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      三氯乙烯致肝纖維化形成的動(dòng)態(tài)變化及其機(jī)制的研究

      2022-05-12 11:02:56吳思蒙王利剛張雪燕王太升張繼紅
      關(guān)鍵詞:染毒網(wǎng)狀低濃度

      吳思蒙 王利剛 張雪燕 王太升 張繼紅?

      1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院,吉林 吉林 132000;2.中國(guó)昆侖工程有限公司吉林分公司,吉林 吉林 132010

      2012年美國(guó)環(huán)保局(US EPA)和國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將(trichloroethylene,TCE)列為1類致癌物[1]。盡管研究人員對(duì)TCE毒性做了大量研究,但TCE導(dǎo)致肝臟纖維化程度及發(fā)病機(jī)制尚不明確。本文研究了吸入三氯乙烯后小鼠肝臟產(chǎn)生不同程度纖維化,以及I型膠原(Collagen I)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α- SMA)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)在小鼠肝組織中的表達(dá)水平。

      1 材料與方法

      1.1 主要試劑與儀器 TCE為分析純(美國(guó)Sigma公司);Collagen I、α-SMA、CTGF(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);顯微鏡(Olympus公司);SYD-B病理石蠟包埋機(jī)(沈陽(yáng)譽(yù)德電子儀器有限公司);RM2245輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司);ZPJ-1展片機(jī)(天津天利航空機(jī)電有限公司);GZX-9070MBE干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);LEICA ASP300S全自動(dòng)組織脫水機(jī);CV5030多功能染色玻璃封片機(jī)。

      1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇健康清潔級(jí)雄性小鼠45只(購(gòu)于長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司),體重16~18g,小鼠被飼養(yǎng)在干凈的動(dòng)物房里,并保持12小時(shí)光照/黑暗的晝夜節(jié)律,飼養(yǎng)條件為溫度22~26℃,相對(duì)濕度45~65%。

      1.3 動(dòng)物染毒與分組 自由進(jìn)食,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為三組,包括清潔空氣對(duì)照組(5只)、低濃度三氯乙烯組1500mg(20只)、高濃度三氯乙烯組5500mg(20只)。采用靜式吸入染毒法,染毒時(shí)用膠帶將染毒柜密封,試驗(yàn)時(shí)將染毒物質(zhì)迅速注入染毒柜內(nèi)有加熱功能的裝置中,打開風(fēng)扇使柜內(nèi)空氣分布均勻。將小鼠暴露于不同濃度的三氯乙烯氣體中,每天染毒2小時(shí),染毒結(jié)束后分別在實(shí)驗(yàn)2個(gè)月、3個(gè)月時(shí),各處死10只小白鼠并在無(wú)菌條件下取出肝臟。

      1.4 觀察指標(biāo)

      1.4.1 組織病理觀察:HE染色,網(wǎng)狀纖維染色。

      1.4.2 免疫組化檢測(cè) 采用Envision法(多聚體兩步法)免疫組化檢測(cè)肝臟組織中α-SMA、Collagen I、CTGF蛋白的表達(dá)。

      1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,用image-pro plus軟件測(cè)得平均光密度值,用±s表示,組內(nèi)比較選用t檢驗(yàn),多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P<0.05則表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié) 果

      2.1 各組小鼠肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果

      2.1.1 HE染色結(jié)果顯示 清潔空氣對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞大小正常,細(xì)胞核呈圓形,胞質(zhì)豐富,并以中央靜脈為圓心,肝細(xì)胞呈放射狀排列,肝索排列規(guī)則。相同濃度的染毒組兩個(gè)月時(shí)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常,肝細(xì)胞腫脹變性,匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰,小葉間纖維結(jié)締輕度增生;三個(gè)月時(shí)肝細(xì)胞變性加重,可見肝細(xì)胞壞死,小葉間可見成纖維樣細(xì)胞,匯管區(qū)和小葉間纖維結(jié)締組織增生,肝索排列紊亂,少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。染毒時(shí)間相同,高濃度組比低濃度組肝細(xì)胞變性和纖維結(jié)締組織增生明顯。

