陳 騁 郭雨軒 師希雄 郭兆斌 馬國源 余群力

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730070)

0 引言

宰后牛肉的細(xì)胞血氧供給功能中斷，引起缺氧應(yīng)激并迫使肌肉代謝方式從氧化轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒?，后者是宰后成熟初期影響牛肉品質(zhì)變化的核心生化反應(yīng)，能夠在短期內(nèi)為肌肉細(xì)胞供能[1]。糖酵解反應(yīng)消耗肌肉中糖原產(chǎn)生乳酸，后者引起肌肉pH值降低進(jìn)而直接影響肌肉的嫩度、色澤、保水性、風(fēng)味等品質(zhì)[2]。宰后成熟過程中糖酵解通量的輕微改變足以引起肌肉關(guān)鍵品質(zhì)的變化，典型的兩種異質(zhì)肉(PSE肉和DFD肉)也與宰后糖酵解水平存在密切關(guān)系[3-4]。因此，揭示宰后肌肉糖酵解反應(yīng)的變化機(jī)制及其調(diào)控機(jī)理，對肌肉最終品質(zhì)的預(yù)測及調(diào)控具有重要意義。

糖酵解反應(yīng)直接受到肌肉細(xì)胞膜糖原運(yùn)載體-1(GLUT-1)、己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PK)等關(guān)鍵因子的調(diào)控[5]。因此，上述關(guān)鍵調(diào)控因子的影響因素及其對宰后肌肉糖酵解的調(diào)控機(jī)制是近年來肉品科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，已經(jīng)證實(shí)腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)穩(wěn)定表達(dá)并通過磷酸化作用激活PFK是啟動糖酵解反應(yīng)的重要途徑[6-7]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)作為上游信號分子，在細(xì)胞缺氧應(yīng)激條件下通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)而啟動糖酵解反應(yīng)，為細(xì)胞維持正常功能提供能量[8-10]。但是，目前尚未證實(shí)宰后成熟過程中肌肉糖酵解的啟動依賴于HIF-1α信號傳導(dǎo)途徑。

宰后牛肉能量代謝能力主要取決于兩方面：一是宰前應(yīng)激水平、宰后糖原物質(zhì)含量以及肌肉內(nèi)環(huán)境[4,11]；二是決定糖酵解反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)(GLUT-1、糖酵解酶)[5-7]。上述關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)受到HIF-1α調(diào)控，HIF-1α在缺氧應(yīng)激時穩(wěn)定表達(dá)，并且由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，與細(xì)胞核中缺氧誘導(dǎo)元件(HRE)結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)GLUT-1和糖酵解酶的基因表達(dá)[10]。但是，宰后牛肉細(xì)胞中是否存在上述調(diào)控機(jī)制及其對牛肉糖酵解水平的影響程度尚有待研究。因此，本文以牛肉作為研究對象，通過分析對照組和抑制劑處理中HIF-1α細(xì)胞分布和表達(dá)水平，解析HIF-1α信號通路對宰后成熟初期牛肉糖酵解水平的影響機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料：飼喂條件相同、健康無病、發(fā)育正常的安格斯雜交公牛6頭(36月齡、體質(zhì)量(550±30)kg)，甘肅康美現(xiàn)代農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司提供。

試驗(yàn)試劑：3-(5′-羥甲基-2′-呋喃基)-1-苯甲基唑(YC-1)、糖原和乳酸檢測試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒，HK、PFK、PK酶活力檢測試劑盒，Sigma-Aldrich公司；兔抗HIF-1α多克隆抗體、兔抗GLUT-1多克隆抗體、肌動蛋白(Actin)多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)英光二抗、牛血清白蛋白(BSA)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)熒光染色液、乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)液，4%多聚甲醛、自發(fā)熒光猝滅劑、抗熒光猝滅封片劑、磷酸鹽平衡生理鹽水(PBS)，武漢塞維爾生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑購于天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Nikon Eclipse C1型正置熒光顯微鏡，日本尼康公司；GelDoc-It310型凝膠成像系統(tǒng)，美國耶拿分析有限公司；170-8280型ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，美國伯樂公司；RM2016型病理切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司；JB-P5型包埋機(jī)，武漢俊杰電子有限公司；KD-P型組織攤片機(jī)，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；BG-subMIDI型電泳儀，北京百晶生物技術(shù)有限公司；UV-1601型酶標(biāo)儀，日本島津公司；TGL-16M型離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV765PC型紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司；FA2004B型電子天平，上海佑科儀器有限公司；XHF-D型高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；PHS-3C型pH計，上海雷磁儀器廠；微量加樣器，法國吉爾森公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī)，江蘇國華電器有限公司；TS-100型脫色搖床，海門其林貝爾儀器制造公司；XW-80A型旋渦混勻器，海門麒麟醫(yī)用儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1樣品采集與處理

