養(yǎng)條件下，其生長曲線與WT株接近，只是在對數(shù)期的生長速率相對略低，其μmax為0.170 5，穩(wěn)定期的最大細(xì)菌數(shù)為8.25f0.12（lg（CFU/mL）），與WT株的細(xì)菌密度無顯著性差異（圖2A）。Brennan等[14]發(fā)現(xiàn)奧奈達(dá)希瓦氏菌中，hfq基因的缺失會導(dǎo)致突變株的生長速率變慢，穩(wěn)定期的細(xì)菌密度降低；但Bohn等[16]觀察到金黃色葡萄球菌的hfq基因突變株生長速率與對照組接近。表明hfq基因在不同菌株內(nèi)發(fā)揮不同程度的生物學(xué)效應(yīng)，而當(dāng)波羅的海希瓦氏菌SB-19株處于最佳生長條件下，hfq基因?yàn)榉潜匾蜃印?/p>

在4 ℃低溫培養(yǎng)條件下，WT株生長速率顯著降低，μmax為0.030 1，但其穩(wěn)定期的最大細(xì)菌數(shù)（8.16f 0.13（lg（CFU/mL）））接近于30 ℃培養(yǎng)條件。然而KO株在4 ℃低溫培養(yǎng)條件下生長速率更低，其μmax僅為0.010 2，且穩(wěn)定期的最大細(xì)菌數(shù)較相同條件下WT株降低了約2個數(shù)量級（圖2B）。此結(jié)果提示hfq基因有助于波羅的海希瓦氏菌SB-19株抵御低溫脅迫，即該基因可能參與細(xì)菌的抗環(huán)境脅迫過程。

圖2 WT株和KO株在30 ℃（A）和4 ℃（B）的生長曲線Fig.2 Growth curves of WT and KO strains at 30 (A) and 4 ℃ (B)

2.3 hfq基因?qū)Σ_的海希瓦氏菌SB-19株信號分子分泌和群體感應(yīng)的影響

波羅的海希瓦氏菌在生長過程中會產(chǎn)生群體感應(yīng)現(xiàn)象，其分泌的信號分子DKPs和AI-2均調(diào)控細(xì)菌的群體感應(yīng)過程[8,17]。DKPs是由兩個氨基酸經(jīng)肽鍵連接而成的環(huán)二肽，存在于細(xì)菌、放線菌、真菌等，具有抗菌、神經(jīng)保護(hù)、免疫抑制等多種生物學(xué)活性和藥理學(xué)活性[25]。在細(xì)菌30 ℃培養(yǎng)的最初6 h，WT株和KO株的DKPs生成量非常接近，培養(yǎng)12 h，WT株的DKPs生成量達(dá)到（10.46f 0.34）μg/mL，顯著高于KO株的（9.21f0.32）μg/mL（圖3A）；而此時WT株的細(xì)菌數(shù)（6.65f0.20（lg（CFU/mL）））也高于KO株（6.41f0.21（lg（CFU/mL）））（圖2A），所以WT株與KO株之間DKPs的差異可能是由細(xì)菌數(shù)量的不同所造成。隨著培養(yǎng)時間的延長（18 h和24 h），細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定期，此時細(xì)菌對DKPs的消耗量大于生成量，培養(yǎng)液中DKPs含量逐漸降低，KO株的DKPs生成量略高于WT株，無顯著差異，這說明hfq基因不參與信號分子DKPs的分泌過程。AI-2在革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌中均有發(fā)現(xiàn)，是細(xì)菌種間交流的信號分子，參與生物被膜形成等群體感應(yīng)現(xiàn)象[26]。WT株和KO株在24 h內(nèi)均以接近水平生成AI-2，且KO株AI-2水平在12～24 h期間略高于WT株（圖3B），這表明hfq基因同樣不參與信號分子AI-2的分泌過程。

圖3 WT株和KO株分泌信號分子DKPs（A）和AI-2（B）的水平Fig.3 Levels of DKPs (A) and AI-2 (B) secreted by WT and KO strains

生物被膜是微生物在附著表面分泌的帶有黏性基質(zhì)的胞外聚合物，有助于增強(qiáng)微生物抵御環(huán)境脅迫的能力[27]。經(jīng)培養(yǎng)24 h后，WT株的生物被膜形成量高于KO株，且二者存在顯著差異（P＜0.05）（表2），說明hfq基因參與波羅的海希瓦氏菌SB-19株的生物被膜形成過程。在單核細(xì)胞性李斯特菌中也有類似現(xiàn)象，其hfq基因缺失株不僅表現(xiàn)為生物被膜形成能力降低，而且對小鼠的致毒能力也明顯下降[13]；嗜水氣單胞菌有2個hfq基因拷貝，hfq2基因缺失株會表現(xiàn)出生物被膜形成能力的降低[28]，推測hfq基因參與細(xì)菌的群體感應(yīng)調(diào)控通路，與其生物被膜的形成密切相關(guān)。

