超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法定量分析云南大葉種茶酚類成分

施麗娟，陳 寧，王 丹，范曉偉，胡永丹，易倫朝，任達(dá)兵*

（昆明理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650500）

中國(guó)是全世界最大的茶葉生產(chǎn)國(guó)，2020年茶葉產(chǎn)量達(dá)到297.00萬 t[1]。其中，云南省2020年的茶葉產(chǎn)量高達(dá)46.60萬 t，占全國(guó)茶葉總產(chǎn)量的15.70%[2]。不同于其他茶葉產(chǎn)區(qū)，云南茶葉主要采用其特有的大葉種茶（Camellia sinensisvar.assamica）的鮮葉作為原料。研究表明，大葉種茶比小葉種茶具有更高含量的茶多酚，尤其是兒茶素類成分[3]。云南產(chǎn)區(qū)主要生產(chǎn)綠茶、紅茶和普洱茶（生茶和熟茶）。

滋味是評(píng)價(jià)茶葉風(fēng)味和品質(zhì)的關(guān)鍵因子，且與兒茶素、酚酸、黃酮等酚類成分之間存在密切關(guān)系[4]。研究表明，茶湯苦味和澀味的強(qiáng)度與酚類成分的總含量呈正相關(guān)[5]。非酯型兒茶素是茶湯苦味的主要貢獻(xiàn)者，而酯型兒茶素、黃酮醇糖苷和單寧是主要的澀味成分[6]。此外，黃酮醇苷能夠增強(qiáng)咖啡堿的苦味，沒食子酸和茶沒食子素則對(duì)茶湯鮮味起到增強(qiáng)作用[7-9]。茶黃素類成分是形成紅茶湯色“透亮”和提高茶湯鮮爽度的重要成分[10-11]。不同類型的茶葉由于加工工藝不同而導(dǎo)致內(nèi)含成分的組成和含量存在較大差異。鑒于多酚類成分對(duì)茶葉滋味品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)活性具有關(guān)鍵作用，定量剖析不同類型茶葉中酚類成分組成和含量的差異具有重要意義。

超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupoletandem mass spectrometry，UPLC-QQQ-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)是化學(xué)成分定量分析的強(qiáng)大工具。UPLC-QQQ-MS/MS具有分析時(shí)間短、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，非常適合于多類成分及低含量成分的準(zhǔn)確定量分析。目前，該技術(shù)已成功應(yīng)用于柑橘、豆類、葡萄酒、茶葉樣本中酚類成分的準(zhǔn)確定量分析[12-15]。盡管UPLC-QQQ-MS/MS在定量分析方面具有諸多優(yōu)勢(shì)，但利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)茶葉中兒茶素、酚酸以及黃酮等酚類成分同時(shí)定量分析的研究尚比較缺乏。

本研究旨在建立一種能夠同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定茶葉中不同類別多個(gè)酚類成分的UPLC-QQQ-MS/MS定量分析方法。在此基礎(chǔ)上，對(duì)不同類型云南大葉種茶葉樣本（綠茶、紅茶、普洱生茶、普洱熟茶）酚類成分的組成和圖譜進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，最終揭示不同類型茶葉在酚類成分上的特征及差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉樣本采自于云南省的5個(gè)主要茶產(chǎn)區(qū)，包括西雙版納、臨滄、普洱、保山和大理。共99 份樣本，包括綠茶34個(gè)，紅茶26個(gè)，普洱生茶20個(gè)，普洱熟茶19個(gè)。茶葉樣本經(jīng)過干燥后，粉碎并過60 目篩濾后，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