安格斯雜交牛擊暈后采用三管齊斷法屠宰，以避免屠宰應(yīng)激引起的糖原過度消耗。胴體進(jìn)行熱蒸汽減菌，并于45 min內(nèi)取背最長肌，除去表面筋膜和脂肪組織并切分成200 g、厚度3 cm的肉塊，將肉塊隨機(jī)分為對照組和HIF-1α抑制劑YC-1處理組，每組3份平行。YC-1處理組按照料液比5 g/mL注射200 μmol/L的YC-1溶液，注射時針頭每隔1 cm插入肉樣中心(約1.5 cm深)；對照組按照相同方法注射0.9%的生理鹽水。將兩組樣品在模擬宰后成熟條件(溫度4℃、風(fēng)速1.5 m/s、相對濕度85%)下，經(jīng)0、6、12、24、48 h成熟，采用液氮快速冷凍后放入-80℃超低溫冰箱中備用。

1.3.2HIF-1α細(xì)胞聚集和核轉(zhuǎn)位檢測

參考文獻(xiàn)[12]的方法，采用單標(biāo)免疫熒光法檢測HIF-1α細(xì)胞聚集和核轉(zhuǎn)位情況。取適量樣品，采用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，用病理切片機(jī)進(jìn)行厚度4 μm的切片，置于二甲苯浸泡30 min后依次采用無水乙醇、85%乙醇、75%乙醇和蒸餾水洗滌，采用EDTA抗原修復(fù)緩沖液(pH值8.0)在95℃條件下進(jìn)行抗原修復(fù)，隨后用PBS(pH值7.4)洗滌3次(每次5 min)并以3%的BSA封閉，在切片上滴加兔抗HIF-1α多克隆抗體(抗體與一抗稀釋液體積比為1∶300)，至于濕盒內(nèi)4℃孵育12 h，用PBS(pH值7.4)洗滌3次，滴加Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)英光二抗(抗體與二抗稀釋液體積比為1∶100)，避光室溫(20℃)孵育60 min，用PBS(pH值7.4)洗滌3次，滴加DAPI染色液，室溫孵育10 min，再次用PBS(pH值7.4)洗滌3次，滴加自發(fā)熒光猝滅劑，靜置5 min后蒸餾水沖洗，切片緩慢甩干并用抗熒光猝滅封片劑封片。采用全景切片掃描儀進(jìn)行鏡檢拍照，細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色，在紫外激發(fā)波長330～380 nm、發(fā)射波長420 nm下呈藍(lán)光；HIF-1α經(jīng)Cy3染色，在激發(fā)波長510～560 nm、發(fā)射波長590 nm下呈紅光。HIF-1α細(xì)胞聚集水平采用陽性細(xì)胞強(qiáng)度表示。

1.3.3HIF-1α和GLUT-1表達(dá)水平測定

采用Western blot法測定HIF-1α和GLUT-1表達(dá)水平。參考文獻(xiàn)[2]的方法提取蛋白質(zhì)，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，采用PBS(pH值7.4)緩沖液調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)量濃度至5 mg/mL，采用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)(5%分離膠、10%濃縮膠)分離蛋白并電泳轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂乳粉封閉1 h，分別加入兔抗HIF-1α多克隆抗體(抗體與一抗稀釋液體積比為1∶1 000)、兔抗GLUT-1多克隆抗體(抗體與一抗稀釋液體積比為1∶1 000)、肌動蛋白(Actin)多克隆抗體(抗體與一抗稀釋液體積比為1∶1 000)，4℃搖床孵育12 h，洗滌3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(抗體與二抗稀釋液體積比為1∶500)，室溫避光孵育1 h并洗滌3次，ECL(增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑)試劑盒化學(xué)發(fā)光。采用凝膠成像系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)拍照和定量，蛋白表達(dá)水平分別以目標(biāo)蛋白光密度與內(nèi)參蛋白光密度的比值表示。