      2.1.2 Masson染色結(jié)果顯示 清潔空氣對(duì)照組肝組織無(wú)明顯膠原纖維增生。相同濃度的染毒組兩個(gè)月時(shí)有少量藍(lán)色膠原纖維增生,三個(gè)月時(shí)藍(lán)色膠原纖維增多。染毒時(shí)間相同時(shí),高劑量組比低劑量組藍(lán)色膠原纖維增多明顯。

      2.1.3 網(wǎng)狀纖維染色結(jié)果顯示 對(duì)照組網(wǎng)狀纖維呈絮網(wǎng)狀均勻分布于肝組織中,未見網(wǎng)狀纖維增粗、融合。各染毒組肝組織內(nèi)網(wǎng)狀纖維失去正常分布狀態(tài),匯管區(qū)周圍網(wǎng)狀纖維均有不同程度增粗。

      2.2 免疫組化染色結(jié)果

      2.2.1 各組α- SMA表達(dá)水平

      染毒組α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05);吸入TCE濃度相同時(shí),染毒三個(gè)月α-SMA蛋白表達(dá)水平高于染毒兩個(gè)月 (P<0.05);吸入TCE時(shí)間相同時(shí),高濃度染毒組α-SMA蛋白表達(dá)水平高于低濃度染毒 (P<0.05),見表1。

      表1 各組小鼠肝組織α-SMA蛋白的表達(dá)(±s n=10)

      表1 各組小鼠肝組織α-SMA蛋白的表達(dá)(±s n=10)

      注:與(A)比較?P<0.05;與(B)比較#P<0.05;與(C)比較※P<0.05;與(D)比較◎P<0.05

      組別α-SMA IOD值(積分光密度值)清潔空氣對(duì)照組(A) 0.022±0.010 2個(gè)月低濃度染毒組(B) 0.266±0.033?2個(gè)月高濃度染毒組(C) 0.475±0.056?#3個(gè)月低濃度染毒組(D) 0.763±0.031?#3個(gè)月高濃度染毒組(E) 0.918±0.333?※◎

      2.2.2 各組Collagen I表達(dá)水平 染毒組Collagen I蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組 (P<0.05);吸入TCE濃度相同時(shí),染毒三個(gè)月Collagen I蛋白表達(dá)水平高于染毒兩個(gè)月 (P<0.05);吸入TCE時(shí)間相同時(shí),高濃度染毒組Collagen I蛋白表達(dá)水平高于低濃度染毒 (P<0.05),見表2。

      表2 各組肝組織Collagen I蛋白的表達(dá)(±s n=10)

      表2 各組肝組織Collagen I蛋白的表達(dá)(±s n=10)

      注:與(A)比較?P<0.05;與(B)比較#P<0.05;與(C)比較※P<0.05;與(D)比較◎P<0.05

      0.014±0.004 2個(gè)月低濃度染毒組(B) 0.030±0.005?2個(gè)月高濃度染毒組(C) 0.053±0.006?#3個(gè)月低濃度染毒組(D) 0.090±0.008?#3個(gè)月高濃度染毒組(E) 0.110±0.006?※◎組別Collagen IIOD值(積分光密度值)清潔空氣對(duì)照組(A)

      2.2.3 各組CTGF表達(dá)水平 染毒組CTGF蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組 (P<0.05);吸入TCE濃度相同時(shí),染毒三個(gè)月CTGF蛋白表達(dá)水平高于染毒兩個(gè)月(P<0.05);吸入TCE時(shí)間相同時(shí),高濃度染毒組CTGF蛋白表達(dá)水平高于低濃度染毒 (P<0.05),及表3。

      表3 各組肝組織CTGF蛋白的表達(dá)(±s n=10)

