茅臺酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)的檢測及溯源

胡光源，陳宗校，楊理章，李永素，王和玉，王 莉*

（1.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 遵義 564501；2.中國貴州茅臺酒廠（集團）有限責(zé)任公司，貴州 遵義 564501）

酒糟是糧食用于釀酒后殘留的固態(tài)混合物，是白酒行業(yè)最主要的副產(chǎn)物。除水分外，酒糟中含有豐富的淀粉、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸和微量元素[1]，具有潛在的研究和應(yīng)用價值。然而目前酒糟的處理和應(yīng)用主要集中于提取蛋白質(zhì)、動物飼料、丟糟酒、調(diào)味品、纖維素、食用菌培養(yǎng)基、乙醇燃料等的粗加工[2]及生產(chǎn)有機肥[3]等方面，關(guān)于酒糟中化學(xué)成分及其生物學(xué)功能的研究報道較少，通過對酒糟中生物活性物質(zhì)的發(fā)掘和研究，可提高酒糟的二次利用價值，實現(xiàn)利潤最大化。

生育酚和生育三烯酚統(tǒng)稱VE，是人體必需的脂溶性維生素[4-5]。VE是一種強有效的抗氧化劑，具有提高機體免疫力、延緩衰老、神經(jīng)保護、抑制膽固醇合成及腫瘤細胞生長、預(yù)防動脈硬化和心腦血管疾病等多種生理功能[6-7]。甾醇是一類以環(huán)戊烷多氫菲為骨架[8-9]，與膽固醇結(jié)構(gòu)相似，類似于維生素原性質(zhì)的活性物質(zhì)[10]，目前研究發(fā)現(xiàn)，甾醇具有降低膽固醇[11-12]、抗菌[8]、抗炎[11,13]、鎮(zhèn)痛[11]、抗癌[14]、抗腫瘤[15]、免疫調(diào)節(jié)[16]、抗氧化[17-18]、預(yù)防心血管疾病[19]、抑制乳腺增生[20]等多種生物學(xué)功能；三萜類化合物是一類基本母核由30個碳原子組成的萜類化合物，是一類重要的中藥化學(xué)成分，這類化合物具有溶血[21]、抗病毒[22]、降低膽固醇[23]、神經(jīng)保護[24]等活性。這3類活性物質(zhì)均在醫(yī)藥、食品、化妝品、化工、紡織等行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究擬建立超聲輔助提取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法分析酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類生物活性物質(zhì)的方法，在茅臺酒糟中發(fā)現(xiàn)生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)共18種，可為酒糟中生物活性物質(zhì)的高效利用和開發(fā)奠定基礎(chǔ)，同時也為酒糟的高附加值利用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茅臺酒糟、茅臺大曲，茅臺酒用高粱和小麥，均由貴州茅臺酒股份有限公司提供。

α-生育酚（純度95.5%）、γ-生育酚（純度≥96%）、麥角甾醇（純度≥95%）、豆甾醇（純度95%）、羊毛甾醇（純度≥93%） 美國Sigma公司；膽甾烷醇（純度≥98%） 美國Alfa Aesar公司；菜油甾醇（純度≥99%） 百靈威科技有限公司；正丁醇、乙醚（均為分析純），丙酮（色譜純）國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙醇、二氯甲烷、正己烷（均為色譜純） 美國Tedia公司；乙腈、乙酸乙酯（均為色譜純） 德國Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A/5975C GC-MS聯(lián)用儀、HP-5毛細管色譜柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；Mikro 220R型離心機 德國Hettich公司；8800超聲波清洗機 美國Branson公司；KS 260搖床 德國IKA公司；MS1602TS電子天平 瑞士梅特勒公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取5.00 g樣品（酒糟、大曲、高粱或小麥）于50 mL離心管中，加入適量提取溶劑，450 r/min搖床振蕩15 min混勻，超聲提取5 min，5 000 r/min離心5 min分層，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，4 ℃保存待測。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：HP-5毛細管色譜柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度60 ℃，以100 ℃/min升至300 ℃，保持16 min；采用恒流模式，載氣（He）流速1.0 mL/min，不分流進樣，進樣量1 μL，進樣口溫度300 ℃。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電子電離源：電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃。定性采用全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z35～500；溶劑延遲：5.0 min；定量采用選擇離子掃描模式（single ion monitor，SIM），每個化合物選擇1個定量離子，2～3個定性離子。

