李小燕, 張 維, 何 杰

（1. 成都醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500；2. 成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川 成都 610500；3. 成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610500）

肺癌是目前全球發(fā)病率僅次于乳腺癌的惡性腫瘤，其中，肺腺癌的發(fā)病率在非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）中居第1 位，約占所有肺癌的40%［1］，且其預(yù)后較差。雖然肺腺癌的免疫治療和靶向藥物治療發(fā)展迅速，但其5年生存率僅為4%～17%［2-4］，因此需要尋找肺腺癌細(xì)胞相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因，研究肺腺癌治療的新靶點(diǎn)。再生基因1A（regenerating gene 1A，REG1A） 是一種人胃黏膜中的促生長因子，對(duì)胃頸部干細(xì)胞生長增殖具有重要作用，可促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞增生，修復(fù)胃黏膜細(xì)胞損傷［5］。既往研究［6-7］顯示：REG1A在胃惡性腫瘤患者中表達(dá)水平明顯高于正常人，且高表達(dá)REG1A 胃癌患者預(yù)后較差。也有研究［8-10］顯示：除胃癌外，REG1A 在多種腫瘤（鼻咽癌、乳腺癌和膀胱癌等）組織中也呈現(xiàn)高表達(dá)，且與腫瘤的預(yù)后存在緊密的關(guān)聯(lián)。MINAMIYA 等［11］研究顯示：REGA1 表達(dá)水平低的NSCLC 患者5年生存率明顯高于REGA1 表達(dá)水平高的患者。但是，上述研究僅研究了REGA1 與NSCLC 患者預(yù)后的關(guān)系，未針對(duì)REGA1 在肺腺癌中涉及的具體通路進(jìn)行深入研究，REGA1 導(dǎo)致肺癌預(yù)后差的分子機(jī)制尚不清楚。本研究利用腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）公共數(shù)據(jù)庫及相關(guān)生物信息學(xué)分析網(wǎng)站分析REG1A 在肺腺癌中的表達(dá)及相關(guān)通路，并結(jié)合臨床樣本和肺腺癌細(xì)胞株對(duì)生物信息學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，探討REG1A 對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用，以揭示REG1A在肺腺癌發(fā)展中的可能調(diào)控機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

1.1.1 REG1A 表達(dá)水平分析 采集來自TCGA數(shù)據(jù)庫的515 例肺腺癌組織和59 例癌旁正常組織的基因表達(dá)譜信息，使用在線分析網(wǎng)站UALCAN（http：//ualcan. path. uab. edu/cgi-bin/ualcan-res.pl）分析肺腺癌患者癌組織和正常組織中REG1A基因mRNA 表達(dá)水平。采用R3.6.1 軟件中的“merge”函數(shù)，以REG1A 表達(dá)水平的中位數(shù)值為截?cái)嘀?，將肺腺癌樣本分為低表達(dá)REG1A 組和高表達(dá)REG1A 組用于后續(xù)分析。

1.1.2 低表達(dá)REG1A 組與高表達(dá)REG1A 組差異基因分析 來自TCGA數(shù)據(jù)庫中的高表達(dá)REG1A組258 例和低表達(dá)REG1A 組患者257 例差異基因通過Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)在R 軟件中的“l(fā)imma”程序包中進(jìn)行分析。設(shè)定閾值調(diào)整后P＜0.05 和log2折點(diǎn)變化的絕對(duì)值（|log2Fold Change |） ＞1.5，差異基因均以熱圖形式呈現(xiàn)。