甲酸（質(zhì)譜級(jí)）、乙腈（質(zhì)譜級(jí)）、甲醇（分析級(jí)）德國(guó)Merck公司；本工作共采用90個(gè)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品由慧嘉生物科技有限公司、成都曼斯特生物科技有限公司、西寶生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Nexera XR超高效液相色譜儀、LCMS-8040三重四極桿質(zhì)譜儀 日本島津公司；FSJ-A05B1粉碎機(jī) 廣東小熊電器有限公司；FAMO-10F超濾型超純水機(jī) 南京權(quán)坤生物科技有限公司；SK5200BT超聲儀器 上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；MS105DU電子分析天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL-16M超速離心機(jī) 湘儀儀器有限公司；100～1 000 μL手動(dòng)移液槍 德國(guó)艾本德股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混標(biāo)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取90個(gè)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品各1.5 mg于2 mL離心管中，加入適量70%甲醇溶液溶解。將離心管中的溶液轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加入70%甲醇溶液定容后獲得質(zhì)量濃度為300 μg/mL的混標(biāo)儲(chǔ)備液，置于冰箱中避光保存待用。

1.3.2 樣品制備

參考課題組前期優(yōu)化的方法[16]，準(zhǔn)確稱取茶葉粉末0.1 g置于5 mL離心管中，加入4 mL 70%甲醇溶液后50 ℃超聲提取30 min。將提取液10 000 r/min離心10 min后，吸取上清液并利用UPLC流動(dòng)相稀釋10 倍。取適量過0.22 μm有機(jī)濾膜后用于UPLC-QQQ-MS/MS分析。

1.3.3 UPLC-QQQ-MS/MS條件

色譜儀主要由UPLC分離系統(tǒng)和三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)串聯(lián)組成。其中，UPLC系統(tǒng)包括二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱等模塊。

UPLC條件：ACQUITY UPLC?HSS C18色譜柱（100 mmh 2.1 mm，1.8 μm），柱溫35 ℃，進(jìn)樣量1 μL。流動(dòng)相為0.1%甲酸（A）和乙腈（B），流速0.3 mL/min，梯度洗脫：0～1 min，90%～87% A，10%～13% B；1～2 min，87%～83% A，13%～17% B；2～3 min，83%～80% A，17%～20% B；3～8 min，80%～75% A，20%～25% B；8～9 min，75%～68% A，25%～32% B；9～12 min，68%～55% A，32%～45% B；12～16 min，55%～50% A，45%～50% B。

MS條件：電噴霧離子源，采用負(fù)離子模式下的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multi-reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行質(zhì)譜掃描。優(yōu)化后的離子源參數(shù)如下：干燥氣流速6 L/min，吹掃氣流速1.5 L/min，接口電壓4.5 kV，碰撞誘導(dǎo)解離氣壓230 kPa，離子傳輸管溫度250 ℃，加熱板溫度400 ℃，檢測(cè)電壓2.08 kV。

1.3.4 方法學(xué)考察

考察包括標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限、精密度和加標(biāo)回收率。儲(chǔ)備液用70%甲醇溶液稀釋不同倍數(shù)，獲得不同質(zhì)量濃度的混標(biāo)溶液（0.01～300 μg/mL），然后進(jìn)行UPLC-QQQ-MS/MS分析。以目標(biāo)物實(shí)際質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，通過回歸擬合獲得各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢出限和定量限分別以信噪比3 倍和10 倍進(jìn)行計(jì)算。精密度包括日內(nèi)和日間精密度，選取高（100 μg/mL）、中（10 μg/mL）、低（0.5 μg/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度的混標(biāo)溶液，分別在1 d內(nèi)（6次）和5 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣（6次/d）。計(jì)算各成分含量的日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，用以表征日內(nèi)和日間精密度。采用樣品加標(biāo)回收法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，即將高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的混標(biāo)溶液加入茶葉樣品中進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定加入標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度，然后通過比較實(shí)際質(zhì)量濃度和測(cè)定質(zhì)量濃度計(jì)算回收率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)由儀器自帶的Labsolution軟件（Shimadzu,Japan）完成，經(jīng)峰面積提取、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等步驟后，最終獲得各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度（mg/mL）。根據(jù)稀釋倍數(shù)、提取溶液體積和干茶粉末加入量，將質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)化為茶葉中的目標(biāo)物的含量（mg/kg，干質(zhì)量）。

