基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究補(bǔ)骨脂誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體損傷機(jī)制

王 姍，肖 瑩，張 弋，肖星雨，于英莉，3，4

（1.天津市第一中心醫(yī)院藥學(xué)部南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300192；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617；3.組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；4.天津中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

補(bǔ)骨脂來(lái)源于豆科類植物補(bǔ)骨脂（PsoraleacorylifoliaL.）的干燥成熟果實(shí)，其性味辛苦溫，歸腎、脾經(jīng)，具溫腎助陽(yáng)、納氣平喘、溫脾止瀉之功效。補(bǔ)骨脂是臨床常用中藥，中成藥復(fù)方二神丸、四神丸、加味青娥丸等均以補(bǔ)骨脂入藥。臨床數(shù)據(jù)表明長(zhǎng)期大量服用補(bǔ)骨脂會(huì)產(chǎn)生肝毒性。據(jù)報(bào)道，有患者在服用含有補(bǔ)骨脂的白蝕丸后出現(xiàn)全身色素脫失斑，血清ALT（alanine transaminase，谷丙轉(zhuǎn)氨酶）、AST（aspartate aminotransferase，谷草轉(zhuǎn)氨酶）水平升高。ALT、AST水平是肝損傷的重要生化指標(biāo)，表明白蝕丸可以導(dǎo)致肝毒性［1-2］。吳豪等［3］利用斑馬魚動(dòng)物模型研究補(bǔ)骨脂水提物和醇提物所致肝毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種補(bǔ)骨脂提取物處理斑馬魚成魚后，動(dòng)物肝臟均發(fā)生了脂變，斑馬成魚肝臟中固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（FAS）和乙酰輔酶A羧化酶（ACC1）的mRNA表達(dá)水平顯著升高，而微粒體三酰甘油轉(zhuǎn)移蛋白（MTP）mRNA表達(dá)水平顯著降低。SREBP-1c是激活肝臟脂肪合成酶的重要轉(zhuǎn)錄因子，ACC1和FAS是肝臟脂質(zhì)合成的重要酶，補(bǔ)骨脂誘導(dǎo)上述蛋白上調(diào)可以促進(jìn)肝臟脂變。另外，使用尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT1A1）的特異性熒光探針N-（3-羧基丙基）-4-羥基-1，8萘酰亞胺（NCHN）研究補(bǔ)骨脂提取物及其成分對(duì)UGT1A1活性的影響，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂的醇提取物對(duì)UGT1A1活性具有較強(qiáng)的抑制作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。UGT1A1是消除膽紅素的關(guān)鍵酶，補(bǔ)骨脂通過(guò)抑制UGT1A1的活性使膽紅素的濃度升高，進(jìn)一步導(dǎo)致高膽紅素血癥和急性肝損傷［4］。這些臨床數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，補(bǔ)骨脂可以導(dǎo)致人或動(dòng)物發(fā)生肝損傷，但補(bǔ)骨脂誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究補(bǔ)骨脂導(dǎo)致肝損傷的機(jī)制，為補(bǔ)骨脂臨床用藥安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的獲取

補(bǔ)骨脂的活性成分從中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）獲取?；钚猿煞值幕瘜W(xué)物質(zhì)登錄號(hào)（CAS號(hào)）從化源網(wǎng)（https：//www.chemsrc.com/）獲取。藥物動(dòng)力學(xué)（absorption，distribution，me-tabolism and elimination，ADME）篩選標(biāo)準(zhǔn)為：口服生物學(xué)吸收性（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-like，DL）≥0.14。利 用Drug Bank數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//www.drugbank.ca/）查找線粒體損傷疾病（MD）的相關(guān)靶點(diǎn)和活性化學(xué)成分的靶點(diǎn)，利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行靶點(diǎn)的KEGG通路和GO功能分析。

1.2 分析補(bǔ)骨脂預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與線粒體損傷疾病靶點(diǎn)相互作用

