李敬丹 付璇 孫嘉洛 梁倩

摘要：為尋找防治草地貪夜蛾效果較好的植物資源，從20種植物中篩選出殺蟲效果較好的紫茉莉種子，評價(jià)紫茉莉種子中石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、水4種萃取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的室內(nèi)殺蟲活性。采用小葉碟添加法進(jìn)行拒食活性測定，24、48 h時(shí)紫茉莉種子石油醚萃取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的拒食中濃度（AFC50）分別為0.238、0.068 g/L;采用浸葉法進(jìn)行胃毒活性試驗(yàn)，1、3、5、7 d時(shí)紫茉莉種子石油醚萃取物的致死中濃度（LC50）分別為300.393、53.104、23.324、19.816 g/L;采用浸蟲法進(jìn)行觸殺活性試驗(yàn)，LC50分別為7.734、6.483、6.315、6.070 g/L。表明紫茉莉種子石油醚萃取物對草地貪夜蛾幼蟲具有較強(qiáng)的拒食、胃毒和觸殺活性，說明紫茉莉種子石油醚萃取物對草地貪夜蛾具有良好的殺蟲活性，有望為防治草地貪夜蛾新型天然殺蟲劑的開發(fā)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫茉莉種子;草地貪夜蛾;拒食活性;胃毒活性;觸殺活性;生物防治

中圖分類號： S482.3+9? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）08-0005-06

草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda J. E. Smith）是鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）灰翅夜蛾屬（Spodoptera）昆蟲，主要寄主為玉米，其次還有甘蔗、高粱、谷子、小麥、薏米、花生、莪術(shù)、香蕉、生姜、竹芋、水稻、馬鈴薯、油菜、辣椒等作物[1]。它具有啃食速度快、遷飛速度快、繁殖速度快和適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅了重要經(jīng)濟(jì)作物，阻礙了農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展[2]。草地貪夜蛾起源于美洲的亞熱帶和熱帶地區(qū)，于2016年傳入非洲，經(jīng)國際熱帶農(nóng)業(yè)研究所鑒定為農(nóng)業(yè)害蟲，給尼日利亞等非洲國家的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成了極大損失[3]。2019年1月從緬甸傳入我國云南江城，隨后擴(kuò)散至貴州、海南、廣西等多個(gè)省份，由于其暴發(fā)性強(qiáng)，難于防治，預(yù)測每年危害玉米、甘蔗等的面積約為 500萬hm2，給我國農(nóng)業(yè)發(fā)展帶來了巨大挑戰(zhàn)[4]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）通過對12個(gè)非洲國家評估發(fā)現(xiàn)，2018年草地貪夜蛾造成的玉米損失達(dá)1 770萬t，考慮到草地貪夜蛾對全球糧食和農(nóng)民生計(jì)的威脅，F(xiàn)AO決定開展為期3年的全球草地貪夜蛾防控行動(dòng)，旨在建立全球合作機(jī)制，以便隨時(shí)監(jiān)測草地貪夜蛾的發(fā)展動(dòng)向，遏制其向新地區(qū)入侵?jǐn)U散[5]。目前有效控制草地貪夜蛾的主要手段是化學(xué)防治，化學(xué)防治易使其產(chǎn)生抗藥性，有數(shù)據(jù)顯示在草地貪夜蛾的防治過程中美洲多地區(qū)顯示出抗藥性，草地貪夜蛾至少對29種不同殺蟲化學(xué)成分產(chǎn)生了抗性[6-7]。除此之外蘇云金芽孢桿菌（Bt）轉(zhuǎn)基因作物也常用于草地貪夜蛾的防治，但隨著Bt作物種植面積的不斷增加，草地貪夜蛾對其也產(chǎn)生了抗性，致使表達(dá)Cry1Ab、Cry1F等毒素基因的許多Bt玉米在種植3年后即失去對草地貪夜蛾的防治作用，因此亟需找到新的防治途徑來控制草地貪夜蛾的擴(kuò)散[8-9]。近年來，生物殺蟲劑成為研究熱點(diǎn)，生物殺蟲劑一般定義為從天然產(chǎn)物或自然界（包括動(dòng)物、植物、微生物和礦物質(zhì)）中提取的殺蟲劑，植物源殺蟲劑作為其中一種，具有較低的環(huán)境污染性和對哺乳動(dòng)物的低毒害風(fēng)險(xiǎn)、對非目標(biāo)生物的較高特異性和安全性、較低的耐藥性等特點(diǎn)，成為生物殺蟲劑創(chuàng)制的重要途徑和研究熱點(diǎn)[10]。