使用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05，差異顯著。應(yīng)用MetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.ca）進(jìn)行偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法建立

如圖1A所示，乙腈能夠提供更好的分離性能，目標(biāo)物彼此之間能夠有效分開。此外，絕大部分目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)隨甲酸體積分?jǐn)?shù)（0.05%～0.5%）的增大而降低（圖1B）。其中，甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)洗脫色譜峰的數(shù)量達(dá)到最多，因此確定該體積分?jǐn)?shù)為最佳。當(dāng)流速?gòu)?.2 mL/min增加到0.4 mL/min時(shí)，幾乎所有色譜峰的保留時(shí)間均減小，但過大的流速（0.4 mL/min）并不利于同分異構(gòu)體的分離。如圖1C所示，化合物43、44、45在流速為0.4 mL/min時(shí)不能獲得有效分離（分離度1.04），但流速為0.2 mL/min和0.3 mL/min時(shí)彼此之間的分離度有所改善（分離度1.48，1.2）。綜上，最佳流動(dòng)相組成為乙腈和水，添加劑為甲酸（0.1%），流速為0.3 mL/min，并基于此進(jìn)一步優(yōu)化洗脫梯度。

圖1 有機(jī)相（A）、甲酸體積分?jǐn)?shù)（B）、流動(dòng)相流速（C）對(duì)色譜-質(zhì)譜分離分析效果的影響Fig.1 Effects of organic phase (A), formic acid concentration (B) and flow rate of mobile phase (C) on the performance of UPLC-MS/MS analysis

對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)中的MRM模式進(jìn)行考察和優(yōu)化，包括檢測(cè)離子對(duì)的優(yōu)選、碰撞能量和檢測(cè)電壓的優(yōu)化等。以兒茶素為例，首先選擇離子掃描，確定其前體離子信息（m/z289.10）和碎裂電壓，然后通過子離子掃描，確定子離子為m/z245.10、123.10、109.00。根據(jù)離子的響應(yīng)強(qiáng)度和特異性，確定兒茶素的檢測(cè)離子對(duì)為m/z289.10→245.10和m/z289.10→123.10。實(shí)驗(yàn)過程中，每個(gè)酚類成分至少需要一個(gè)離子對(duì)，最終確定90個(gè)目標(biāo)物的共257個(gè)離子對(duì)。循環(huán)時(shí)間設(shè)置為0.8 s。

應(yīng)用優(yōu)化的UPLC-QQQ-MS/MS條件，成功對(duì)4類茶葉中的90個(gè)酚類成分進(jìn)行同時(shí)分離分析。結(jié)果如圖2所示，所有成分均能在16 min內(nèi)獲得有效分離。

圖2 兒茶素（A）、酚酸（B）、黃酮（C、D）的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of catechins (A), phenolic acids (B)and flavonoids (C, D)

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限、精密度和準(zhǔn)確度的測(cè)定結(jié)果如表1所示。兒茶素類、酚酸類、黃酮及其糖苷類化合物均在0.4～12 000 mg/kg內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（R2≥0.999 0）。檢出限和定量限分別為0.000 4～3.939 2 mg/kg與0.001 2～13.130 0 mg/kg，表明方法具有較高的靈敏度。日內(nèi)和日間精密度在高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度下分別為0.57%～19.83%、0.39%～20.00%，表明儀器的穩(wěn)定性較好。低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度下，目標(biāo)成分的回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在80.42%～118.92%和0.29%～19.94%之間，證明方法的準(zhǔn)確性較好。因此，本工作建立的UPLC-QQQ-MS/MS定量分析方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

表1 UPLC-QQQ-MS/MS方法的線性方程、相關(guān)系數(shù)（R2）、線性范圍、檢出限、定量限、日內(nèi)和日間精密度、回收率Table 1 Linear equations, correlation coefficients (R2), linear ranges, LOD, LOQ, intra-day and intra-day precision and recoveries of UPLC-QQQ-MS/MS method

