萬超超，王東東，郭敬宇，孫 蕓

（新疆醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011）

沙棗花是胡頹子科胡頹子屬植物沙棗（Elaeagnus angustifolia L.）的花，花期在每年5～6月份，沙棗花型較小,長5～7mm,花萼筒鐘形,頂端通常4裂,外面呈銀白色,內(nèi)面呈黃色，氣味濃郁宜人，有“飄香沙漠的桂花”之稱。廣泛分布在我國西北地區(qū)，生長于半干旱、干旱、半荒漠、荒漠地區(qū)，是沙漠里的“寶樹”，是天然野生的防風(fēng)固沙植物[1-3]?！吨袊衬貐^(qū)藥用植物》記載沙棗花具有止咳平喘的功效,可用于治療慢性支氣管炎[4]。沙棗花中芳香油占比為0.2%～0.4%，因此，對于沙棗花中揮發(fā)油的研究較多，同時(shí)，沙棗花中也含有黃酮、多酚、三萜皂苷以及礦物質(zhì)元素和微量元素[5-11]。所以，沙棗花具有很好的生物活性，可以止咳平喘，同時(shí)沙棗花醇提物還具有提高機(jī)體清除氧自由基能力等的活性[12-14]。本實(shí)驗(yàn)以沙棗花為原料，評價(jià)其抗氧化活性，同時(shí)測定了其中的總黃酮、總多酚含量，研究其品質(zhì)差異可以為沙棗花的利用提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

蘆?。ㄅ枺篈05GB144263上海源葉生物科技有限公司）；沒食子酸（批號：MUST-18032801中國食品藥品檢定研究院）；DPPH，ABTS，購于上海源葉生物科技有限公司；椴樹苷（批號：3227，純度≥98%上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、Na2CO3、福林酚試劑等均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為自制蒸餾水。

本實(shí)驗(yàn)沙棗花采自新疆5個(gè)產(chǎn)地，見表1。

表1 沙棗花藥材采集時(shí)間及地點(diǎn)Tab.1 Collection time and place of Elaeagnus angustifolia flowers

XS-105型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；UV2700型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）；CAMAG REPROSTAR3薄層成像儀（CAMAG，Muttenz，Swit-zerland）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液的制備 取各批次沙棗花1.00g，按1∶25加70%乙醇提取，超聲45min，濾過，重復(fù)此操作兩次，將兩次濾液合并，即得樣品溶液備用。

1.2.2 對照品溶液的制備

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 精密稱定蘆丁4.93mg，用70%乙醇稀釋并定容至25mL，混勻，最終濃度為0.197mg·mL-1，備用。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液 精密稱定沒食子酸2.55mg，用70%乙醇稀釋并定容至25mL，混勻，最終濃度為0.102mg·mL-1，備用。

1.2.3 DPPH自由基清除率測定 參考文獻(xiàn)[15,16]方法，將1.2.1項(xiàng)下得到的沙棗花提取物依次稀釋得到濃度為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mg·mL-1的溶液，取2mL樣品液和2mL濃度為1×10-4mol·L-1的DPPH溶液于試管混勻，避光反應(yīng)30min，后在517nm波長處測定吸光度為A1；取2mL樣品液與2mL無水乙醇，混勻，后測定吸光度為A2；取2mL蒸餾水與2mL DPPH溶液混勻后測定吸光度為A0。以VC為陽性對照，每個(gè)樣平行測定3次。按公式（1）計(jì)算。

1.2.4 ABTS自由基清除率測定 參考文獻(xiàn)[17]方法將1.2.1項(xiàng)下得到的沙棗花提取物依次稀釋得到濃度為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mg·mL-1的溶液，取0.2mL樣品溶液于試管，向其中加入3.9mL ABTS溶液并混勻，置于暗處反應(yīng)15min，在734nm處測定吸光度A1；0.2mL樣品溶液與3.9mL無水乙醇，混勻，測定吸光度A2；3.9mL ABTS溶液與0.2mL蒸餾水混勻，測定吸光度A0。以VC為陽性對照，每個(gè)樣品平行測3次。按公式（2）計(jì)算

1.2.5 線性關(guān)系考察

蘆丁線性關(guān)系 參考文獻(xiàn)[18]方法分別取標(biāo)準(zhǔn)液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL于10mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液0.5mL混勻，放置6min，再加10%Al（NO3）3溶液0.6mL后混勻，放置6min，最后加4%NaOH溶液5mL，蒸餾水定容后于室溫下放置12min，以相應(yīng)試劑為空白對照，在510nm處測定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到線性方程。