腐敗菌通過分泌胞外蛋白酶水解水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)和氨基酸，以獲取自身繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)，這進(jìn)而加劇水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)。在波羅的海希瓦氏菌中添加信號分子DKPs會促進(jìn)細(xì)菌胞外蛋白酶的活性和增強(qiáng)致腐能力[17]。在本實(shí)驗(yàn)中，WT株和KO株經(jīng)培養(yǎng)24 h后，WT株的胞外蛋白酶水解圈直徑顯著大于KO株（P＜0.05）（表2），說明hfq基因也參與了波羅的海希瓦氏菌SB-19株的胞外蛋白酶分泌過程，即Hfq調(diào)控該菌的群體感應(yīng)事件，但不參與信號分子的分泌過程。

表2 培養(yǎng)24 h WT株和KO株的生物被膜和胞外蛋白酶水解活力Table 2 Biofilm formation ability and extracellular protease activity of WT and KO strains

2.4 hfq基因?qū)Σ_的海希瓦氏菌SB-19株抗逆境能力的影響

在單核細(xì)胞性李斯特菌中，hfq基因的缺失會導(dǎo)致突變株對高鹽、乙醇、H2O2的適應(yīng)能力顯著降低[29]，大腸桿菌中hfq基因的缺失也會降低其抗紫外線能力[15]。與對照組相比，在NaCl暴露條件下，2 g/100 mL NaCl略微促進(jìn)了WT株和KO株的生長，而隨著NaCl質(zhì)量濃度的提高，WT株和KO株菌株密度均降低，且KO株始終低于WT株（圖4A）。在營養(yǎng)脅迫條件下，當(dāng)LB營養(yǎng)肉湯添加量為1/2時，WT株與KO株的OD600nm分別較對照組減少了19.07%與62.87%；隨著LB營養(yǎng)肉湯含量的持續(xù)降低，WT株與KO株的OD600nm持續(xù)降低，但KO株始終低于WT株（圖4B）。在重金屬脅迫條件下，0.05 mmol/L Cu2+不影響WT株的密度，但此時KO株OD600nm較對照組降低了33.31%；當(dāng)Cu2+濃度繼續(xù)升高，WT株也表現(xiàn)出密度降低，只是相同條件下其OD600nm高于KO株（圖4C）。在消毒劑脅迫條件下，0.1 g/100 mL NaClO不干擾WT株的生長，而此時KO株非常敏感，密度較對照組降低了75.31%；NaClO質(zhì)量濃度為0.15 g/100 mL時，WT株OD600nm較對照組降低了60.90%，KO株此時幾乎不生長（圖4D）。上述結(jié)果表明，Hfq參與了波羅的海希瓦氏菌SB-19株對鹽分、營養(yǎng)、重金屬、消毒劑等脅迫環(huán)境的適應(yīng)過程，推測其通過影響sRNA與mRNA二者之間的結(jié)合來調(diào)節(jié)抗逆基因翻譯或蛋白質(zhì)降解，從而改變細(xì)菌的環(huán)境適應(yīng)能力，hfq基因缺失降低了波羅的海希瓦氏菌SB-19株的抗逆境能力。

圖4 WT株和KO株抗NaCl（A）、營養(yǎng)（B）、重金屬Cu2＋（C）和NaClO（D）脅迫Fig.4 Resistance of WT and KO strains to salt (A), nutrient (B), heavy metal (C), and disinfectant (D)

2.5 hfq基因?qū)Σ_的海希瓦氏菌SB-19株致腐能力的影響

水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)在腐敗過程中被分解為氨和胺類等堿性含氮物質(zhì)，即TVB-N；海水魚富含TMAO，在腐敗菌作用下TMAO脫氧還原成有臭味的TMA，因此TVB-N和TMA含量已成為鑒定水產(chǎn)品腐敗的重要指標(biāo)[2]。在4 ℃冷藏條件下，接種WT株和KO株的滅菌魚汁內(nèi)TVB-N和TMA含量隨著培養(yǎng)時間的延長而持續(xù)增加。在培養(yǎng)3 d，接種WT株的魚汁內(nèi)TVB-N質(zhì)量濃度達(dá)到（35.55f 3.32）mg/100 mL，超過了30 mg/100 mL的感官可接受閾值[30]；接種KO株的魚汁在培養(yǎng)第4天時超過此閾值，且其所產(chǎn)生TVB-N含量始終低于同一時期WT株（圖5A）。TMA生成規(guī)律與TVB-N相似，接種WT株的滅菌魚汁在相同培養(yǎng)時間始終高于KO株（圖5B）；上述TVB-N和TMA含量的變化說明hfq基因缺失后波羅的海希瓦氏菌SB-19株的致腐能力也相應(yīng)減弱。hfq基因缺失削弱了波羅的海希瓦氏菌SB-19株的致腐能力。