利用String網(wǎng)站建立補(bǔ)骨脂活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行GO富集及KEGG通路分析。采用韋恩分析補(bǔ)骨脂活性成分，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)、線粒體疾病靶點(diǎn)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)骨脂有效物質(zhì)及作用靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用ADME篩選條件從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂所含有的117個(gè)化合物中沒(méi)有符合條件的物質(zhì)。但是，通過(guò)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)其中的9種物質(zhì)具有藥理作用，因OB值與DL值小于篩選條件而被系統(tǒng)刪除，考慮其潛在意義，故將這9個(gè)化合物納入研究范圍。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 補(bǔ)骨脂中9個(gè)有效活性化合物

同時(shí)，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取9個(gè)活性成分可能的藥理活性靶點(diǎn)共58個(gè)，包括細(xì)胞色素P4501A1（CYP1A1）、雄激素受體（AR）、鈣調(diào)蛋白（CALM1）、細(xì)胞色素P450 19A1（CYP19A1）、一氧化氮合酶（NOS）、葡萄糖激酶（GCK）、醛脫氫酶（ALDH2）、胺氧化酶（MAOA）等。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的分子靶點(diǎn)

將所獲得的有效活性化合物的58個(gè)預(yù)測(cè)蛋白靶點(diǎn)利用String網(wǎng)站建立補(bǔ)骨脂活性成分基因靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）?？梢钥吹轿挥趫D中央的FOXO3、AKT1、TP53、HMOX1、STAT3、MAPK3、JUN、BCL2L、MAPK9、AR等基因是補(bǔ)骨脂有效成分的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.2 補(bǔ)骨脂預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的生物學(xué)分析與信號(hào)通路分析

圖1 補(bǔ)骨脂活性成分基因靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果見(jiàn)表3～6，包括生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellu-larcomponent，CC）、分子功能（molecular function，MF）以及KEGG通路分析。如表3所示，這些靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)（cellular response to hypoxia）、氧化還原過(guò)程（oxidation-reduction process）、對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)（response to cytokine）、線粒體膜通透性的調(diào)控（regulationofmitochondrialmembranepermeability）、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路（lipopolysaccharidemediated signaling pathway）、RNA聚合酶II啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)作用（positiveregulation of transcription from RNApolymerase IIpromoter）和線粒體細(xì)胞色素C的釋放（releaseof cytochromec frommitochondria）等生物過(guò)程。

表3 補(bǔ)骨脂預(yù)測(cè)靶點(diǎn)GO生物過(guò)程富集分析

如表4所示，這些靶點(diǎn)組成胞漿（cytosol）、線粒體（mitochondrion）、線粒體基質(zhì)（mitochondrial matrix）、核染色質(zhì)（nuclear chromatin）、線粒體外膜（mitochondrial outer membrane）等細(xì)胞成分。

表4 補(bǔ)骨脂預(yù)測(cè)靶點(diǎn)GO細(xì)胞組分富集分析

如表5所示，這些靶點(diǎn)發(fā)揮了血紅結(jié)合（heme binding）、MAP激酶活性（MAP kinase activity）、ATP結(jié)合（ATP binding）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）、RNA聚合酶Ⅱ核心啟動(dòng)子近端序列特異性結(jié)合（transcriptional activator activity，RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific binding）等分子功能。

表5 補(bǔ)骨脂預(yù)測(cè)靶點(diǎn)GO分子功能富集分析

如表6所示，關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG富集分析中，排名靠前的信號(hào)通路主要涉及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路（neurotrophinsignalingpathway）、癌癥途徑（pathways in cancer）、結(jié)直腸癌（colorectal cancer）、催乳素信號(hào)通路（hepatitis B）、百日咳通路（pertussis）、前列腺癌通路（prostate cancer）、胰腺癌相關(guān)信號(hào)通路（pancreatic cancer）。這提示補(bǔ)骨脂主要通過(guò)癌癥信號(hào)傳導(dǎo)途徑及激素調(diào)節(jié)信號(hào)通路發(fā)揮作用，這些通路與細(xì)胞的存活密切相關(guān)。