1.3.4 定量方法

用正丁醇配制7種標(biāo)準(zhǔn)品的混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2、1.3.3節(jié)的方法進樣分析，以質(zhì)量濃度-峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；將色譜峰信噪比大于3的質(zhì)量濃度確定為檢出限，信噪比大于10確定為定量限[25]。因本研究的重點是對酒糟中發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)進行定性和溯源分析，因三萜類物質(zhì)含量較低、且標(biāo)準(zhǔn)品價格昂貴，在不影響生物活性物質(zhì)溯源分析的前提下，只對部分化合物進行了精確定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取劑的選擇

不同溶劑對樣品中化學(xué)成分的提取效率不同，本研究按照1.3.1節(jié)方法，在提取劑體積為10 mL及其他條件恒定下，對比乙酸乙酯、丙酮、乙醚、正己烷、正丁醇、乙醇、二氯甲烷、乙腈、甲醇對酒糟中生育酚類和甾醇類物質(zhì)的提取效果，為了簡化，以7種物質(zhì)（標(biāo)準(zhǔn)品）的總峰面積作為衡量指標(biāo)。如圖1所示，極性溶劑的提取效果整體比非極性溶劑好，其中極性溶劑正丁醇的提取效果最好，乙酸乙酯和丙酮的提取效果相當(dāng)，而非極性的溶劑乙醚和正己烷的提取效果均較差，因此選擇正丁醇作為提取劑。

圖1 提取溶劑對提取效果的影響Fig.1 Effect of solvent type on extraction efficiency

2.1.2 提取劑用量的優(yōu)化

在其他條件恒定下，考察料液比對提取效果的影響，如圖2所示。采用不同料液比對目標(biāo)化合物進行提取時，提取效率會隨著料液比的減小而增加（提取效率/%=酒糟中7種定量化合物提取一次的總含量/酒糟中7種化合物的實際總含量×100），在料液比為1∶3（g/mL）時，提取效率最高，達到80%，然后趨于平衡，在料液比為1∶4和1∶5（g/mL）時，提取效率均保持在80%左右。盡管在料液比為1∶1（g/mL）時，提取效率只有45%左右，但因酒糟中目標(biāo)化合物的含量較低，為提高檢出限、定量的準(zhǔn)確性、方法的經(jīng)濟性與環(huán)保性，最終選擇目標(biāo)化合物的峰面積最高，提取溶劑為5 mL，作為最優(yōu)提取劑用量，即料液比為1∶1（g/mL）。

圖2 料液比對提取效果的影響Fig.2 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction efficiency

2.2 茅臺酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)的定性分析

采用上述優(yōu)化的條件對酒糟進行提取并經(jīng)GC-MS分析，通過質(zhì)譜信息和保留指數(shù)比對定性，共定性茅臺酒糟中5種生育酚類、9種甾醇類和4種三萜類生物活性物質(zhì)，見表1。

表1 茅臺酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)Table 1 Mass spectrometric parameters and retention indices of tocopherols, sterols and triterpenoids in Moutai distiller’s grains