1.3.4糖酵解限速酶活力測定

參考文獻(xiàn)[13]的方法制備樣品。取1.0 g切碎的肉樣，加入9 mL濃度為10 mmol/L的提取液(80 mmol/L K2HPO4，15 mmol/L KH2PO4，25 mmol/L KCl，1.2 mol/L NaCl，pH值7.4，4℃)，冰浴條件下12 000 r/min勻漿30 s，然后4℃、13 000g條件下離心15 min，取上清液。分別采用酶活力檢測試劑盒測定HK、PFK和PK的酶活力。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，酶活力單位定義：1 g組織蛋白與基質(zhì)作用1 min后將1 μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，則酶活力為1 U/g。

1.3.5糖酵解水平測定

糖原含量測定：參考文獻(xiàn)[2]的方法制備樣品。取0.5 g切碎的肉樣，加入1.5 mL濃度為2 mol/L的NaOH溶液，煮沸20 min后冷卻，加入8 mL超純水，在5 000g條件下離心10 min，取上清液。采用糖原檢測試劑盒測定上清液中糖原含量(質(zhì)量摩爾濃度)，單位為μmol/g。

乳酸含量測定：參考文獻(xiàn)[14]的方法制備樣品。稱取0.5 g切碎的肉樣，加入4.5 mL生理鹽水(4℃)，冰浴條件下12 000 r/min勻漿30 s，然后在4℃、3 000g條件下離心15 min，取上清液。采用乳酸檢測試劑盒測定上清液中乳酸含量(質(zhì)量摩爾濃度)，單位為μmol/g。

糖酵解潛力計算：參考文獻(xiàn)[14]的方法，根據(jù)糖原和乳酸含量計算肉樣糖酵解潛力，計算公式為

G=2A+B

式中G——糖酵解潛力，μmol/g

A——糖原含量，μmol/g

B——乳酸含量，μmol/g

1.3.6pH值測定

參考文獻(xiàn)[7]的方法，采用便攜式pH計測定，將探針插入肉樣約2 cm處，待pH計數(shù)值信號穩(wěn)定后讀取數(shù)值，連續(xù)測定5次后取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗(yàn)中所有指標(biāo)測定至少作3次重復(fù)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和指標(biāo)間的相關(guān)性分析，采用Duncan多重比較法進(jìn)行均值間差異顯著性分析(P<0.05)。采用Origin Pro 2018軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HIF-1α細(xì)胞聚集和核轉(zhuǎn)位

HIF-1α作為動物細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧應(yīng)激時穩(wěn)定表達(dá)并直接調(diào)控GLUT-1和90%以上糖酵解酶的基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞以糖酵解途徑產(chǎn)生ATP以適應(yīng)低氧環(huán)境[9,15]。但是，上述機(jī)制建立在HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)并向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，與細(xì)胞核中HRE中靶基因結(jié)合的基礎(chǔ)上[10]。采用免疫熒光標(biāo)記方法測定了宰后成熟初期HIF-1α在牛肉細(xì)胞中表達(dá)聚集和核轉(zhuǎn)位的情況。由圖1(圖中*表示差異顯著，P<0.05)可以看出，宰后成熟0 h時YC-1處理組與對照組的陽性細(xì)胞強(qiáng)度和細(xì)胞聚情況相似。隨著宰后成熟時間延長，對照組中HIF-1α陽性細(xì)胞強(qiáng)度明顯升高，在6～48 h分別是YC-1處理組的1.97、2.37、1.44、1.40倍(P<0.05)，表明宰后成熟初期HIF-1α在牛肉細(xì)胞中表達(dá)并穩(wěn)定聚集，專一性抑制劑YC-1能夠顯著抑制HIF-1α積累。此外，從圖1的免疫熒光圖像可以看出，對照組中HIF-1α在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)聚集，并且向細(xì)胞核發(fā)生轉(zhuǎn)移(圖中箭頭所示)，而在YC-1處理組中HIF-1α的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象不明顯。HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)受到上游信號途徑影響，牛肉宰后成熟過程中HIF-1α的穩(wěn)定積累可能與肌肉中產(chǎn)生的活性氧(ROS)有關(guān)，缺氧條件下H2O2為主的ROS信號分子能夠迅速激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路，后者通過激活哺乳動物雷帕霉素(mTOR)表達(dá)而促進(jìn)HIF-1α與HRE結(jié)合，激活HRE中GLUT-1、糖酵解限速酶等關(guān)鍵蛋白質(zhì)基因表達(dá)[10]。而文獻(xiàn)[16-17]證實(shí)牛肉和羊肉宰后成熟過程中產(chǎn)生的大量H2O2具備信號分子功能，可能通過上述途徑促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)。此外，文獻(xiàn)[14]研究發(fā)現(xiàn)豬肉HIF-1α表達(dá)水平能夠引起宰后成熟期間肌肉中糖酵解限速酶活力顯著變化，進(jìn)而直接影響豬肉糖酵解速率。因此，本研究宰后成熟初期檢測到HIF-1α在細(xì)胞中表達(dá)并向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移聚集，具備了調(diào)節(jié)下游糖酵解相關(guān)蛋白質(zhì)基因表達(dá)的前提條件。