表6 補(bǔ)骨脂成分潛在致線粒體損傷靶點(diǎn)的KEGG代謝通路富集分析

2.3 韋恩分析補(bǔ)骨脂預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與線粒體損傷疾病靶點(diǎn)的相關(guān)性

將補(bǔ)骨脂活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與致線粒體損傷疾?。∕D）靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩分析。如圖2及表7所示，2個(gè)數(shù)據(jù)交集共有19個(gè)基因靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)主要影響細(xì)胞氧化還原、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)、調(diào)控線粒體膜的通透性、細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C的釋放等。這提示補(bǔ)骨脂活性成分的分子靶點(diǎn)中有19個(gè)與線粒體密切相關(guān)，因此補(bǔ)骨脂有損傷線粒體的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

表7 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與線粒體疾病靶點(diǎn)的重合部分

圖2 補(bǔ)骨脂預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與線粒體損傷疾病靶點(diǎn)相關(guān)性分析

2.4 補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)HepaRG、HepG2肝細(xì)胞損傷

為了驗(yàn)證本研究中篩選的補(bǔ)骨脂活性成分的肝毒性，我們挑選了其中2個(gè)最具代表性的成分進(jìn)行檢測(cè)。在本研究中HepaRG人肝癌細(xì)胞具有人原代肝細(xì)胞的大多數(shù)功能，對(duì)細(xì)胞色素酶（CYP酶）活性的影響與人的原代肝細(xì)胞表現(xiàn)基本相同，毒性研究的結(jié)果與人原代肝細(xì)胞也基本一致［5］，并且還可以在體外大量傳代，是體外研究化合物和藥物代謝的重要基礎(chǔ)，是替代人原代肝細(xì)胞較好的候選對(duì)象。最新研究表明HepaRG細(xì)胞系在藥物誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激、線粒體損傷以及脂代謝紊亂中具有更強(qiáng)的特異性，與HepG2、L-02、hiHeps細(xì)胞系相比HepaRG細(xì)胞在肝毒性藥物的篩選方面更有優(yōu)勢(shì)［6］。而在以往的肝毒性實(shí)驗(yàn)中HepG2的使用率更高，更為經(jīng)典［7］，因此我們利用HepaRG、HepG2細(xì)胞對(duì)補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的肝毒性成分進(jìn)行鑒定。結(jié)果見(jiàn)圖3、表8。補(bǔ)骨脂素在HepG2肝 細(xì) 胞 的IC50為110.7μmol/L，在HepaRG肝細(xì)胞的IC50為336.6μmol/L，兩者的肝毒性具有顯著差異；異補(bǔ)骨脂素在HepG2肝細(xì)胞的IC50為1.4345μmol/L，在HepaRG肝細(xì)胞的IC50為75.17μmol/L，兩者的肝毒性具有顯著差異。

圖3 作用于HepaRG、HepG2細(xì)胞的24 h毒性曲線圖

表8 補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素肝毒性線性方程及IC50值

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查找補(bǔ)骨脂的主要成分并預(yù)測(cè)潛在的靶點(diǎn)，構(gòu)建潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。利用數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)檢索共預(yù)測(cè)到了9個(gè)主要成分以及58個(gè)分子靶點(diǎn)，并通過(guò)GO生物學(xué)過(guò)程富集分析以及KEGG代謝通路富集分析其可能的生物學(xué)過(guò)程和生理功能，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂能夠?qū)е戮€粒體損傷而破壞細(xì)胞功能。同時(shí)，我們利用HepaRG、HepG2肝細(xì)胞系對(duì)補(bǔ)骨脂素及異補(bǔ)骨脂素的肝毒性作用進(jìn)行了初步研究，證明其具有明顯的肝毒性。

4 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門基于經(jīng)典藥理學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、生物信息學(xué)等多學(xué)科技術(shù)交叉、融合而發(fā)展起來(lái)的新興學(xué)科，是從分子、細(xì)胞再到組織、器官等多種水平來(lái)研究藥物與人體之間相互作用及其規(guī)律和本質(zhì)的一種研究方法。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論計(jì)算相結(jié)合，快速篩選有效的藥物分子及靶點(diǎn)，預(yù)測(cè)藥物可能存在的毒理作用及其機(jī)制，從而達(dá)到通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)來(lái)提高藥效、降低不良反應(yīng)和治療疾病的目的［8］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法找到補(bǔ)骨脂損傷線粒體的靶點(diǎn)及通路，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。