1.1.3 基因富集分析 采用R 軟件中的“Cluster Profiler GO”程序包和GSEA 4.1.0 軟件對(duì)低和高表達(dá)REG1A 組差異基因進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科 全 書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）富集分析，基于缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)法，最終設(shè)定隨機(jī)組合次數(shù)為1000 次，P＜0.05 和錯(cuò)誤發(fā)生率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.25 的基因集作為顯著富集基因集，挑選其中得分最高的信號(hào)通路作為研究對(duì)象。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 4 種人肺腺癌細(xì)胞系（A549、LC-2、HCC515 和PC14）和人肺上皮細(xì)胞系（BEAS-2B） 購于上海生命科學(xué)院。shRNA-REG1A 和shNC 質(zhì)粒寡核苷酸片段由上海和生生物科技有限公司合成，胰酶消化液購于美國Hyclone 公 司，F(xiàn)BS、OptiMEN 和DMEM 購 于 美國Gbico 公司，Transwell 小室購于美國Coring 公司，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 購于美國Invitrgen公司，REG1A 引物序列由杭州齊步生物有限公司合成，免疫組織化學(xué)試劑盒購于廣州輝俊生物科技有限公司，β-連環(huán)素（β-catenin）、無翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員3a （wingless type MMTV integration site family member 3a，Wnt-3a）、c-Myc原癌基因和REG1A 蛋白抗體購于美國Cellular Signaling Technology 公司。168-1130 酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2.2 標(biāo)本來源 選 擇2018年1月—2020年12月成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院外科接受肺癌切除術(shù)患者40 對(duì)經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)的人肺腺癌樣本和距腫瘤至少5 cm 的正常肺組織標(biāo)本。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，取組織樣本前患者本人及家屬均知情，并簽署相關(guān)同意書。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測陽性染色細(xì)胞數(shù) 將組織放置于石蠟之中包埋，切片厚度為4 μm，將載玻片依次放入二甲苯與不同濃度酒精中進(jìn)行脫蠟，脫蠟后在清水中沖洗一段時(shí)間，加入3%H2O2浸泡20 min 后倒掉H2O2，加入枸櫞酸鹽緩沖液，放入微波爐中蒸煮至沸騰（中火），冷卻至室溫后再蒸煮一次，冷卻至室溫，倒掉枸櫞酸鹽緩沖液，將載玻片置于PBS 緩沖液中清洗5 min，重復(fù)3 次，擦干組織周圍的PBS 緩沖液，立即加上10%血清，使一些非特異性的位點(diǎn)封閉起來，然后放入37 ℃溫箱中10 min；加一抗4 ℃過夜，加PBS 緩沖液再次清洗5 min，重復(fù)3次，再加二抗，37 ℃、30 min，再次清洗，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液37 ℃孵育30 min；DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后，將載玻片放入不同濃度酒精和二甲苯中脫水，干燥后，用中性樹膠封片，放于顯微鏡下觀察。當(dāng)每張切片至少用5 個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察時(shí)，染色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)目5%以下，則標(biāo)本結(jié)果為REG1A 陰性，反之則為REG1A 陽性。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)分為 shNC 組、shREG1A 組、shREG1A+PBS 組和shREG1A+氯化鋰（LiCl） 組。在含5% CO2濕潤狀態(tài)下，將A549 細(xì)胞在含有10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)液中37 ℃常規(guī)培養(yǎng)。將處于活性狀態(tài)的A549 細(xì)胞消化、離心后接種于培養(yǎng)板上，置于細(xì)胞孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞密度＞80%后用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染shREG1A 和陰性對(duì)照質(zhì)粒shNC，每孔5 μg 質(zhì)粒，shREG1A 質(zhì)粒組加入 濃 度 為20 mmol·L－1且 溶 于 去 離 子 水 的LiCl（shREG1A+LiCl） 或 等 體 積 PBS 緩 沖 液（shREG1A+PBS）。轉(zhuǎn)染成功后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞繼續(xù)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 法檢測目的基因mRNA 表達(dá)水平 使用Trizol 按說明書提取細(xì)胞中總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。各基因引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃反應(yīng)20 s，70 ℃反應(yīng)30 s；循環(huán)次數(shù)40 次。以GAPDH 為 內(nèi) 參，采 用2－△△Ct法 計(jì) 算 目 的 基 因mRNA 表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR 法的引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR method