續(xù)表1

2.3 云南大葉種茶酚類成分含量分析

應(yīng)用建立的UPLC-QQQ-MS/MS方法，對(duì)云南產(chǎn)4類茶葉（綠茶、紅茶、普洱生茶和普洱熟茶）90個(gè)成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量和比較分析，結(jié)果如表2所示。本工作共檢測(cè)出62種酚類成分，包括兒茶素類16種，酚酸類18種，黃酮類28種。對(duì)于未檢測(cè)到的28種成分，可能是因?yàn)槠浜窟h(yuǎn)低于檢出限，或者四類茶葉中不存在這些成分。結(jié)果表明，檢出成分在不同類型茶葉中的含量分布范圍較廣，含量介于4.06～86 088.96 mg/kg之間。如圖3所示，三類酚性成分的總含量（單個(gè)成分含量的加和）均在未發(fā)酵茶（綠茶或普洱生茶）中最高，而在紅茶和普洱熟茶中的含量相對(duì)較低（紅茶＞普洱熟茶）。眾多研究表明，無論是依靠?jī)?nèi)源酶的全發(fā)酵（紅茶）還是微生物參與的后發(fā)酵（普洱熟茶），均能顯著降低茶葉酚類成分的含量[5,17-18]。本研究的準(zhǔn)確定量結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論，且酚類成分的含量在微生物參與的后發(fā)酵過程中下降幅度更大。

表2 茶葉樣本中檢測(cè)到的酚類成分含量Table 2 Contents of phenolic compounds detected in tea samples

圖3 四類云南大葉種茶中總兒茶素、總酚酸和總黃酮含量比較Fig.3 Comparison of contents of total catechins, total phenolic acids and total flavonoids in four types of Yunnan large-leaf tea

兒茶素是茶葉中高含量成分和主體呈味物質(zhì)，其中非酯型兒茶素是茶湯苦味的主要來源，而酯型兒茶素是主要的澀味成分[19-20]。本工作測(cè)定了簡(jiǎn)單兒茶素、酯型兒茶素、原花青素和茶黃素4個(gè)子類共16個(gè)兒茶素類成分的含量。如表2所示，兒茶素化合物的組成和含量分布方面，綠茶和普洱生茶之間較為相似，而紅茶和普洱熟茶比較接近。除茶黃素類成分在紅茶中具有更高的含量外，其余成分在綠茶和普洱生茶中的含量均更高。其中，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（9，化合物編號(hào)，下同）和表兒茶素沒食子酸酯（6）分別為綠茶（86 088.96 mg/kg）和普洱生茶（70 291.34 mg/kg）中含量最高的成分。紅茶和普洱熟茶中含量最高的兒茶素類成分則分別為表兒茶素沒食子酸酯（6，5 498.38 mg/kg）和表兒茶素（3，2 557.96 mg/kg）。茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯（13，5 394.34 mg/kg）在紅茶中的含量也較高，研究表明，茶黃素主要來源于紅茶發(fā)酵過程中簡(jiǎn)單和酯型兒茶素的氧化聚合反應(yīng)[21-22]，本工作進(jìn)一步表明該類成分是紅茶的特征性成分。原花青素是兒茶素（2）和表兒茶素（3）的低聚體，具有澀味且呈味持久性較好，主要存在于綠茶和普洱生茶中[23-24]，其中原花青素B2（15）的含量最高（4 376.00 mg/kg和4 021.22 mg/kg）。整體看來，未發(fā)酵茶（綠茶和普洱生茶）具有更豐富的兒茶素類成分，這也是兩類茶葉比紅茶和普洱熟茶具有更強(qiáng)苦澀味的重要原因。

