姬 琛，楊 波，羅瑞明,,*，劉吉娟

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；3.寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

灘羊是廣泛分布于寧夏、甘肅、陜西等地的區(qū)域性家畜品種，具有重要的食用及經(jīng)濟價值。肌肉轉(zhuǎn)化為肉的過程始于呼吸和血液循環(huán)的停止。當(dāng)受到缺氧缺血信號刺激時，組織內(nèi)部發(fā)生一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，細(xì)胞/組織為了維持平衡，通過糖酵解產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），從而調(diào)控肉品質(zhì)形成過程。因此，研究宰后成熟過程中糖酵解的生化調(diào)控對于了解肉品質(zhì)特性的發(fā)展至關(guān)重要。

缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）是一種廣泛存在于哺乳動物骨骼肌中的轉(zhuǎn)錄因子，由HIF-1α和HIF-1β亞基組成，在機體缺氧反應(yīng)和適應(yīng)中起主導(dǎo)作用，其活性主要取決于HIF-1α蛋白質(zhì)的表達水平。正常條件下，由于HIF-1α迅速被降解無法合成HIF-1，而缺氧條件下，穩(wěn)定的HIF-1α與HIF-1β結(jié)合，激活許多靶基因，進而維持機體的正常功能，如調(diào)節(jié)糖代謝。Sun Lianlian等的研究結(jié)果表明HIF-1α可將刺參代謝從氧化磷酸化轉(zhuǎn)化為糖酵解，以應(yīng)對病原體的挑戰(zhàn)。Verma等的研究結(jié)果表明HIF-1通過調(diào)節(jié)靶基因葡萄糖轉(zhuǎn)運子、乳酸脫氫酶等促進糖酵解。因此，HIF-1對于活體中糖酵解有重要的調(diào)控作用。

糖酵解是宰后成熟過程中重要的代謝過程，對肉的色澤、保水性、嫩度、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味均有重要影響。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)灘羊肉中磷酸丙糖異構(gòu)酶（triosephosphate isomerase，TPI）在8 d的成熟過程中表達量先上升后下降，且與0 d比較，4 d其表達量上調(diào)近2 倍。Zhang Ying等研究發(fā)現(xiàn)HIF-1通過調(diào)節(jié)血管發(fā)育、血管生成的能量代謝、血管平滑肌收縮和各種缺氧相關(guān)信號通路調(diào)控藏雞的缺氧適應(yīng)性。然而，宰后肉品質(zhì)形成過程中HIF-1是否同樣具有重要作用，以及宰后HIF-1對糖酵解是否同樣具有調(diào)節(jié)作用，目前鮮見相關(guān)研究報道。由于宰后肉品質(zhì)形成同樣由缺氧缺血信號調(diào)節(jié)啟始，因此，本研究假設(shè)HIF-1在宰后成熟過程中對糖酵解關(guān)鍵酶、能量水平及肉品質(zhì)有重要影響，故選取4 ℃成熟2、6、12、24、48 h的灘羊背最長肌為研究對象，測定不同成熟期HIF-1表達量的變化，確定其與能量水平、糖酵解關(guān)鍵酶TPI活力及肉色變化的關(guān)系，以期為宰后肉品品質(zhì)形成提供新的思路及見解。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灘羊背最長肌購于寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司。選取9 只體質(zhì)量相近的6 月齡公灘羊，屠宰前統(tǒng)一管理。屠宰后立即采集其右側(cè)胴體的背最長肌，剔除可見脂肪與結(jié)締組織后放置于保鮮袋中，于4 ℃、風(fēng)速3 m/s、相對濕度85%條件下成熟。

羊HIF-1試劑盒、TPI、ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）試劑盒 上海科興生物科技有限公司；多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基酯酶、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、硫酸、醋酸鈉、檸檬酸、HO、乙二胺四乙酸鈉、甘油、四甲基聯(lián)苯胺（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DW3.0.1型超低溫冰箱 無錫冠亞恒溫制冷技術(shù)有限公司；352型酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems Multiskan MS公司；AC8型洗板機 芬蘭雷勃公司；TG16W型離心機湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；GNP-9080型恒溫培養(yǎng)箱 上海昕儀儀器儀表有限公司；便攜式數(shù)字pH計上海德圖儀器國際貿(mào)易有限公司；CR-400型色差儀日本柯尼卡美能達公司；FA2104型電子天平 杭州萬特衡器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