1.2.6 Western blotting 法檢測各組細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h，從細(xì)胞中提取全部蛋白質(zhì)，經(jīng)BCA 試劑盒定量檢測濃度合格，將灌有PAGE 的小玻璃板放入足夠的電泳液中，用SDS緩沖液將蛋白樣品煮沸變性，然后將變性的樣品上樣至凝膠中進(jìn)行電泳分離。電泳后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。加入5%脫脂牛奶在室溫下緩慢搖蕩封閉2 h。將一抗用TBST 稀釋至適當(dāng)濃度，室溫條件下，在搖床上緩慢搖動(dòng)孵育2 h；孵育完成后吸取一抗，將膜放入TBST 中，使TBST沒過PVDF 膜，在搖床上低速震蕩10 min，重復(fù)洗3 次。相同的方法處理二抗。使用酶促反應(yīng)使底物顯色出現(xiàn)條帶，對(duì)蛋白條帶進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量和灰度值分析。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）法檢測各組細(xì)胞增殖活性 將每組細(xì)胞按每孔200 μL 培養(yǎng)，每隔24 h 后將每個(gè)孔中加入20 μL CCK-8 試劑，然后用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm 波長下檢測各組吸光度（A） 值。以細(xì)胞A 值表示細(xì)胞增殖活性，并繪制細(xì)胞增殖曲線。1.2.8 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 常規(guī)胰酶消化細(xì)胞，PBS緩沖液沖洗1 次去除血清的影響，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。添加1×105個(gè)細(xì)胞至Transwell 小室上層，24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板下室內(nèi)加入700 μL 含20%血清的DMEM-H 培養(yǎng)液，注意上、下層無氣泡產(chǎn)生。培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，PBS 緩沖液沖洗2 遍，用棉棒小心擦洗干凈小室微孔膜上層內(nèi)的細(xì)胞，在24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)采用1 mL 甲醇室溫固定15 min，結(jié)晶紫溶液染色15 min。倒置顯微鏡下取像。使用Image J 軟件計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)。以每個(gè)100 倍鏡下細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞遷移能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R 3.6.1、Graph Pad Prism 7.0 和GSEA 4.1.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。生物信息學(xué)分析基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)（M）［四分位數(shù)間距（Q）］表示，低表達(dá)REG1A 組與高表達(dá)REG1A 組差異基因比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)分析中，各組細(xì)胞中REG1A、Wnt-3a、β-catenin 和c-Myc mRNA 及 蛋 白 表 達(dá) 水平，細(xì)胞增殖活性和遷移細(xì)胞數(shù)均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，兩組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織和癌旁正常組織中REG1A mRNA 表達(dá)水平

TCGA 公共數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示：肺腺癌組織中REG1A mRNA 的表達(dá)水平［0.085（0.019，0.683）］高于癌旁組織［0.012（0.008，0.219）］（Z=2.498，P=0.012）。

2.2 低表達(dá)REG1A 組和高表達(dá)REG1A 組差異基因分析

2 組共有78 個(gè)差異表達(dá)基因，其中20 個(gè)下調(diào)基因和58 個(gè)上調(diào)基因。差異基因的熱圖見圖1。

圖1 2 組差異基因的熱圖Fig.1 Heat map of differential genes in two groups

2.3 差異基因GO 注釋和KEGG 途徑富集分析

GO 注釋結(jié)果顯示：差異基因涉及到10 個(gè)生物學(xué)過程，10 個(gè)分子功能和1 個(gè)細(xì)胞組分，見圖2A。KEGG 途徑富集分析表明：低和高表達(dá)REG1A 組差異基因在Wnt 信號(hào)通路得分最高，標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù) （Normalization Enrichment Score， NES） =2.248。因此選取Wnt 信號(hào)通路作為研究通路，探索REG1A 是否可通過Wnt 信號(hào)通路對(duì)肺腺癌增殖和遷移產(chǎn)生影響。見圖2B 和表2。

圖2 低和高表達(dá)REG1A 組差異基因富集分析Fig.2 Enrichment analysis of differentially genes in low and high expression REG1A groups

表2 KEGG 富集分析Tab.2 KEGG enrichment analysis

2.4 免疫組織化學(xué)檢測肺腺癌組織和癌旁組織中REG1A 蛋白表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示：REG1A 蛋白主要分布在肺腺癌細(xì)胞胞膜上，少量定位于間質(zhì)，而幾乎不存在于正常肺組織中。REG1A 陽性表達(dá)呈棕黃色或深棕色。見圖3。

圖3 肺腺癌組織（A）和癌旁正常肺組織（B)中REG1A 蛋白表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，×400)Fig.3 Expressions of REGA1 in lung adenocarcinoma(A)and para-cancerous normal lung(B) tissues (Immunohistochemistry,×400)

