葛 亮，張 莎，姜向東，田樹革

（新疆醫(yī)科大學(xué)a.中醫(yī)學(xué)院；b.第五臨床醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000）

蟲草花（Cordyceps militaris）隸屬子囊菌亞門（Ascomycotina）麥角菌科（Clavicipitaceae）蟲草屬（Cordyceps），又稱蟲草子實(shí)體、不老草、蛹蟲草等[1]。其主要化學(xué)成分有黃酮類、多糖類、氨基酸類和核苷酸蟲草素等，具有抑菌、抗癌、抗氧化、抗炎、降血糖、補(bǔ)肺益腎等功效[2-10]。但由于蟲草花人工培育技術(shù)的優(yōu)化以及市場(chǎng)需求量的增大，蟲草花在全國(guó)多地均開始種植，其氣候條件，環(huán)境差異，土壤差別等，使不同產(chǎn)地的蟲草花各成分含量存在明顯差別。本文以新疆、內(nèi)蒙、云南、遼寧4個(gè)產(chǎn)地的蟲草花為研究對(duì)象，對(duì)其總黃酮的提取工藝進(jìn)行研究，并對(duì)不同產(chǎn)地的總黃酮含量進(jìn)行了比較，又進(jìn)行了蟲草花總黃酮對(duì)變異鏈球菌的藥敏實(shí)驗(yàn)，為后期的開發(fā)利用提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和試劑

蟲草花：選取新疆、內(nèi)蒙、云南、遼寧4個(gè)產(chǎn)地，均為干品，晾干，粉碎裝密封袋，置于干燥器中保存。

葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：2014506天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司）；變異鏈球菌（美國(guó)紐約華盛頓州立大學(xué)）；腦心浸出液（北京索萊寶科技有限公司）；NaNO2（AR產(chǎn)品批號(hào)20200720天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；Al（NO3）3（AR產(chǎn)品批號(hào)20190925成都市科隆化學(xué)品有限公司）；NaOH（AR產(chǎn)品批號(hào)20190620天津永晟精細(xì)化工有限公司）；95%乙醇（AR產(chǎn)品批號(hào)20200620天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；甲醇（AR產(chǎn)品批號(hào)20200325天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-5200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZF-6021型真空干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HH-S4型恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；AL204型電子分析天平（德國(guó)梅特勒托利多儀器有限公司）：UV2700型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津泰斯達(dá)公司）；SW-GJ-2FD型超凈工作臺(tái)（博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備）；LD2X-75KBS型全自動(dòng)電熱壓力滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；SPX-100B型生化培養(yǎng)箱（博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備）；150mm游標(biāo)卡尺（上海錫豐標(biāo)準(zhǔn)件有限公司）；100mm培養(yǎng)皿（無(wú)錫耐思科技有限公司）；單通道移液槍（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司）；低溫冰箱（中國(guó)Haier公司）。

1.3 溶液配制

1.3.1 樣品溶液 精確稱取4個(gè)不同產(chǎn)地的蟲草花粉末5.00g，用60%的乙醇，料液比1∶10，水浴回流提取兩次，每次1.5h，待冷卻后過(guò)濾，合并兩次濾液，密封保存于4℃冰箱備用。

1.3.2 對(duì)照品溶液 精密稱取5.00mg蘆丁對(duì)照品，用甲醇稀釋至50mL容量瓶中，搖勻，獲得濃度為0.1mg·mL-1的對(duì)照品溶液，存于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 顯色劑

5%NaNO2的配制 稱取5.00g的NaNO2粉末，用蒸餾水稀釋至100mL，獲得5%的NaNO2溶液，存于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