圖1 宰后成熟過程中牛肉細(xì)胞HIF-1α聚集和核轉(zhuǎn)位情況變化(放大倍數(shù)為500倍)Fig.1 Changes of cellular aggregation and nuclear translocation of HIF-1α in bovine muscle during postmortem aging (magnified for 500 times)

2.2 HIF-1α和GLUT-1表達(dá)水平

采用蛋白質(zhì)免疫進(jìn)一步測定HIF-1α及其對糖酵解關(guān)鍵蛋白質(zhì)GLUT-1表達(dá)水平的影響。由圖2(圖中不同大小寫字母分別表示同一處理組在不同成熟時間點(diǎn)指標(biāo)差異顯著，*表示不同處理組在相同成熟時間點(diǎn)指標(biāo)差異顯著，P<0.05，下同)可以看出，兩組樣品中HIF-1α蛋白表達(dá)水平在0 h無顯著性差異，對照組HIF-1α蛋白表達(dá)水平在0～48 h內(nèi)呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在6 h達(dá)到最大值，表達(dá)量相對于0 h顯著升高了1.20倍(P<0.05)，在24 h開始出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)。YC-1處理組中HIF-1α蛋白表達(dá)水平除6 h外總體未表現(xiàn)出顯著差異。對照組HIF-1α蛋白表達(dá)水平在6～48 h分別是YC-1處理組的2.89、4.01、1.92、1.40倍(P<0.05)。該研究結(jié)果與圖1(圖中紅色標(biāo)記為HIF-1α，藍(lán)色標(biāo)記為細(xì)胞核)顯示的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了宰后成熟初期HIF-1α在牛肉細(xì)胞中迅速積累。

圖2 宰后成熟過程中牛肉HIF-1α蛋白表達(dá)水平變化Fig.2 Changes of HIF-1α expression levels in bovine muscle during postmortem aging

GLUT-1作為HIF-1α通路中的下游靶蛋白，在糖酵解反應(yīng)中發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)底物糖原的重要作用，是糖酵解酶以外能夠直接影響糖酵解能力的關(guān)鍵蛋白質(zhì)[18]。由圖3可以看出，GLUT-1蛋白表達(dá)水平與HIF-1α呈現(xiàn)相似的變化趨勢。對照組中GLUT-1蛋白表達(dá)水平在6 h達(dá)到最大水平，表達(dá)量相比于0 h顯著升高了1.91倍(P<0.05)，從12 h開始出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)。對照組中GLUT-1蛋白表達(dá)水平在6～24 h分別是YC-1處理組的3.78、1.71、1.5倍(P<0.05)。此外，YC-1處理組中GLUT-1蛋白表達(dá)水平在12～48 h出現(xiàn)顯著升高趨勢(P<0.05)，這可能是由YC-1組中少量表達(dá)的HIF-1α對其的激活作用所致。由此可見，宰后成熟初期牛肉中HIF-1α積累能夠激活糖酵解關(guān)鍵蛋白質(zhì)GLUT-1的表達(dá)。在細(xì)胞缺氧應(yīng)激狀態(tài)下，GLUT-1表達(dá)上調(diào)能夠顯著增加細(xì)胞對葡萄糖的攝取，通過增加糖酵解通量來維持細(xì)胞能量供給，提升細(xì)胞的低氧適應(yīng)性[9]。文獻(xiàn)[18]發(fā)現(xiàn)缺氧條件下HIF-1α激活位于細(xì)胞核HRE中的GLUT-1基因序列，后者穩(wěn)定表達(dá)并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜中將葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，保障了糖酵解反應(yīng)的底物供應(yīng)。