2.5 REG1A 在多種肺腺癌細(xì)胞和人正常肺上皮細(xì)胞中表達(dá)水平

RT-qPCR 法和Western blotting 法檢測結(jié)果顯示： 人肺腺癌A549、LC-2、HCC515 和PC14 細(xì)胞中REG1A mRNA 水平高于人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B，其中以A549 細(xì)胞差異最為顯著（P＜0.05）。見圖4。因此，選取A549 細(xì)胞作為研究對(duì)象繼續(xù)研究。

圖4 人正常肺上皮細(xì)胞和肺腺癌細(xì)胞中REGA1 表達(dá)情況Fig.4 REGA1 expressions in human normal lung epithelial cells and lung adenocarcinoma cells

2.6 REG1A 基因敲減后REG1A 表達(dá)情況

為進(jìn)一步驗(yàn)證REG1A 基因能作為功能性癌基因參與肺腺癌的進(jìn)程，本研究進(jìn)一步對(duì)A549 細(xì)胞中的REG1A 基因進(jìn)行敲減。轉(zhuǎn)染48 h 后，與shNC 組 比 較，shREG1A 組A549 細(xì) 胞 中REG1A mRNA 和蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05）（圖5）。提示轉(zhuǎn)染成功，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 RT-qPCR 和Western blotting 法驗(yàn)證REG1A 敲減效率Fig.5 Knockdown efficiencies of REG1A verified by RT-qPCR and Western blotting methods

2.7 REG1A基因敲減后shNC 和shREG1A 組細(xì)胞增殖活性和遷移細(xì)胞數(shù)

CCK-8 法 檢 測 結(jié)果 顯 示： 轉(zhuǎn) 染 后0 h，shREG1A 組與shNC 組細(xì)胞增殖活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但轉(zhuǎn)染24、48 和72 h 后，與shNC 組比較，shREG1A 組細(xì)胞增殖活性降低（P＜0.05）。見圖6。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與shNC 組［（158.46±15.25） 個(gè)］ 比較，shREG1 A 組遷移細(xì)胞數(shù)［（52.47±12.44）個(gè)］明顯減少（t=－9.321，P＜0.05）。見圖7。

圖6 CCK-8 法 檢 測shNC 組 和shREG1A 組A549 細(xì)胞增殖活性Fig.6 Proliferation activities of A549 cells in shNC group and shREG1A group measured by CCK-8 method

圖7 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測shNC 組(A)和shREG1A 組（B)細(xì)胞遷移情況(結(jié)晶紫，×100)Fig. 7 Migration of cells in shNC group（A) and shREG1A group(B) detected by Transwell assay(Crystal violet,×100)

2.8 敲減REG1A 實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞中Wnt-3a、β-catenin和c-Myc mRNA及蛋白表達(dá)水平

shREG1A 組 細(xì) 胞 中Wnt-3a、β-catenin 和c-Myc mRNA 及蛋白表達(dá)水平在REG1A 基因敲減后明 顯 低 于shNC 組（P＜0.05）； 與shREG1A+PBS 組 比 較， shREG1A+LiCl 組 Wnt-3a、 βcatenin 和c-Myc mRNA 及蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖8。

圖8 轉(zhuǎn)染后各組A549 細(xì)胞中Wnt/β-catenin 通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.8 Expressions of Wnt/β-catenin pathway-related proteins in A549 cells in various groups after transfection

2.9 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞增殖活性和遷移細(xì)胞數(shù)

shNC 組、shREG1A 組、shREG1A+PBS 組和shREG1A+LiCl 組細(xì)胞增殖活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），shREG1A 組細(xì)胞增殖活性低 于shNC 組 和shREG1A+LiCl 組（P＜0.05），shREG1A 組與shREG1A+PBS 組細(xì)胞增殖活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖9。shNC 組、shREG1A組、shREG1A+PBS組和shREG1A+LiCl組48 h 遷 移 細(xì) 胞 數(shù) 分 別 為（180.00±10.33）、（70.33±22.00）、（64.33±9.33） 和（174.00±20.00） 個(gè)，4 組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=43.423，P＜0.05）； shREG1A 組遷移細(xì)胞數(shù)少于shNC 組和shREG1A+LiCl（P＜0.05），shREG1A組與shREG1A+PBS 組遷移細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖10。