10%Al（NO3）3的配制 稱取10.00g的Al（NO3）3粉末，用蒸餾水稀釋至100mL，獲得10%的Al（NO3）3溶液，存于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4%NaOH的配制 稱取4.00g的NaOH粉末，用蒸餾水稀釋至100mL，獲得4%的NaOH溶液，存于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.06、0.12、0.24、0.32、0.4mL，置于5個(gè)10mL具塞試管中，每管加入5%NaNO20.3mL,充分搖勻，放置6min,加入0.3mL 10%Al（NO3）3，充分混勻，放置6min，最后加入4mL 4%NaOH試液，用蒸餾水補(bǔ)足至刻度，搖勻，混合以蘆丁對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，在510nm處測(cè)定相應(yīng)濃度下測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程:A=20.538x+0.0147（R=0.9996），蘆丁對(duì)照品濃度在0.005～0.45mg·mL-1間線性良好。

1.4.2 蟲草花總黃酮提取工藝單因素考察 精密稱取2.00g蟲草花，分別用按不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25），不同提取時(shí)間（0.5、1、1.5、2h），不同提取次數(shù)（1、2、3、4次），不同濃度的乙醇（50%、55%、60%、65%）,根據(jù)“1.4.1”的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定總黃酮含量，并計(jì)算總黃酮提取率。

1.4.3 蟲草花總黃酮提取工藝正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮含量為指標(biāo)，分別選取料液比（g∶mL）、提取時(shí)間（min）、提取次數(shù)（次）、乙醇濃度（%）作為考察因素。以蟲草花中總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L16（44）正交試驗(yàn)探索蟲草花總黃酮的最佳提取工藝，正交因素水平表見表1。

表1 正交因素水平表Tab.1 Single factor study of total flavonoids in cordyceps sinensis flowers

1.4.4 不同產(chǎn)地蟲草花中總黃酮的含量比較 根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化后的蟲草花中總黃酮的提取工藝,對(duì)4批來(lái)自不同產(chǎn)地的蟲草花進(jìn)行總黃酮的提取,并測(cè)定其含量的變化。

1.4.5 蟲草花中總黃酮體外抑菌實(shí)驗(yàn) 采用K-B瓊脂擴(kuò)散法對(duì)蟲草花總黃酮做對(duì)變異鏈球菌的藥敏試驗(yàn)，觀察其抑菌效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比考察 蟲草花樣品在進(jìn)行預(yù)處理后，準(zhǔn)確稱取蟲草花樣品2.00g，分別加入料液比（g∶mL）（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）60%乙醇，回提取流1.5h，重復(fù)兩次，待冷卻后合并濾液，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果探討不同料液比對(duì)蟲草花總黃酮含量的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對(duì)蟲草花總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on total flavonoids content of cordyceps flower

由圖1可知，在提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、乙醇濃度一定情況下，隨著料液比的升高，總黃酮含量先隨之升高后保持不變，、當(dāng)料液比大于1∶20時(shí)，蟲草花總黃酮含量不再增加，表明蟲草花中的總黃酮已被完全提取。

2.1.2 提取時(shí)間考察 蟲草花樣品在進(jìn)行預(yù)處理后，準(zhǔn)確稱取蟲草花樣品2.00g，用60%乙醇，料液比1∶20，回流提取0.5、1、1.5、2h，提取兩次，合并濾液，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果探討不同提取時(shí)間對(duì)蟲草花總黃酮含量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)蟲草花總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of extraction time on total flavonoids content of cordyceps flower

由圖2可知，在提取溫度、料液比、提取次數(shù)、乙醇濃度都一定的情況下，隨著提取時(shí)間的增加，蟲草花總黃酮含量增加，在1.5h后含量幾乎保持不變。結(jié)果證明，當(dāng)提取時(shí)間大于2h時(shí)，蟲草花總黃酮含量不再增加，表明蟲草花中總黃酮已被完全提取。

2.1.3 提取次數(shù)考察 蟲草花樣品在進(jìn)行預(yù)處理后，準(zhǔn)確稱取蟲草花樣品2.0g，用60%乙醇，料液比1∶20，回流提取1.5h，提取1、2、3、4次，分別合并濾液，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果探討不同提取次數(shù)對(duì)蟲草花總黃酮含量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取次數(shù)對(duì)蟲草花總黃酮含量的影響Fig.3 Effects of extraction times on total flavonoids content of cordyceps flower