      表3 各組肝組織CTGF蛋白的表達(dá)(±s n=10)

      注:與(A)比較?P<0.05;與(B)比較#P<0.05;與(C)比較※P<0.05;與(D)比較◎P<0.05

      0.017±0.004 2個(gè)月低濃度染毒組(B) 0.036±0.006?2個(gè)月高濃度染毒組(C) 0.058±0.005?#3個(gè)月低濃度染毒組(D) 0.080±0.007?#3個(gè)月高濃度染毒組(E) 0.108±0.007?※◎組別CTGFIOD值(積分光密度值)清潔空氣對(duì)照組(A)

      3 討 論

      TCE被列為I類致癌物,其職業(yè)暴露途徑主要為經(jīng)呼吸道和皮膚直接接觸,嚴(yán)重威脅職業(yè)性接觸TCE工人的健康。第一次由TCE引起病損的病例在1915年被報(bào)道,主要損傷部位在肝臟[3],纖維化是其中之一。

      HE染色常用來(lái)顯示組織或細(xì)胞一般形態(tài)的改變,也是觀察肝纖維化情況常用的染色方法之一;Masson和網(wǎng)狀纖維染色則是顯示纖維結(jié)締組織的重要染色方法,其能較為準(zhǔn)確地判斷出組織纖維化的嚴(yán)重程度[4]。

      α-SMA是活化的成纖維細(xì)胞的標(biāo)志,參與合成Ⅰ型膠原、Ⅲ 型膠原、纖維連接蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)成分,被認(rèn)為是肝星狀細(xì)胞激活的標(biāo)志性蛋白并與肝纖維化有高度的相關(guān)性。

      Collagen I是誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,其含量的高低在一定程度上反應(yīng)了肝纖維化嚴(yán)重程度。抑制肝星狀細(xì)胞的增殖,減少Collagen I的產(chǎn)生可以減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化[5]。

      CTGF在機(jī)體創(chuàng)傷修復(fù)及器官纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展中起到中心調(diào)節(jié)作用,是器官纖維化疾病緩慢進(jìn)展的重要細(xì)胞因子,被認(rèn)為是纖維化疾病的“總開關(guān)”。肝星狀細(xì)胞的激活及表型改變被認(rèn)為是肝纖維化進(jìn)展中細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源,CTGF信使RNA水平顯著增加,CTGF可能是刺激肝星狀細(xì)胞活化增殖的關(guān)鍵因子之一。

      本研究通過Masson和網(wǎng)狀纖維染色印證了肝纖維化的存在,吸入TCE可致小鼠肝纖維化,且隨著時(shí)間延長(zhǎng)、劑量增加纖維化程度越重。TCE所導(dǎo)致肝纖維化時(shí)肝組織α-SMA、Collagen I表達(dá)明顯增強(qiáng),CTGF信號(hào)傳導(dǎo)通路功能明顯增強(qiáng),對(duì)肝纖維化發(fā)生發(fā)展起到了正反饋效果。作為慢性疾病的早期階段,早期纖維化階段被普遍認(rèn)為具有可逆性,并非不可逆的“疤痕組織”。因此,阻斷早期肝纖維化進(jìn)程可以成為治療慢性肝疾病新的切入點(diǎn),使慢性肝病在早期階段就有治愈的可能性。研究發(fā)現(xiàn),通過抑制CTGF表達(dá)能阻斷TGF-β1/Smads通路,進(jìn)而阻斷肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。目前肝纖維化治療中已經(jīng)有CTGF靶向疫苗能夠抑制小鼠肝纖維化發(fā)展,未來(lái)CTGF可能成為抗肝纖維化治療的重要靶點(diǎn)。由于本次實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間較短,小鼠數(shù)量較少,可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果有些許偏差,接下來(lái)會(huì)對(duì)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化進(jìn)而深入研究為臨床診治工作提供更精準(zhǔn)的依據(jù)。

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