圖9 CCK-8 法檢測各組A549 細(xì)胞增殖活性Fig.9 Proliferation activities of A549 cells in various groups measured by CCK-8 method

圖10 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測各組A549 細(xì)胞遷移情況(結(jié)晶紫，×100)Fig.10 Migration of A549 cells in various groups detected by Transwell assay(Crystal violet,×100)

3 討論

REG 是從僅剩下10%胰腺的大鼠再生胰島源性cDNA 文 庫 篩 檢 鑒 定 獲 得 的［10，12］。 其 中，REG1A 位于人類2 號(hào)染色體p12 區(qū)，其屬于REG基因家族17 個(gè)成員中的一員，是一種由6 個(gè)外顯子和5 個(gè)內(nèi)含子組成的全長2962 bp 的單拷貝基因［13］。REG1A 是一種癌基因，在多種消化系統(tǒng)疾病病變組織中表達(dá)上調(diào)，如消化系統(tǒng)炎癥病變或消化系統(tǒng)腫瘤等，研究［14-15］發(fā)現(xiàn)：炎性腸病患者炎癥結(jié)直腸組織中REG1A 表達(dá)水平明顯升高，異常表達(dá)的REG1A 可以明顯抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制腸道上皮的細(xì)胞凋亡；REG1A 在胰腺癌中表達(dá)上調(diào)，可以作為胰腺腺泡細(xì)胞癌的診斷標(biāo)志物。本研究通過TCGA 公共數(shù)據(jù)庫初篩發(fā)現(xiàn)REG1A 在肺腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，進(jìn)一步結(jié)合臨床40 對(duì)肺腺癌組織樣本的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：REG1A 蛋白主要分布在腫瘤細(xì)胞胞膜上，少量定位于間質(zhì)，而幾乎不存在于正常肺組織中，進(jìn)一步證實(shí)了REG1A 在肺腺癌中也是一種癌基因。肺腺癌和多數(shù)消化系統(tǒng)腫瘤均屬于腺癌，可能在腫瘤的生物學(xué)行為和特征上存在相似性，因此消化系統(tǒng) 腫瘤和肺腺癌中REG1A 的表達(dá)均上調(diào)。除此之外，REG1A 與許多其他疾病也存在緊密的聯(lián)系，如鼻咽癌、乳腺癌和膀胱癌等多種惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展、治療反應(yīng)性及預(yù)后均明顯與REG1A 的 表 達(dá) 相 關(guān)［8，13，16］。本 研 究 通 過 對(duì)4 種 不同肺腺癌細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR 法和Western blotting法檢測，結(jié)果顯示：上述細(xì)胞中REG1A 也呈現(xiàn)高表達(dá)，并且敲減REG1A 后能夠明顯抑制A549 細(xì)胞增殖和遷移，表明REG1A 可能在促進(jìn)肺腺癌的發(fā)展中起著重要作用。KIMURA 等［17］研究表明：過表達(dá)REG1A 的肺腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖和侵襲能力，與本研究部分結(jié)果類似。MINAMIYA等［11］研究顯示：高表達(dá)REG1A 是NSCLC 患者的獨(dú)立預(yù)后因素。結(jié)合之前的研究結(jié)果，本文作者推測高表達(dá)REG1A 的肺癌患者預(yù)后更差的原因可能與REG1A 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移能力有關(guān)，但具體的分子機(jī)制值得深入研究。