圖3 宰后成熟過程中牛肉GLUT-1蛋白表達(dá)水平變化Fig.3 Changes of GLUT-1 expression levels in bovine muscle during postmortem aging

2.3 糖酵解限速酶活力

宰后成熟過程中肌肉糖酵解能力受多種因素的影響，其中HK、PFK和PK這3種限速酶是影響宰后動物肌肉糖酵解能力的關(guān)鍵因素[5-7]。由圖4可以看出，宰后成熟初期對照組中HK酶活力在0～12 h出現(xiàn)顯著升高的趨勢(P<0.05)，YC-1處理組中HK酶活力在相同時間段內(nèi)差異不顯著，兩組樣品HK酶活力在12 h后均顯著降低(P<0.05)。對照組中HK酶活力在成熟6 h和12 h時升高到197.43 U/g和195.87 U/g(P<0.05)，分別是YC-1組的1.14倍和1.08倍(P<0.05)。PFK酶活力變化與HK相似，對照組中PFK酶活力同樣在0～12 h出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)，而相同時間段內(nèi)YC-1處理組中PFK的酶活力變化不顯著，兩組中PFK酶活力在12 h后均出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)。對照組中PFK酶活力在6 h和12 h時分別升高到25.77 U/g和27.33 U/g(P<0.05)，且在6～24 h內(nèi)分別是YC-1處理組的1.29、1.33、1.22倍(P<0.05)。兩組樣品PK酶活力未表現(xiàn)出明顯差異，但隨著成熟時間延長呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(P<0.05)。由相關(guān)性分析結(jié)果(表1)可以看出，對照組中HIF-1α在正常表達(dá)的情況下表達(dá)水平與HK和PFK酶活力呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，且相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.838和0.929，而采用YC-1抑制宰后成熟初期HIF-1α的表達(dá)后，HIF-1α表達(dá)水平與糖酵解限速酶活力未呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)宰后成熟初期HIF-1α積累能夠提升HK和PFK酶活力。

圖4 宰后成熟過程中牛肉糖酵解限速酶活力變化曲線Fig.4 Changes of glycolysis rate-limiting enzyme activity in bovine muscle during postmortem aging

表1 宰后成熟過程中牛肉HIF-1α表達(dá)水平與糖酵解限速酶活力的相關(guān)性分析Tab.1 Correlation analysis of HIF-1α expression levels and glycolysis rate-limiting enzyme activity in bovine muscle during postmortem aging

文獻(xiàn)[19]發(fā)現(xiàn)豬肉宰后在不同條件下貯藏時表現(xiàn)出較高的糖酵解水平，其HK酶活力在冷藏(4℃)和冰溫貯藏(-1℃)初期(0.5～6 h)均顯著升高，并且與豬肉乳酸含量相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.806(P<0.05)，而PFK和PK酶活力在貯藏初期也均處于相對較高水平。近期相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)應(yīng)激條件能夠上調(diào)雞肉中HK、PFK、乳酸脫氫酶(LDH)等糖酵解酶的基因表達(dá)途徑，從而提升酶活力和糖酵解能力[20-22]。缺氧應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞中HIF-1α信號通路能夠激活90%以上的糖酵解酶[9]，本研究發(fā)現(xiàn)對照組中HIF-1α表達(dá)水平與HK和PFK酶活力顯著正相關(guān)(P<0.05)，而當(dāng)HIF-1α表達(dá)受到抑制后與糖酵解酶活力未呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，一方面證實(shí)宰后成熟初期牛肉中HK和PFK酶活力升高可能是HIF-1α在缺氧應(yīng)激條件下大量積累的結(jié)果，另一方面也說明HIF-1α對糖酵解限速酶活力的調(diào)控作用主要表現(xiàn)在宰后成熟的初期，隨著成熟時間延長，酶活力可能受到其他內(nèi)環(huán)境因素的影響。此外，文獻(xiàn)[23]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞糖酵解代謝途徑中，GLUT-1表達(dá)上調(diào)與HK酶活力升高伴隨出現(xiàn)，在提升細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程中發(fā)揮著重要作用，本研究也發(fā)現(xiàn)在相同時間段內(nèi)GLUT-1蛋白表達(dá)水平與HK酶活力存在相同的變化趨勢。由此可見，牛肉宰后成熟初期HIF-1α通路在GLUT-1表達(dá)和HK、PFK激活中發(fā)揮重要作用。