分別采集宰后于溫度4 ℃、風(fēng)速3 m/s、相對濕度85%條件下成熟2、6、12、24、48 h的灘羊背最長肌200 g，用于測定pH值與肉色；分別采集不同成熟時間樣本5 g封裝于滅菌冷凍管中，置于液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱備用，用于測定能量水平、TPI活力及HIF-1表達量。

1.3.2 pH值測定

使用便攜式數(shù)字pH計測量肌肉pH值。使用前以pH 9.18、6.86和4.0的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正pH計。

1.3.3 肉色測定

剔除可見脂肪與結(jié)締組織后將樣品修整為6 cm×6 cm×2 cm的塊狀，采用色差儀測定樣品的*、*、*值。光源為D65，觀察角度為10°，孔徑為8 mm，測定前以白板校正色差儀。

1.3.4 HIF-1表達量、TPI活力及能量物質(zhì)水平測定

根據(jù)相關(guān)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒操作說明書測定ATP、ADP、AMP水平及HIF-1表達量與TPI活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個指標(biāo)重復(fù)測定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析并進行鄧肯多元方差檢驗后采用Origin軟件繪圖。＜0.05為差異顯著，＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 灘羊肉宰后成熟初期pH值及肉色變化

由表1可知，灘羊肉宰后2～48 h pH值顯著下降（＜0.05），12～48 h內(nèi)降幅較大。這一結(jié)果與陳煉紅等對牦牛肉4 ℃成熟6～72 h內(nèi)pH值變化規(guī)律的研究結(jié)果基本一致。宰后由于缺氧缺血，糖酵解作為細(xì)胞的主要能量來源，除產(chǎn)生ATP外還會生成丙酮酸及乳酸，且ATP水解產(chǎn)生的磷酸均會促使pH值下降；另外，有研究表明宰后蛋白質(zhì)降解也會引起肌肉pH值下降。肉色是消費者判斷鮮肉貨架期的重要指標(biāo)之一，是影響消費者購買行為的決定因素。宰后成熟期間肉色主要由肌紅蛋白的氧化還原狀態(tài)決定。宰后2～6 h內(nèi)*值無顯著變化（＞0.05），6～48 h內(nèi)*值顯著上升（＜0.05），*值表示亮度，能夠反映肉色的穩(wěn)定性，6～48 h內(nèi)*值顯著升高可能是隨著宰后糖酵解的進行肌肉pH值逐漸下降，當(dāng)pH值降至蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)對于不易流動水的吸附作用降低，導(dǎo)致貯存于肌肉結(jié)構(gòu)中的不易流動水轉(zhuǎn)化為自由水，當(dāng)自由水附著于肌肉表面時會增強光的反射，致使*值升高。*值代表紅度，是決定鮮肉色澤的關(guān)鍵參數(shù)，灘羊宰后2～6 h內(nèi)*值無顯著變化（＞0.05），6～48 h內(nèi)顯著升高（＜0.05），這一變化趨勢與李兆亭等的研究結(jié)果一致，表明宰后48 h內(nèi)隨著成熟時間的延長，灘羊肉逐漸呈現(xiàn)櫻桃紅色，可能是由于宰后隨著時間延長，較多的肌紅蛋白與氧結(jié)合，形成紅色的氧合肌紅蛋白，致使*值升高。宰后48 h內(nèi)*值逐漸升高，可能是氧合肌紅蛋白被進一步氧化為褐色的高鐵肌紅蛋白，且該反應(yīng)不可逆所致。

表1 灘羊肉宰后成熟初期肉色及pH值的變化Table 1 Changes in meat color and pH in Tan sheep meat at the early stage of postmortem aging