通過(guò)中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)得到補(bǔ)骨脂的主要活性成分，并將這些有效物質(zhì)對(duì)應(yīng)的潛在基因靶點(diǎn)輸入到String網(wǎng)站中建立補(bǔ)骨脂活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）。由網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖我們發(fā)現(xiàn)，關(guān)系圖中央的幾個(gè)潛在基因相互作用更緊密。AKT1、HMOX1、BCL2L、AR、MAPK3、MAPK9等主要參與細(xì)胞的增殖與分化，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行GO富集及KEGG通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些靶點(diǎn)參與的生物學(xué)過(guò)程都與線粒體密切相關(guān)，而肝臟的功能依賴于線粒體的代謝穩(wěn)態(tài)［9］。隨后我們將補(bǔ)骨脂活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與致線粒體損傷疾病靶點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在這58個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)中有19個(gè)基因與線粒體損傷有關(guān)，這些靶點(diǎn)主要影響細(xì)胞氧化還原、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)、調(diào)控線粒體膜的通透性、細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C的釋放等。

線粒體損傷是藥物性肝損傷的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，線粒體能夠影響整個(gè)肝細(xì)胞的正常功能。藥物可以通過(guò)氧化應(yīng)激、鈣離子紊亂、減少生物合成、改變線粒體膜的通透性、DNA突變等方式來(lái)?yè)p傷線粒體，從而進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞［10］。除此之外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也能引起線粒體功能失調(diào)并加劇線粒體活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）的產(chǎn)生，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化應(yīng)激不僅能通過(guò)各自的應(yīng)激反應(yīng)通路使細(xì)胞發(fā)生損傷，還可以通過(guò)線粒體途徑干擾細(xì)胞的功能，并激活促凋亡等信號(hào)通路引發(fā)細(xì)胞凋亡。在補(bǔ)骨脂的分子靶點(diǎn)中，其中Bcl2-Bcl2L信號(hào)通路與線粒體凋亡密切相關(guān)。在正常情況下，機(jī)體中的CHOP蛋白含量比較低，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外各種不利因素打破細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致發(fā)生細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，CHOP蛋白就會(huì)大量表達(dá)，從而激活多條細(xì)胞凋亡通路，促使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡紊亂，從而激活Bcl-2基因，觸發(fā)細(xì)胞線粒體途徑凋亡［11］。大量文獻(xiàn)報(bào)道，線粒體途徑是細(xì)胞凋亡中較為重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。正常情況下細(xì)胞色素C存在于線粒體內(nèi)部，當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)刺激時(shí)，活化的Bcl-2蛋白家族誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，該蛋白從線粒體中釋放到細(xì)胞胞質(zhì)中，與caspase-9酶原結(jié)合，分解并活化caspase-9，激活的caspase-9活化下游的caspase-3，引起一系列caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，分解DNA導(dǎo)致凋亡反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡［12］。這說(shuō)明補(bǔ)骨脂的活性成分能夠損傷線粒體，由于線粒體自身缺少修復(fù)能力［13］，故極其容易發(fā)生突變位點(diǎn)，導(dǎo)致線粒體在功能上有嚴(yán)重的損壞。

綜上所述，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)并結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證證實(shí)，補(bǔ)骨脂的活性成分可以導(dǎo)致肝損傷，而其機(jī)制與破壞線粒體的功能密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明其中的2個(gè)主要活性成分補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素均可導(dǎo)致肝損傷，更好地驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果，為以后臨床應(yīng)用補(bǔ)骨脂及其含有補(bǔ)骨脂的中成藥應(yīng)該考慮對(duì)肝臟的影響，從而更好地監(jiān)測(cè)病人的藥物不良反應(yīng)，保證病人的用藥安全。