本研究進(jìn)一步對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫中低表達(dá)和高表達(dá)REG1A 的肺腺癌樣本進(jìn)行差異分析，共發(fā)現(xiàn)58 上調(diào)的基因和20 下調(diào)的基因，高表達(dá)REG1A 組的差異基因主要涉及到10 個(gè)生物學(xué)過程，主要集中在消化系統(tǒng)和上皮結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；10 個(gè)分子功能，主要富集在離子轉(zhuǎn)運(yùn)體活動(dòng)和內(nèi)切核糖核酸酶活性；1 個(gè) 細(xì) 胞 組 分 為 高 爾 基 腔。ASTROSINI 等［18］發(fā)現(xiàn)：REG1A 在結(jié)直腸癌中也呈現(xiàn)高表達(dá)，高表達(dá) REG1A 的結(jié)直腸癌患者生存期更短。SEKIKAWA 等［19］研 究 顯 示：REG1A 可 以 促 進(jìn) 胃癌細(xì)胞的分化和增殖，其機(jī)制是通過REG1A 增強(qiáng)蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）激活、B 細(xì)胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）相關(guān)死亡促進(jìn)因子的磷酸化和B 細(xì)胞淋巴瘤XL （B cell lymphoma-XL，Bcl-XL）表達(dá)介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3 （signal transducers and activators of transcription 3，STAT3） 信號(hào)在胃癌細(xì)胞中的抗凋亡作用，上述文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)一步佐證了本研究前期生物信息分析的正確性。本研究結(jié)果表明：肺腺癌中高表達(dá)REG1A 組差異基因在Wnt 信號(hào)通路和癌癥信號(hào)通路富集，其中Wnt 信號(hào)通路得分最高。Wnt 信號(hào)通路的異?；罨c肺腺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)，調(diào)控著肺腺癌細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移等諸多過程。本研究結(jié)果提示：REG1A 可能通過激活Wnt 信號(hào)通路促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。然而，這一受調(diào)控的信號(hào)通路與REG1A在胃癌中涉及的通路不同，其原因可能是REG1A 涉及的通路在肺癌組織和胃癌組織中各有其組織特異性有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組Wnt-3a、β-catenin 和c-Myc 表達(dá)水平均明顯下調(diào)。加入LiCl 處理肺腺癌細(xì)胞后，shREG1A+LiCl 組Wnt-3a、β-catenin 和c-Myc mRNA 及蛋白表達(dá)水平升高。采用Wnt 通路激動(dòng)劑LiCl 處理肺腺癌細(xì)胞后，敲減REG1A 基因?qū)?xì)胞的增殖和遷移的抑制作用被顯著逆轉(zhuǎn)，表明REG1A 可以直接通過Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。Wnt/β-catenin 是Wnt信號(hào)通路經(jīng)典途徑，現(xiàn)已證實(shí)其轉(zhuǎn)錄活性紊亂與包含肺腺癌在內(nèi)的十多種常見惡性腫瘤有關(guān)［20-22］。Wnt-3a 作為經(jīng)典Wnt 配體的代表及β-catenin 的上游基因，能夠促進(jìn)肺癌血管生成擬態(tài)形成與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），因此與肺腺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)［23］； 肺癌的發(fā)生也與β-catenin 多 功 能 蛋 白 的 異 常 活 化 相 關(guān)［24］；c-Myc是Wnt 信號(hào)通路的主要下游靶基因，能調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，促進(jìn)G1期細(xì)胞進(jìn)入S 期，激活細(xì)胞端粒酶并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄，增大腫瘤的發(fā)生概率［25］。本研究結(jié)果提示REG1A 可能通過Wnt/β-catenin 通路促進(jìn)肺腺癌的進(jìn)展。SHA 等［26］研究表明：在肝母細(xì)胞瘤中，Wnt/β-catenin 可與REG1A 和REG3A 協(xié)同作用，誘導(dǎo)肝母細(xì)胞瘤的發(fā)生。CAVARD 等［27］研究顯示：REG1A 與肝臟和胰腺的再生及增殖相關(guān)，REG1A 在肝癌發(fā)生過程中是Wnt 信號(hào)通路的靶點(diǎn)。上述研究也證明了REG1A 在其他腫瘤中可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin 影響腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展，與本研究結(jié)果相似。但本研究也存在一定的局限性，REG1A 調(diào)控Wnt/β-catenin 通路的具體機(jī)制尚未完全闡明，且未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步加以驗(yàn)證。

綜上所述，REG1A 可能通過調(diào)控 Wnt/β-catenin通路促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移，進(jìn)而影響肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展。本研究豐富了對(duì)肺腺癌增殖和遷移的分子機(jī)制的研究，為肺腺癌的早期診斷及靶向治療提供了一定的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)依據(jù)。