2.2 灘羊肉宰后成熟初期HIF-1表達量的變化

大量研究證實HIF-1是多種動物、組織及器官缺氧環(huán)境適應(yīng)性的關(guān)鍵調(diào)控因子，如牦牛、藏雞、秀麗隱桿線蟲等，然而HIF-1在動物屠宰后對于代謝的調(diào)控作用仍缺乏研究。圖1所示為宰后2～48 h內(nèi)灘羊肉中HIF-1表達量變化，宰后2～24 h內(nèi)HIF-1表達量呈顯著升高的趨勢（＜0.05），并于24 h達到最大值，為2 h時的1.43 倍，與24 h相比，48 h時HIF-1表達量無顯著變化（＞0.05），但48 h HIF-1表達量仍顯著高于2 h時HIF-1表達量（＜0.05），為2 h時的1.40 倍。6 h時HIF-1表達水平上升至2 h時的1.25 倍，表明宰后由于呼吸與血液循環(huán)的停止，灘羊肌細(xì)胞立即處于缺氧狀態(tài)，受缺氧信號的調(diào)控，迅速合成HIF-1復(fù)合體。HIF-1的轉(zhuǎn)錄主要受HIF-1α亞基調(diào)控，而HIF-1α是細(xì)胞對缺氧反應(yīng)的重要元件，生理水平條件下由于細(xì)胞內(nèi)氧含量充足，HIF-1α蛋白迅速通過von Hippel-Lindau蛋白因子途徑降解；缺氧條件下，穩(wěn)定的HIF-1α與HIF-1β形成HIF-1復(fù)合體，并與靶基因結(jié)合，促進一系列基因的表達，調(diào)控機體對缺氧條件的反應(yīng)和適應(yīng)。本研究中HIF-1表達量于宰后6 h內(nèi)迅速升高可能是由于穩(wěn)定的HIF-1α與HIF-1β形成了HIF-1復(fù)合體，導(dǎo)致短時間內(nèi)HIF-1迅速積累，這說明HIF-1在宰后細(xì)胞/組織內(nèi)的形成過程可能與其在活體中的形成過程類似，均受到缺氧信號的調(diào)節(jié)，該過程可能反映了動物宰后短期內(nèi)細(xì)胞/組織對于缺氧缺血的調(diào)節(jié)機制。

圖1 灘羊肉宰后成熟初期HIF-1的表達量Fig. 1 Expression level of HIF-1 in Tan sheep meat at the early stage of postmortem aging

2.3 灘羊肉宰后成熟初期TPI活力的變化

TPI是糖酵解過程的關(guān)鍵酶，宰后成熟過程中少量有效能量的產(chǎn)生受糖酵解的調(diào)控。如圖2所示，宰后TPI活力在6 h內(nèi)顯著升高（＜0.05），并于6 h達到最大值，為2 h時的1.07 倍，48 h時顯著降至2 h時的0.73 倍（＜0.05），表明宰后6 h灘羊肌細(xì)胞中糖酵解可能已被激活。林珩迅等研究發(fā)現(xiàn)豬肉在4 ℃條件下成熟時，TPI活力先升高后降低，并于宰后6 h達到最大值，本研究結(jié)果與其一致。尤麗琴等研究發(fā)現(xiàn)灘羊背最長肌于4 ℃下成熟4 d時，糖原磷酸化酶、TPI、丙酮酸激酶、磷酸甘油酸異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶等糖酵解關(guān)鍵酶表達量均顯著上調(diào)。Schoepflin等研究表明HIF-1形成后立即轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核并結(jié)合特定的序列。Kumar等認(rèn)為生理水平條件下，HIF-1的靶基因通過介導(dǎo)紅細(xì)胞生成或誘導(dǎo)血管生成從而增加氧氣運輸；或通過增加葡萄糖轉(zhuǎn)運子和糖酵解酶表達，在低氧狀態(tài)下改善組織功能。然而，動物屠宰后機體不能通過紅細(xì)胞生成或血管生成增加氧氣運輸，只能通過調(diào)整糖代謝以適應(yīng)缺氧條件，因此，本研究中TPI活力變化可能是由于動物屠宰后缺氧缺血促使6 h內(nèi)HIF-1表達量迅速升高，HIF-1轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核后與靶基因結(jié)合，通過調(diào)節(jié)靶基因促進糖酵解，促使TPI活力升高，以上結(jié)果進一步說明HIF-1在宰后成熟過程中對糖酵解的調(diào)控作用可能與其在活體中類似。