由圖3可知，在提取溫度、料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度都一定的情況下，隨著提取次數(shù)的增加，蟲草花總黃酮含量增加，在提取兩次后含量慢慢下降。結(jié)果表明，當(dāng)提取次數(shù)大于兩次時(shí)，蟲草花總黃酮含量不再增加，表明蟲草花中總黃酮已被完全提取。

2.1.4 乙醇濃度考察 蟲草花樣品在進(jìn)行預(yù)處理后，準(zhǔn)確稱取蟲草花樣品2.0g，分別用濃度為50%、55%、60%、65%的乙醇，料液比（g∶mL）1∶20，回流提取1.5h，提取兩次，合并濾液，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果探討不同乙醇濃度對(duì)蟲草花總黃酮含量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇濃度對(duì)蟲草花總黃酮含量的影響Fig.4 Effects of ethanol concentration on total flavonoids content in cordyceps flower

由圖4可知，在提取溫度、料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間都一定的情況下，隨著乙醇濃度的增加，蟲草花總黃酮含量逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，蟲草花總黃酮含量幾乎保持不變。結(jié)果證明，當(dāng)乙醇濃度大于60%時(shí)，蟲草花總黃酮含量不再增加，表明蟲草花中總黃酮已被完全提取。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal experiment results

由表2可以看出，各因素對(duì)蟲草花提取影響不同，其順序?yàn)镃（提取次數(shù)）＞B（提取時(shí)間）＞D（乙醇濃度）＞A（料液比）；從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以得出提取次數(shù)對(duì)蟲草花總黃酮含量影響最大，蟲草花總黃酮提取最優(yōu)結(jié)果為A3B3C2D3，即60%乙醇，料液比（g∶mL）1∶20，回流提取兩次，每次120min。

在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，以所得最佳工藝條件提取3批同一產(chǎn)地的蟲草花樣品，測(cè)定提取液總黃酮含量分別為4.85、4.92、5.03mg·g-1，平均值為4.93mg·g-1，與預(yù)測(cè)值較為接近，表明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行。

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 在10mL試管中吸取蘆丁對(duì)照品溶液6份，每份0.32mL，根據(jù)“1.4.1”的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 蟲草花總黃酮精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Precision test result of total flavonoids in cordyceps flower

由表3可知，RSD為1.41%，符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，表明實(shí)驗(yàn)儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精確量取0.32mL蘆丁對(duì)照品溶液，根據(jù)“1.4.1”中實(shí)驗(yàn)方法操作，每隔15min測(cè)定一次吸光度，重復(fù)6次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 蟲草花總黃酮穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Stability test result of total flavonoids in cordyceps flower

由表4可知，其RSD為0.39%，表明蘆丁對(duì)照品在90min內(nèi)對(duì)照品穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精確稱取同一批次樣品6份，根據(jù)“2.2”中方法獲得提取液后精密吸取0.04mL，根據(jù)“1.4.1”中實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 蟲草花總黃酮重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Reproducibility test result of total flavonoids in cordyceps flower

由表5可知，其RSD為1.40%，符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 回收率實(shí)驗(yàn) 精確吸取已知總黃酮含量的蟲草花樣品與蘆丁對(duì)照品使其總黃酮含量約為1∶1，按“1.4.1”的實(shí)驗(yàn)方法，平行測(cè)定吸光度取平均值，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算出蟲草花總黃酮的含量進(jìn)而計(jì)算加樣回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 蟲草花總黃酮加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Standard recovery result of total flavonoids in cordyceps flower

由表6可知，新疆蟲草花總黃酮的平均回收率為99.9%，RSD為1.23%，符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 樣品總黃酮含量測(cè)定

精確稱取4個(gè)產(chǎn)地的蟲草花2.00g，按照“2.2”的方法獲得4個(gè)不同產(chǎn)地的蟲草花提取液，吸取適量的提取液，按照“1.4.1”中的方法，平行3次測(cè)量吸光度取平均值，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算出4個(gè)不同產(chǎn)地的蟲草花中總黃酮含量，結(jié)果見表7。