沒食子酸線性關(guān)系 參考文獻(xiàn)[19]方法分別取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL標(biāo)準(zhǔn)液于10mL的棕色瓶中，先后加入磷鉬鎢酸0.5mL和10%Na2CO3溶液1.5mL溶液混勻，以蒸餾水定容后于75℃水浴鍋中反應(yīng)15min，以相應(yīng)試劑為空白對照，在760nm處測定吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到線性方程。

1.2.6 方法學(xué)考察 參考文獻(xiàn)[15-17]方法取同一標(biāo)準(zhǔn)液6份并測定吸光度，求得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，評價(jià)設(shè)備精密度；取同一份標(biāo)準(zhǔn)液，每間隔10min測定一次吸光度，測定60min內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，評價(jià)方法穩(wěn)定性；取同一份樣品液6份測定吸光度，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，評價(jià)方法重復(fù)性；稱取同一份樣品6份，各自加入適量的標(biāo)準(zhǔn)品，按相應(yīng)方法根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，評價(jià)方法加樣回收率。

1.2.7 樣品含量的測定 參考文獻(xiàn)[15-17]方法取一定量樣品液，根據(jù)蘆丁和沒食子酸的線性關(guān)系測定吸光度后帶入線性方程，計(jì)算提取液中總黃酮和總多酚的濃度，從而求得沙棗花中總黃酮和總多酚含量。

1.2.8 薄層定性鑒別

對照品溶液的制備 精密稱定1.02mg椴樹苷對照品溶于1mL甲醇，最終濃度為1.02mg·mL-1。

樣品溶液的制備 取各批沙棗花粉末約1.00g，加入25mL 70%乙醇提取，超聲45min，濾液移入蒸發(fā)皿中，于水浴鍋上65℃蒸干，得到殘?jiān)?，加?mL甲醇溶解，過0.22μm濾膜，即得。

色譜條件 將安徽良辰硅膠板GF254在105℃烘箱中活化15min，存放于干燥器中備用。通過優(yōu)化進(jìn)樣量，樣品（5針，3μL·針-1）和椴樹苷對照品（2針，2μL·針-1）分別用linomatic5自動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于同一張硅膠板上，帶寬6mm，距離TLC板下邊緣8mm。用二氯甲烷∶無水乙醇∶甲酸（9∶1∶2）作為展開劑，先于24～26℃，相對濕度為10%的展開缸中預(yù)飽和15min，再展開，當(dāng)流動(dòng)相展開至距離硅膠板上邊緣1cm的位置時(shí)取出，晾干，然后用10%硫酸-乙醇溶液顯色。于白光下、254、366nm紫外燈下拍照。供試品和標(biāo)準(zhǔn)品在薄層板上相應(yīng)位置顯示相同顏色斑點(diǎn)。

1.2.9 薄層自顯影技術(shù)分析沙棗花抗氧化活性 吸取5批沙棗花樣品溶液3μL和椴樹苷對照品2μL，點(diǎn)于GF254硅膠板上，以二氯甲烷∶無水乙醇∶甲酸（9∶1∶2）展開，晾干，以DPPH顯色后置于白光下檢視。

2 結(jié)果與討論

2.1 沙棗花提取物對DPPH自由基的清除作用

圖1為沙棗花提取物對DPPH的清除作用。

圖1 沙棗花提取物對DPPH的清除作用Fig.1 Scavenging effect of Elaeagnus angustifolia flower extract on DPPH

由圖1可以看出，在2.0～7.0mg·mL-1的系列濃度范圍之內(nèi)，樣品濃度不斷增大，隨之對于自由基的清除率也逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)出不斷增長的趨勢，有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。同時(shí)，也可以發(fā)現(xiàn)VC的清除率明顯高于樣品，但依然表現(xiàn)出了很好的抗氧化效果。

2.2 沙棗花提取物對ABTS自由基的清除作用

由2為沙棗花提取物對ABTS的清除作用。

圖2 沙棗花提取物對ABTS的清除作用Fig.2 Scavenging effect of Elaeagnus angustifolia flower extract on ABTS

由圖2可以看出，在2.0～7.0mg·mL-1的系列濃度范圍之內(nèi)，樣品濃度不斷增大，隨之對于自由基的清除率也逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)出不斷增長的趨勢，有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，最初VC的清除率明顯高于樣品，但隨著樣品濃度的增大，基本與VC持平，表現(xiàn)出了對ABTS自由基良好的清除效果。