圖2 灘羊肉宰后成熟初期TPI活力變化Fig. 2 Activity of TPI in Tan sheep meat at the early stage of postmortem aging

2.4 灘羊肉宰后成熟初期能量水平的變化

表2所示為灘羊肉宰后成熟初期能量物質(zhì)的變化趨勢。ATP是生物體內(nèi)能量的直接來源，通過水解為機體供能，也是宰后成熟過程中發(fā)生各種生理生化反應(yīng)的必要條件。宰后成熟過程中，由于缺氧缺血，組織不能通過有氧呼吸產(chǎn)生能量，此時，磷酸肌酸在肌酸激酶的催化下將ADP磷酸化為ATP，然而這種轉(zhuǎn)化只能在短時間內(nèi)維持ATP的產(chǎn)生；因此，宰后短時間內(nèi)糖酵解被激活并產(chǎn)生能量。由表2可知，宰后2～48 h內(nèi)ATP水平顯著降低（＜0.05），12 h后ATP水平降幅較大，宰后48 h ATP水平降至成熟初期的最低值，表明宰后初期細(xì)胞內(nèi)的生理活動消耗了有限的ATP，同時，由于組織內(nèi)一系列酶促反應(yīng)，ATP被依次降解為ADP、AMP，導(dǎo)致ATP水平顯著降低。孫志昶研究發(fā)現(xiàn)牦牛背最長肌宰后成熟2～48 h內(nèi)ATP含量顯著下降，本研究結(jié)果與其一致。Tassy等發(fā)現(xiàn)宰后缺氧和糖酵解的加速造成細(xì)胞內(nèi)ATP含量快速減少。宰后成熟初期灘羊肉中ADP水平呈顯著下降趨勢（＜0.05），2～6 h內(nèi)ADP水平降幅較大，AMP水平整體呈下降趨勢。羅輝等對秦川牛宰后4 ℃貯藏過程中能量物質(zhì)變化趨勢的研究表明ATP、ADP、AMP含量均呈下降趨勢。賈青等研究發(fā)現(xiàn)牦牛背最長肌貯藏120 h內(nèi)，ATP、ADP、AMP含量均呈顯著下降趨勢，本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果一致。ATP、ADP、AMP水平均下降可能是由于細(xì)胞/組織在缺氧、缺血條件下所生成的ATP水平大幅降低，受ATP水平降低的影響，ADP、AMP水平也隨之降低。高永芳等研究表明，4 ℃貯藏72 h后未處理的牛背最長肌中ATP含量顯著降低，貯藏24～72 h內(nèi)ADP含量升高，AMP含量于12～24 h內(nèi)升高，本研究結(jié)果與其不一致，可能是物種之間存在差異所致。

表2 灘羊肉宰后成熟初期ATP、ADP和AMP水平的變化Table 2 Changes in the contents of ATP, ADP and AMP in Tan sheep meat at the early stage of postmortem aging

2.5 灘羊肉宰后成熟初期HIF-1表達量與能量水平、TPI活力、pH值及肉色的關(guān)系

由表3可知，宰后成熟2～48 h內(nèi)灘羊肉HIF-1表達量與TPI活力、能量物質(zhì)水平、肉色及pH值均顯著相關(guān)（＜0.05、＜0.01）。其中，HIF-1表達量與ATP及ADP水平呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與AMP水平呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），與TPI活力及pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與肉色指標(biāo)*值及*值呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），與*值呈顯著正相關(guān)（＜0.05）。此外，ATP水平與pH值呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），與*、*值及*值均呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01）；ADP水平與TPI活力及pH值極顯著正相關(guān)（＜0.01），與*、*值極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與*值顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）；AMP水平與pH值極顯著正相關(guān)（＜0.01），與*值極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與*值顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），與*值沒有顯著相關(guān)性（＞0.05）；TPI活力與pH值呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），與*、*值及*值均呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01）；pH值與*、*值及*值均呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01）。劉秋鳳等研究發(fā)現(xiàn)宰后24 h北京黑豬pH值與*值呈極顯著負(fù)相關(guān)，本研究結(jié)果與其一致。