文獻報道此類物質(zhì)均具有一定的生物活性功能，生育酚和生育三烯酚是VE的兩大亞族，均存在α、β、γ和δ四種同分異構(gòu)體[26]，其中4種生育酚均具有很強的抗氧化活性[27]，生育三烯酚則具有抗氧化、降膽固醇、抗炎和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[28]，其中在茅臺酒糟中發(fā)現(xiàn)的γ-生育三烯酚可以選擇性抑制結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展[29]；麥角甾醇是決定細胞流動性的真菌細胞膜的重要組成部分，其生物合成途徑是許多抗真菌劑的靶標(biāo)[30-31]；菜油甾醇是重要的制造藥物類固醇的前體[32]；豆甾醇具有免疫調(diào)節(jié)作用，在過敏性皮膚病的治療方面具有巨大潛力[33]；γ-谷甾醇具有降血脂作用[34]；羊毛甾醇是一種兩親分子，可有效阻礙晶狀體蛋白質(zhì)的聚集[35]，并具有抗生物膜活性和抗群體感應(yīng)活性的功能[36]；環(huán)阿屯醇具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗阿爾茨海默病等多種活性[37]，β-扶桑甾醇氧化物具有一定的抗瘧疾活性[38]；屬于三萜類的羽扇豆醇和5-麥谷蛋白-3-醇具有一定的抗癌活性[39]和良好的抗炎活性[40]；24-亞甲基環(huán)阿屯醇具有抗糖尿病作用[41]；乙酸羽扇醇酯具有與羽扇豆醇相似的生物活性和更高的生物利用度[42]，可促進皮膚修復(fù)，作為活性物質(zhì)用于治療皮膚灼傷[43]。因此，本研究在茅臺酒糟中發(fā)現(xiàn)18種生物活性物質(zhì)，不僅提高了對茅臺酒糟及茅臺酒中化學(xué)成分的認識，更為酒糟資源化利用提供了新思路。

2.3 茅臺酒糟中生育酚類和甾醇類物質(zhì)的定量分析2.3.1 方法評價

按照1.3節(jié)方法、2.1節(jié)優(yōu)化確定的條件及2.2節(jié)中各物質(zhì)的特征離子，對其中的7種化合物進行定量，具體結(jié)構(gòu)見圖3，并對同一個酒糟樣品進行連續(xù)6次相互獨立的測定，通過相對標(biāo)準(zhǔn)偏差考察方法的精密度；通過向樣品中添加適量標(biāo)準(zhǔn)品，并在優(yōu)化的條件下回收提取，測定加標(biāo)回收率（加標(biāo)回收率/%=（加標(biāo)酒糟提取的總含量-空白酒糟提取的總含量）/（加標(biāo)含量×單次提取率）h100），考察方法準(zhǔn)確度；將信噪比大于3的質(zhì)量濃度確定為檢出限，信噪比大于10確定為定量限。

圖3 7種定量物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of 7 quantitatively analyzed substances

如表2所示，7種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，R2均大于0.99；在重復(fù)性條件下連續(xù)進樣分析，酒糟中7種目標(biāo)物質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不高于6.40%，方法精密度較高；平行測定酒糟樣品和向其中加入已知濃度待測組分的加標(biāo)樣品，計算其加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收率在88.9%～102.3%之間，加入的被測組分量可定量回收，方法準(zhǔn)確度較高。

表2 方法評價指標(biāo)Table 2 Analytical figures of merit of the developed method

2.3.2 酒糟中生育酚類、甾醇類物質(zhì)的含量

酒糟中目標(biāo)物質(zhì)含量與第1次提取的量及提取率有關(guān)，本研究按上述優(yōu)化確定的方法測定了酒糟提取液中目標(biāo)物質(zhì)的含量，并對同一酒糟樣品進行反復(fù)提取，直至提取液中檢測不到任何目標(biāo)物質(zhì)。由于正丁醇對不同化合物的提取效果不同，具體提取次數(shù)和提取結(jié)果如表3所示。酒糟經(jīng)過3次提取后，儀器基本檢測不到膽甾烷醇和羊毛甾醇兩個化合物；而γ-生育酚、α-生育酚、麥角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇需提取8次，儀器才基本檢測不到。根據(jù)各提取液中目標(biāo)物的含量計算第1次提取率和在酒糟中的含量，7個目標(biāo)化合物的首次提取率在34.33%～58.74%，茅臺酒糟中7種生物活性物質(zhì)含量為0.85～133.09 mg/kg。

表3 酒糟中生育酚類和甾醇類物質(zhì)的提取結(jié)果Table 3 Effect of number of extraction cycles on contents of tocopherols and sterols in Moutai distiller’s grains