表7 4個(gè)產(chǎn)地蟲草花總黃酮含量測(cè)定結(jié)果Tab.7 Determination result of total flavonoids in the flower of Cordyceps from four producing areas

由表7可知，內(nèi)蒙地區(qū)含量最高為5.36mg·g-1,云南地區(qū)含量最低為3.98mg·g-1。

2.5 蟲草花總黃酮對(duì)變異鏈球菌的抑制實(shí)驗(yàn)

2.5.1 菌種復(fù)蘇與培養(yǎng) 將變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌種置于裝有2mL BHI培養(yǎng)基的有蓋試管中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16h，比濁法判斷試管變渾濁，說(shuō)明菌種已復(fù)蘇。

將培養(yǎng)基在滅菌培養(yǎng)皿倒平板，冷卻凝固，用接種針挑取少許復(fù)蘇后標(biāo)準(zhǔn)菌種劃線接種，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h活化。經(jīng)復(fù)蘇轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后，分別取新傳代變異鏈球菌置于已滅菌的裝有2mL培養(yǎng)基的有蓋試管中，加入適量葡萄糖溶液，37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)液用腦心浸出液培養(yǎng)基稀釋，充分震蕩后并用經(jīng)麥?zhǔn)媳葷峁芊ㄕ{(diào)整菌液濃度為109CFU·mL-1。

2.5.2 方法與實(shí)驗(yàn) 將蟲草花黃酮提取物置于水浴鍋上蒸干的粉末置于干燥器中保存，取適量蟲草花樣品稀釋至50，25，12.5，4.625，3.125，1.5625，0.78125mg·mL-1。采用K-B瓊脂擴(kuò)散法對(duì)蟲草花總黃酮提取物做對(duì)變異鏈球菌的藥敏試驗(yàn)。將培養(yǎng)好的變異鏈球菌用移液槍吸取100μL于培養(yǎng)皿上，用滅菌棒鋪勻，在瓊脂板上均勻打孔，再用移液槍依次加入不同濃度的樣品溶液，37℃培養(yǎng)24h以后，記錄抑菌圈直徑大小判定結(jié)果。

判定標(biāo)準(zhǔn) 抑菌圈直徑大于20mm以上為高度敏感，10～20mm為中度敏感，10mm以下為不敏感。

2.5.3 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)“2.5.2”的方法，實(shí)驗(yàn)測(cè)定了不同濃度蟲草花提取物對(duì)變異鏈球菌的藥敏實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 蟲草花對(duì)變異鏈球菌的藥敏實(shí)驗(yàn)Fig.5 Drug susceptibility test of cordyceps sinensis flowers to streptococcus mutans

表8 蟲草花總黃酮對(duì)變異鏈球菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Drug sensitivity test results of total flavonoids from cordyceps sinensis flowers to Streptococcus mutans

由表8可知，蟲草花總黃酮提取物對(duì)變異鏈球菌有明顯的抑制作用，蟲草花總黃酮提取物在濃度大于50mg·mL-1時(shí)，對(duì)變異鏈球菌藥敏實(shí)驗(yàn)高度敏感，在濃度為6.25～25.00mg·mL-1時(shí)中度敏感，在濃度低于3.13mg·mL-1后不敏感。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)用Al（NO）3-NaNO2-NaOH比色法測(cè)定4個(gè)不同產(chǎn)地蟲草花總黃酮含量。總黃酮的最佳提取工藝為60%乙醇，料液比（g∶mL）1∶20，提取120min，重復(fù)兩次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)重復(fù)驗(yàn)證，優(yōu)化提取工藝合理可行。4個(gè)不同產(chǎn)地蟲草花的總黃酮含量?jī)?nèi)蒙地區(qū)含量最高為5.36mg·g-1，云南地區(qū)總黃酮含量最低為3.98mg·g-1。從蟲草花總黃酮的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，蟲草花總黃酮對(duì)變異鏈球菌有明顯抑制作用，變異鏈球菌是一種口腔內(nèi)的細(xì)菌，蟲草花作為一種真菌類物質(zhì)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為蟲草花在食品保健品方面的研究及應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。