表3 宰后成熟初期HIF-1表達量與TPI活力、ATP、ADP和AMP水平、肉色及pH值的相關(guān)性分析Table 3 Correlations between the expression level of HIF-1 and TPI activity, ATP, ADP and AMP contents, meat color and pH

相關(guān)性分析結(jié)果表明HIF-1表達量對宰后糖酵解關(guān)鍵酶活力、能量物質(zhì)水平、肌肉pH值及肉色有顯著影響。研究表明，HIF-1是機體適應(yīng)缺氧環(huán)境最重要的因子，HIF-1復(fù)合體形成后立即轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并與靶基因結(jié)合，促進一系列基因的表達，通過級聯(lián)調(diào)控下游靶基因直接影響機體對低氧環(huán)境的反應(yīng)及適應(yīng)。本研究結(jié)果表明，灘羊肉宰后成熟初期HIF-1表達量迅速升高，HIF-1復(fù)合體形成后可能轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與糖酵解基因結(jié)合，促進糖酵解相關(guān)基因表達，促使糖酵解增強，提高了糖酵解酶TPI活力，致使TPI活力于6 h內(nèi)顯著升高；活化的糖酵解酶將糖原轉(zhuǎn)化為乳酸導(dǎo)致乳酸積累，同時伴有丙酮酸的生成，ATP水解生成磷酸，致使肌肉pH值降低；此外，由于宰后糖酵解是組織唯一的供能來源，隨著組織內(nèi)生理生化反應(yīng)的進行，ATP迅速被消耗，且伴隨著水解反應(yīng)的發(fā)生，能量物質(zhì)水平下降。因此，HIF-1可能通過促進糖酵解間接影響了能量物質(zhì)水平及肌肉pH值下降的速度與程度。此外，有研究表明，糖酵解關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶活力越高，肉色越穩(wěn)定。糖酵解決定宰后成熟過程中肌肉pH值下降的速度及程度，而肌肉pH值是影響宰后成熟過程中肉色形成的重要指標(biāo)。張杏亞等研究發(fā)現(xiàn)8 d成熟期內(nèi)，與秦川牛肌紅蛋白衍生態(tài)相關(guān)的酶中糖酵解關(guān)鍵酶烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、乳酸脫氫酶均在成熟期內(nèi)差異表達。辛建增研究表明糖酵解關(guān)鍵酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶催化甘油醛-3-磷酸生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，可還原高鐵肌紅蛋白，進而抑制高鐵肌紅蛋白的累積，提高肉色穩(wěn)定性。綜上，HIF-1可能是引起宰后能量代謝方式轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒獾年P(guān)鍵因素，對于宰后肉品品質(zhì)形成具有重要的調(diào)控作用。

3 結(jié) 論

宰后2～24 h內(nèi)HIF-1表達量迅速升至最高值，24 h后有所下降，TPI活力于宰后6 h時升至最高值，隨后逐漸降低，宰后48 h內(nèi)能量物質(zhì)ATP、ADP、AMP水平均隨成熟時間延長逐漸降低，pH值宰后48 h內(nèi)顯著降低（＜0.05），*、*值及*值均隨成熟時間延長顯著升高（＜0.05）。宰后成熟2～48 h內(nèi)灘羊肉HIF-1表達量與TPI活力、能量物質(zhì)水平、肉色及pH值均顯著相關(guān)（＜0.05、＜0.01），可能是由于受宰后缺氧信號誘導(dǎo)，HIF-1表達量于6 h內(nèi)迅速升高，HIF-1復(fù)合體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與糖酵解基因結(jié)合，促進糖酵解相關(guān)基因表達，促使糖酵解途徑增強，提高了糖酵解相關(guān)酶活力，并降低肌肉pH值。HIF-1可能通過調(diào)控宰后糖酵解及肌肉pH值影響肉色。本研究結(jié)論有助于理解宰后成熟過程中肉品質(zhì)形成的復(fù)雜機理。