2.4 糖酵解水平

為進(jìn)一步探究HIF-1α對牛肉成熟期間糖酵解水平的影響，對樣品糖原和乳酸含量進(jìn)行測定。由圖5可以看出，兩組樣品糖原含量隨著成熟時間延長均呈現(xiàn)顯著降低的趨勢，成熟48 h內(nèi)對照組和YC-1處理組糖原含量分別降低至0 h的19%和43%(P<0.05)，并且對照組糖原含量在6～48 h始終顯著低于YC-1處理組(P<0.05)。樣品乳酸含量變化與糖原含量變化呈對應(yīng)關(guān)系，兩組樣品乳酸含量隨著成熟時間延長均顯著升高，對照組和YC-1處理組分別在成熟24 h和48 h達(dá)到最高水平，相對于0 h時分別升高2.44倍和1.89倍(P<0.05)，并且對照組乳酸含量在6～48 h顯著高于YC-1處理組(P<0.05)。以上結(jié)果表明，相對較高的HIF-1α表達(dá)水平下，牛肉成熟期間相應(yīng)表現(xiàn)出顯著較高的糖原分解和乳酸積累速率。采用糖酵解潛力指標(biāo)進(jìn)行總體評價(如圖6所示)，兩組樣品糖酵解潛力表現(xiàn)出不同的變化趨勢，對照組糖酵解潛力呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在成熟0～12 h顯著升高1.10倍(P<0.05)，在12 h后糖酵解潛力顯著降低(P<0.05)。YC-1處理組在成熟0～24 h內(nèi)變化不顯著，24～48 h內(nèi)出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)。對照組糖酵解潛力在成熟6～24 h內(nèi)始終保持顯著較高的水平(P<0.05)。對照組在成熟6～24 h內(nèi)HIF-1α、GLUT-1表達(dá)水平和HK、PFK酶活力均處于顯著較高的水平，這些因素可能是導(dǎo)致牛肉糖酵解潛力顯著提升的主要原因。

圖5 宰后成熟過程中牛肉糖原和乳酸含量變化曲線Fig.5 Changes of glycogen and lactate contents in bovine muscle during postmortem aging

圖6 宰后成熟過程中牛肉糖酵解潛力變化曲線Fig.6 Changes of glycolytic potential in bovine muscle during postmortem aging

目前，肉類科學(xué)領(lǐng)域的研究尚未明確解釋宰后成熟過程中動物肌肉中HIF-1α調(diào)控糖酵解反應(yīng)的具體機(jī)制，但醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究已經(jīng)證實(shí)HIF-1α在低氧狀態(tài)下通過激活GLUT-1和糖酵解酶基因表達(dá)的通路激活糖酵解為細(xì)胞供能[9]。文獻(xiàn)[10]發(fā)現(xiàn)對血管內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α進(jìn)行基因沉默處理后，細(xì)胞糖酵解酶活力和葡萄糖攝取能力出現(xiàn)顯著降低，同時檢測到糖酵解酶的表達(dá)水平下降。而文獻(xiàn)[24]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α穩(wěn)定劑二甲氧乙二酰甘氨(DMOG)能夠顯著提升HIF-1α表達(dá)水平并且加快細(xì)胞糖酵解速率。此外，文獻(xiàn)[25]發(fā)現(xiàn)在缺氧狀態(tài)下細(xì)胞中HIF-1α的半衰期從30 min延長至2～4 h，有助于其自身積累并誘導(dǎo)糖酵解酶等關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)，保障細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下保持較高的糖酵解能力。本研究中也發(fā)現(xiàn)對照組中HIF-1α在成熟0～6 h顯著積累且在6～24 h內(nèi)保持顯著較高水平，從而使牛肉糖酵解潛力在0～12 h迅速提升，這與之前GLUT-1蛋白表達(dá)水平和HK、PFK酶活力變化規(guī)律相吻合。因此，牛肉宰后成熟初期HIF-1α積累并通過調(diào)控下游糖酵解關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)，對提升牛肉糖酵解能力起著重要作用。