2.4 茅臺酒糟中生育酚、甾醇類和三萜類物質(zhì)的來源

茅臺酒糟以高粱為主要原料，經(jīng)過多輪次蒸煮和發(fā)酵，每個輪次加入適量大曲（以小麥為主要原料生產(chǎn)的高溫大曲），因此茅臺酒糟中的生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)可能來源于高粱、大曲（小麥）或生產(chǎn)過程的生化反應(yīng)。

表5 B班酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)含量跟蹤分析Table 5 Traceability analysis of tocopherols, sterols and triterpenoids contents in the distiller’s grains from class B

為研究茅臺酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)的來源，跟蹤分析酒糟中此類物質(zhì)在1個輪次生產(chǎn)周期內(nèi)的含量，表4、5分別為兩個不同班組各1個窖的樣品跟蹤分析結(jié)果，δ-生育酚在6輪次生產(chǎn)前后含量升高22.2%～32.9%，主要來自固態(tài)蒸餾過程（表4、5中“拌殼～下甑”），其他物質(zhì)在1個輪次生產(chǎn)周期內(nèi)的含量變化均較小，即生產(chǎn)過程的生化反應(yīng)對此17種物質(zhì)的貢獻小，可能主要來源于釀酒原料，即高粱或（和）大曲（小麥）。

表4 A班酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)含量跟蹤分析Table 4 Traceability analysis of tocopherols, sterols and triterpenoids contents in distiller’s grains from class A

為此，進一步分析生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)在原料和大曲中的含量如表6所示，δ-生育酚在小麥和大曲中未檢出，在高粱中的含量高于酒糟，綜合確定其來自高粱和蒸餾過程；環(huán)阿屯醇、羽扇豆醇和5-麥谷蛋白-3-醇在小麥和大曲中未檢出，γ-生育酚和乙酸羽扇醇酯的含量為高粱＞酒糟＞小麥、大曲，此5種物質(zhì)主要來自高粱；膽甾烷醇、β-生育酚、γ-生育三烯酚的含量為小麥＞大曲＞酒糟＞高粱，主要來自小麥；麥角甾醇在高粱和小麥中的含量均顯著低于酒糟，但在大曲中的含量較高，該物質(zhì)主要來自制曲生產(chǎn)過程；β-扶桑甾醇氧化物在小麥中的含量高于高粱，但低于酒糟，而大曲中的含量顯著較高，該物質(zhì)主要來自小麥和制曲生產(chǎn)過程；24-亞甲基環(huán)阿屯醇在高粱和小麥中的含量略低于酒糟，大曲中的含量較高，主要來自高粱、小麥和制曲生產(chǎn)過程；α-生育酚、菜油甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇、γ-谷甾醇、豆甾-5,24(28)-二烯-3-醇來自高粱和小麥的共同貢獻。

表6 原料和大曲中生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)的含量Table 6 Tocopherols, sterols and triterpenoids contents in raw materials and Daqu

3 結(jié) 論

建立了酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質(zhì)的分析方法，實現(xiàn)茅臺酒糟中5種生育酚類、9種甾醇類和4種三萜類生物活性物質(zhì)的定性及其中7種物質(zhì)的定量分析，完成茅臺酒糟中上述18種生物活性物質(zhì)的溯源分析，確定了環(huán)阿屯醇、羽扇豆醇、5-麥谷蛋白-3-醇、γ-生育酚、乙酸羽扇醇酯主要來自高粱，膽甾烷醇、β-生育酚、γ-生育三烯酚主要來自小麥，δ-生育酚主要來自高粱和蒸餾過程，β-扶桑甾醇氧化物主要來自小麥和制曲生產(chǎn)過程，麥角甾醇主要來自制曲生產(chǎn)過程，24-亞甲基環(huán)阿屯醇主要來自高粱、小麥和制曲生產(chǎn)過程，α-生育酚、菜油甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇、γ-谷甾醇、豆甾-5,24(28)-二烯-3-醇來自高粱和小麥的共同貢獻。