圖5 接種WT株或KO株滅菌魚汁的TVB-N（A）和TMA（B）生成量Fig.5 Levels of TVB-N (A) and TMA (B) in sterilized fish juice inoculated with WT or KO strain

Hfq在RNA翻譯水平存在正負(fù)兩種調(diào)控途徑：1）負(fù)向調(diào)控：Hfq與調(diào)控靶標(biāo)mRNA的sRNA結(jié)合，阻止靶標(biāo)mRNA在核糖體就位，進(jìn)而阻礙靶標(biāo)mRNA的翻譯；有些靶標(biāo)mRNA的5’非翻譯區(qū)堿基發(fā)生自我配對形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，也會阻礙靶標(biāo)mRNA的翻譯；2）正向調(diào)控：Hfq與調(diào)控靶標(biāo)mRNA的sRNA結(jié)合，形成的復(fù)合體阻止靶標(biāo)mRNA在5’非翻譯區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，保證后續(xù)的翻譯順利進(jìn)行[10]。哈維氏弧菌中Hfq以負(fù)向調(diào)控方式發(fā)揮作用：當(dāng)細(xì)胞密度較低時，Qrr1-5產(chǎn)生的sRNA在Hfq作用下會抑制受體蛋白LuxR的表達(dá)；當(dāng)細(xì)胞密度較高時，qrr基因不發(fā)生表達(dá)，失去Hfq抑制的LuxR結(jié)合信號分子，進(jìn)而激活下游的群體感應(yīng)事件，如誘導(dǎo)細(xì)菌發(fā)出熒光[12]。對于波羅的海希瓦氏菌SB-19 WT株，隨著細(xì)菌密度的增加，其所分泌的信號分子水平升高，hfq基因表達(dá)水平也隨之上升，細(xì)菌表現(xiàn)出的群體感應(yīng)現(xiàn)象和滅菌魚汁的腐敗程度愈發(fā)明顯；而對于KO株，隨著細(xì)菌密度的增加，雖然其分泌的信號分子水平與WT株接近，但其群體感應(yīng)和滅菌魚汁的腐敗程度卻低于同時期的WT株，這說明波羅的海希瓦氏菌SB-19株的Hfq以正向調(diào)控方式發(fā)揮作用，這為今后研究海產(chǎn)品中特定腐敗菌的致腐能力奠定了理論基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

波羅的海希瓦氏菌SB-19株中存在一個hfq基因，且該基因表達(dá)水平隨著細(xì)菌的生長而升高；在4 ℃培養(yǎng)條件下，與WT株相比，KO株的生長速率明顯遲滯且穩(wěn)定期細(xì)菌密度較低，顯示hfq基因在波羅的海希瓦氏菌SB-19株的生長對數(shù)期和穩(wěn)定期發(fā)揮重要作用。WT株與KO株所分泌信號分子DKPs和AI-2水平接近，可見hfq基因不參與信號分子的分泌過程；然而，KO株卻表現(xiàn)為更低的生物被膜形成能力和胞外蛋白酶活性；接種KO株的滅菌魚汁也產(chǎn)生較少的TVB-N和TMA，說明Hfq正向調(diào)控波羅的海希瓦氏菌的群體感應(yīng)事件，但不參與信號分子的分泌過程。此外，KO株對鹽分、營養(yǎng)、重金屬、消毒劑等脅迫條件更為敏感，推測Hfq通過影響sRNA與mRNA二者之間的結(jié)合來調(diào)節(jié)抗逆基因的翻譯或蛋白質(zhì)的降解，從而改變細(xì)菌的環(huán)境適應(yīng)能力。綜上所述，波羅的海希瓦氏菌SB-19株中Hfq是一個全局性調(diào)控因子，整體調(diào)節(jié)該菌的諸多生理活動。本實(shí)驗(yàn)為波羅的海希瓦氏菌的基礎(chǔ)生物學(xué)研究和海產(chǎn)品微生物的致腐機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。