2.5 pH值

作為評價牛肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，pH值與肌原纖維蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞凋亡、高鐵肌紅蛋白還原系統(tǒng)等一系列生化途徑存在密切聯(lián)系，直接影響肌肉嫩度、保水性、色澤、風(fēng)味等關(guān)鍵品質(zhì)的形成[2,26]。宰后成熟過程中糖酵解反應(yīng)的速率和程度是影響pH值變化的決定因素[27]。由圖7可以看出，兩組樣品pH值在0 h無顯著差異，但隨著成熟時間延長均顯著降低(P<0.05)。對照組和YC-1處理組的pH值分別在0～12 h和2～24 h出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)，且對照組的pH值在6～24 h內(nèi)顯著低于YC-1處理組(P<0.05)。兩組樣品的極限pH值(pHu值)分別為5.51和5.71，均處于正常水平范圍內(nèi)，但是對照組達(dá)到pHu值所用時間比YC-1處理組提前了12 h，這與對照組顯著較高的糖酵解能力存在密切聯(lián)系。糖酵解反應(yīng)啟動后，肌肉中糖原首先分解為葡萄糖，葡萄糖經(jīng)過酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，生成的ATP為細(xì)胞供能的同時乳酸迅速積累并導(dǎo)致肌肉pH值降低[28]，而上述過程中GLUT-1和糖酵解酶的酶活力受到上游HIF-1α的調(diào)控[9,15]。本研究中對照組HIF-1α表達(dá)水平在宰后初期(0～6 h)顯著上調(diào)，并在之后的6～24 h分別表現(xiàn)出顯著較高的GLUT-1表達(dá)水平、HK和PFK酶活力、糖酵解潛力以及顯著較快的pH值下降速率，說明在宰后成熟初期HIF-1α作為上游調(diào)控因子，通過誘導(dǎo)下游關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)和活化部分限速酶的途徑加速糖酵解，從而引起pH值降低快速降低。但是，隨著成熟時間延長，肌肉中糖原的大量消耗，且限速酶活力受到pH值的抑制，最終導(dǎo)致糖酵解潛力下降[29-30]，這也解釋了本研究中兩組樣品中糖酵解限速酶活力、糖酵解潛力隨著成熟時間延長而降低。

圖7 宰后成熟過程中牛肉pH值變化曲線Fig.7 Changes of pH values in bovine muscle during postmortem aging

3 結(jié)束語

宰后成熟初期HIF-1α在細(xì)胞中迅速表達(dá)積累并向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，一方面調(diào)控細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵蛋白質(zhì)GLUT-1表達(dá)上調(diào)，保障糖酵解底物糖原的供應(yīng)，另一方面誘導(dǎo)糖酵解限速酶HK和PFK酶活力升高，有利于提升糖酵解反應(yīng)速率。在上述調(diào)控機(jī)制作用下，宰后成熟初期牛肉糖酵解潛力顯著升高，糖原迅速消耗、乳酸大量積累，促使牛肉pH值在短期內(nèi)快速下降并達(dá)到pHu值。同時，由于pH值降低后對糖酵解酶活力的抑制作用以及糖原的大量消耗，糖酵解潛力隨著成熟時間延長而顯著降低，使HIF-1α對宰后成熟過程中牛肉糖酵解能力的調(diào)控作用表現(xiàn)出局限性。此外，采用YC-1抑制HIF-1α表達(dá)后，能夠干擾HIF-1α及其下游關(guān)鍵蛋白質(zhì)對牛肉糖酵解進(jìn)程的調(diào)控作用，進(jìn)一步證實(shí)HIF-1α信號通路是提升牛肉糖酵解能力重要途徑。