2.3 總黃酮、總多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

表2為線性關(guān)系。

表2 線性關(guān)系Tab.2 Linear relationship

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各6份，按照1.2.5的方法測吸光度A，得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.72%和0.97%。說明設(shè)備具備良好精密度。

2.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各1份。按照1.2.5的方法在60min內(nèi)每間隔10min測1次吸光度A，其吸光度在1h內(nèi)基本穩(wěn)定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.72%和0.68%。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一份沙棗花提取液6份，按照1.2.5的方法測定其吸光度A，計(jì)算得沙棗花總黃酮和總多酚的吸光度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.99%和0.81%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取新提取的已知含量的同一份沙棗花樣品溶液6份，加入適量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.2.5的方法測定其吸光度A，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Experimental result of sample recovery rate

由表3可知，沙棗花總黃酮、總多酚加樣回收率分別為（99.28±1.10）%和（99.44±2.00）%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.11%和1.84%。表明該方法穩(wěn)定可靠。

2.5 樣品的含量測定

表4為新疆不同產(chǎn)地沙棗花總黃酮和總多酚含量測定結(jié)果。

表4 新疆不同產(chǎn)地沙棗花總黃酮和總多酚含量（n=3）Tab.4 Contents of total flavonoids and total polyphenols in Elaeagnus angustifolia flowers from different producing areas in Xinjiang（n=3）

由表4可以看出，沙棗花中總黃酮的含量基本差距不大，最高為烏魯木齊南湖公園批次22.34mg·g-1，最低為昌吉阜康市批次18.29mg·g-1；沙棗花總多酚的含量中，含量最高的為烏魯木齊鯉魚山批次30.04mg·g-1,含量最低的為烏魯木齊植物園批次11.78mg·g-1，另外3個(gè)批次差距不大。

2.6 薄層鑒別結(jié)果

圖3、4是未噴顯色劑時(shí)在254和366nm下拍攝的圖片，圖5～7是噴10%硫酸-乙醇顯色劑后，在254、366nm和白光下拍攝的圖片，結(jié)果顯示，鍛樹苷對照品和樣品的斑點(diǎn)清晰。

圖3 未噴顯色劑時(shí)254nm下的TLC圖Fig.3 TLC at 254nm without spraying developer

圖4 未噴顯色劑時(shí)366nm下的TLC圖Fig.4 TLC at 366nm without spraying developer

圖5 噴完顯色劑時(shí)254nm下的TLC圖Fig.5 TLC diagram at 254nm after spraying developer

圖6 噴完顯色劑時(shí)366nm下的TLC圖Fig.6 TLC diagram at 366nm after spraying developer

圖7 噴完顯色劑時(shí)白光下的TLC圖Fig.7 TLC diagram under white light after spraying developer

2.7 薄層自顯影技術(shù)分析沙棗花抗氧化活性結(jié)果

在紫色的背景下，顯示亮白色斑點(diǎn)，證明沙棗花具有很好的抗氧化活性[20]，沙棗花供試品中有多個(gè)較為明顯的亮白色斑點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中椴樹苷斑點(diǎn)明顯，表明其抗氧化活性很好。但同樣可以看出，仍有部分抗氧化活性明顯的斑點(diǎn)，目前是未知的成分，在后續(xù)的研究中可以進(jìn)一步確認(rèn)。

圖8 沙棗花提取物薄層生物自顯影TLC圖Fig.8 TLC diagram of Elaeagnus angustifolia flower extract by thin-layer autoradiography

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)表明，沙棗花對DPPH和ABTS自由基均有較好的清除活性；測定其中的總黃酮、總多酚的含量，實(shí)驗(yàn)方法學(xué)考察結(jié)果在允許的誤差范圍內(nèi)，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。沙棗花總黃酮、總多酚含量存在一定的差異，可能是由于氣候、海拔以及光照等自然地理因素的影響。同時(shí)實(shí)驗(yàn)采用薄層鑒別的方法鑒別出了椴樹苷成分，并采用薄層生物自顯影的方法對其抗氧化活性進(jìn)行了評價(jià)，表明椴樹苷除了有明顯抗氧化活性外，還有多個(gè)斑點(diǎn)，表明抗氧化效果明顯，有待后續(xù)進(jìn)一步研究，這在保健食品、抗氧化功能食品方面為沙棗花的開發(fā)利用提供了一定的參考，從而促進(jìn)沙棗資源的充分利用。