酚酸類成分在四類茶葉中呈現(xiàn)明顯不同的含量分布特征，結(jié)果如表2所示。首先，七葉亭（30）僅在紅茶（428.55 mg/kg）樣本中檢出。沒食子酸（29）、水楊酸（22）、原兒茶酸（24）和對(duì)香豆酸（28）等簡(jiǎn)單酚酸均在紅茶或普洱熟茶中具有更高的含量。沒食子酸是普洱熟茶中含量最高的酚類成分（8 235.20 mg/kg），同時(shí)在紅茶中的含量也較高（5 249.05 mg/kg）。研究表明，普洱熟茶渥堆發(fā)酵過程中，沒食子酸、水楊酸、原兒茶酸等苯甲酸衍生物的含量能夠顯著升高[25]。酯型兒茶素（如表沒食子兒茶素沒食子酸酯，9）和酚酸酯化物（如沒食子素，38）等成分在單寧酶的作用下發(fā)生降解是導(dǎo)致該類成分含量增加的重要原因之一[26-27]。相比之下，簡(jiǎn)單酚酸的酯化產(chǎn)物和糖基化產(chǎn)物，如沒食子酸甲酯（32）、松柏苷（37）、沒食子素和綠原酸（39），均在綠茶或普洱生茶中具有更高的含量。紅茶或普洱熟茶發(fā)酵的過程中，該類成分的糖苷鍵或酯鍵可能發(fā)生斷裂，降解生成沒食子酸等簡(jiǎn)單酚酸類成分。

黃酮及其糖苷類成分不僅是茶湯湯色的重要組成部分，而且黃酮糖苷對(duì)茶湯的苦味亦有重要貢獻(xiàn)[8]。測(cè)定的黃酮類化合物主要包括游離黃酮醇、黃酮C-糖苷和黃酮O-糖苷，它們?cè)?類茶葉中的含量分布并不一致（表2）。綠茶、普洱生茶、紅茶和普洱熟茶中的含量最高的該類成分均為矢車菊素雙葡糖苷（87），含量分別為18 163.64、20 185.00、9 149.42 mg/kg和3 650.25 mg/kg。黃酮糖苷整體上在綠茶和普洱生茶中具有更高含量。例如，蘆?。?4）在綠茶和普洱生茶中的含量分別為4 619.80 mg/kg和4 674.54 mg/kg，顯著高于紅茶（2 350.63 mg/kg）和普洱熟茶（1 027.89 mg/kg）。相比之下，游離黃酮如山柰酚（51）、槲皮素（53）和楊梅素（57）的含量在紅茶和普洱熟茶中的含量更高。上述結(jié)果表明，黃酮糖苷在綠茶和普洱生茶的加工中較穩(wěn)定，但紅茶和普洱熟茶的發(fā)酵過程中容易發(fā)生降解，進(jìn)而產(chǎn)生山柰酚、槲皮素和楊梅素等游離黃酮。

2.4 四類云南大葉種茶的判別分析

基于62個(gè)化合物的準(zhǔn)確含量數(shù)據(jù)集，進(jìn)一步應(yīng)用PLS-DA建立能夠區(qū)分4類茶葉的分類模型。PLS-DA判別模型如圖4A所示，R2、Q2和準(zhǔn)確率分別為0.87、0.83、0.91，表明模型具有良好的可靠性和準(zhǔn)確性。如圖4A所示，普洱生茶與綠茶茶樣之間重疊較為嚴(yán)重，表明兩類茶葉在酚類成分的組成和含量上比較相近。除此之外，其余類型茶葉彼此之間均能獲得良好區(qū)分，表明未發(fā)酵茶（綠茶和普洱生茶）、紅茶和普洱熟茶在酚類成分的組成和含量上存在較大差異。綠茶和普洱生茶在加工過程中都采用高溫使酶失活，導(dǎo)致僅有極少酚類成分發(fā)生氧化聚合反應(yīng)，大部分酚類成分被保留下來。加工工藝的相似性是導(dǎo)致普洱生茶與綠茶的化學(xué)成分組成比較相近的主要原因。

圖4 云南大葉種茶的PLS-DA（A）和差異性成分篩選結(jié)果（B、C）Fig.4 PLS-DA analysis (A) and identification (B and C) of differential components among four types of Yunnan large-leaf tea

基于PLS-DA分類模型，采用變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）法篩選能夠區(qū)分4類茶葉的潛在化學(xué)標(biāo)志物。以VIP值大于1.5為標(biāo)準(zhǔn)（圖4B）[28]，篩選出槲皮素（53）、七葉亭（30）、水楊酸（22）、茶黃素-3-沒食子酸酯（11）、茶黃素-3’-沒食子酸酯（12）、原兒茶醛（21）、茶黃素（10）、楊梅素（57）、異鼠李素（56）、茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯（13）、牡荊素（61）共11個(gè)差異性成分。如圖4C所示，茶黃素、茶黃素-3-沒食子酸酯、茶黃素-3’-沒食子酸酯、茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯、水楊酸和七葉亭在紅茶中含量較高，可作為區(qū)分紅茶和其他類型茶葉的標(biāo)志物群。槲皮素、原兒茶醛、楊梅素、異鼠李素和牡荊素在普洱熟茶中的含量較高，而在其他幾類茶葉中含量相對(duì)較低。

由于多類分類模型無法將綠茶和普洱生茶進(jìn)行有效區(qū)分，進(jìn)一步應(yīng)用PLS-DA對(duì)兩類茶葉建立兩兩分類模型。如圖5A所示，PLS-DA模型的R2、Q2和準(zhǔn)確率分別為0.80、0.62、0.92，表明模型具有良好的可靠性和準(zhǔn)確性，以VIP值大于1.5作為篩選條件（圖5B），共篩選出綠原酸（39）、松柏苷（37）、表沒食子兒茶素（4）、楊梅素（57）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（8）、異夏佛塔苷（74）、隱綠原酸（40）、山柰酚（51）共8個(gè)差異成分。如圖5C所示，松柏苷、表沒食子兒茶素、楊梅素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、異夏佛塔苷、山柰酚在綠茶中含量普遍更高，而綠原酸、隱綠原酸在普洱生茶中含量高于綠茶。

圖5 綠茶和普洱生茶的PLS-DA模型（A）和差異性成分篩選結(jié)果（B、C）Fig.5 PLS-DA analysis (A) and identification (B and C) of differential components between green tea and Pu-erh raw tea

3 結(jié) 論

基于UPLC-QQQ-MS/MS技術(shù)，建立一種能夠在16 min內(nèi)同時(shí)對(duì)茶葉中90種酚類成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量的分析方法。該方法具有較寬的線性范圍（0.4～12 000 mg/kg，R2≥0.999 0），檢出限和定量限分別為0.000 4～3.939 2 mg/kg和0.001 2～13.130 0 mg/kg，日內(nèi)和日間精密度分別為0.57%～19.83%和0.39%～20.00%，加標(biāo)回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為80.42%～118.92%和0.29%～19.94%，證明所建方法具有良好的線性范圍、精密度和準(zhǔn)確度。上述方法成功應(yīng)用于4類云南大葉種茶中酚類成分的準(zhǔn)確定量分析。結(jié)果表明綠茶、紅茶、普洱生茶和普洱熟茶在酚類成分的組成和含量存在巨大差異。絕大部分酚類成分在未發(fā)酵茶（綠茶或普洱生茶）中含量較高，但游離酚酸、黃酮苷元和茶黃素在發(fā)酵茶（紅茶或普洱熟茶）的含量更高。利用PLS-DA建立了區(qū)分不同類型茶葉的判別模型，并篩選到可用于區(qū)分4類茶葉的系列化學(xué)標(biāo)志物?？傊?，本工作為茶葉中多個(gè)酚類成分的準(zhǔn)確定量提供了新方法，且定量比較研究有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)不同類型茶葉風(fēng)味品質(zhì)形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。