紫茉莉（Mirabilis jalapa L.）是紫茉莉科（Nyctaginaceae）紫茉莉?qū)伲∕irabilis）草本植物，原產(chǎn)于熱帶美洲[11]，果實(shí)為黑色瘦果，球形且表面具有皺紋，種子胚乳為細(xì)膩白粉質(zhì)[12]?，F(xiàn)在我國南北各地常作為觀賞花卉栽培，根、葉可供藥用，有清熱解毒、活血調(diào)經(jīng)和滋補(bǔ)的功效[13]。紫茉莉種子白粉狀胚乳有延緩肌膚衰老、祛痘的作用，花的提取物可促進(jìn)膠原蛋白合成，可用于制作化妝品[14-15]。彭躍峰等研究發(fā)現(xiàn)，紫茉莉莖的提取物對菜粉蝶幼蟲有拒食、胃毒以及毒殺活性，紫茉莉莖的三氯甲烷萃取物對菜粉蝶幼蟲殺蟲活性最強(qiáng)，且紫茉莉莖提取物有殺卵和抑制產(chǎn)卵的作用[16-17];曹曉莉研究比較了蒼耳子、艾蒿和紫茉莉3種植物葉和莖提取物的殺蚊效果，發(fā)現(xiàn)紫茉莉有較強(qiáng)的殺蚊活性[18];此外紫茉莉粗提物對二斑葉螨雌成螨和卵均有殺蟲和抑制發(fā)育活性[19];紫茉莉乙醇粗提物處理斜紋夜蛾，會(huì)削弱斜紋夜蛾的免疫活性，且紫茉莉所含的化合物可作為斜紋夜蛾的生物殺蟲劑和拒食劑[20-21]，說明紫茉莉具有殺蟲作用，但目前還未發(fā)現(xiàn)紫茉莉提取物對草地貪夜蛾殺蟲活性的報(bào)道。本試驗(yàn)前期測定了20種植物粗提物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的室內(nèi)殺蟲活性，發(fā)現(xiàn)紫茉莉種子粗提物的殺蟲活性較強(qiáng)，遂用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、水為溶劑將紫茉莉種子粗提物萃取成4個(gè)部分，并進(jìn)一步研究紫茉莉?qū)Σ莸刎澮苟甑臍⑾x活性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物樣品 供試植物樣品于2021年4月購自云南省昆明市螺螄灣中藥材市場，經(jīng)西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院植物學(xué)教研室杜凡教授鑒定為紫茉莉種子。將購買的樣品陰干粉碎，備用。

1.1.2 供試草地貪夜蛾 蟲卵由河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司提供，在溫度為（25±1） ℃、相對濕度為（75±5）%、光—暗周期為16 h—8 h的人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，孵化出來的幼蟲用玉米葉片飼養(yǎng)，篩選生長發(fā)育狀態(tài)一致且健康的3齡初期幼蟲作為試蟲。

1.2 試驗(yàn)方法與條件

1.2.1 植物提取物制備 紫茉莉種子陰干、粉碎，用95%乙醇溶液冷浸提取，減壓濃縮得到浸膏。將此粗提物懸浮在水中，依次用石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯萃取，得到石油醚萃取物、三氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物和水萃取物。

1.2.2 供試溶液配制 分別精確稱取一定量的萃取物于玻璃瓶中，用0.5%吐溫80水溶液配成不同濃度。用0.5%吐溫80水溶液作陰性對照，用除蟲菊酯和印楝素分別作陽性對照。

1.2.3 室內(nèi)毒力測定

1.2.3.1 拒食活性測定 采用小葉碟添加法[22]測定各萃取物對草地貪夜蛾的拒食活性。用圓形打孔器將新鮮的玉米葉片打成直徑為2 cm的葉碟，通過預(yù)試驗(yàn)確定萃取物的濃度梯度，將葉碟在不同濃度的溶液中浸漬5 s后取出，置于濾紙上自然晾干，再放入帶蓋塑料盒中，每盒放入 2片葉碟，將經(jīng)過饑餓處理 4 h 的試蟲放入盒中飼養(yǎng)，每盒1頭。以0.5%吐溫80水溶液作陰性對照，印楝素作陽性對照。每種萃取物每個(gè)濃度處理幼蟲10頭，重復(fù)5次。24、48 h時(shí)分別用1 mm×1 mm的方格紙測量幼蟲的取食面積并記錄，根據(jù)公式（1）計(jì)算拒食率，通過拒食率計(jì)算拒食中濃度（AFC50）。

拒食率=（CK-T）/CK×100%。（1）

式中：T為處理組葉片消耗量;CK為對照組葉片消耗量。

1.2.3.2 胃毒活性測定 采用浸葉法[23]測定各萃取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的胃毒活性。通過預(yù)試驗(yàn)確定各萃取物的濃度梯度，每個(gè)萃取物分別設(shè)置5個(gè)濃度梯度進(jìn)行胃毒活性試驗(yàn)。將玉米葉片剪成5 cm左右的葉段，選取1～2片分別在各個(gè)濃度萃取物溶液中浸漬5 s，自然晾干后置于塑料盒中。選取發(fā)育一致且饑餓處理4 h后的草地貪夜蛾3齡幼蟲放入盒中，放入人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以0.5%吐溫80水溶液作陰性對照，除蟲菊酯做陽性對照。每種萃取物每個(gè)濃度處理幼蟲10頭，5次重復(fù)。處理1、3、5、7 d時(shí)檢查幼蟲存活狀態(tài)，用毛筆輕觸幼蟲體表，若蟲體僵直無反應(yīng)則判定為死亡，記錄死亡數(shù)、存活數(shù)，并根據(jù)公式（2）、公式（3）計(jì)算死亡率及校正死亡率。

死亡率=死亡蟲數(shù)/處理總蟲數(shù)×100%;（2）

校正死亡率=（處理組死亡率-對照死亡率）/（1-對照組死亡率）×100%。（3）

1.2.3.3 觸殺活性測定 采用浸蟲法[24]測定各萃取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的殺蟲活性。通過預(yù)試驗(yàn)確定萃取物的濃度梯度，選取發(fā)育一致且饑餓處理4 h后的3齡幼蟲浸漬在不同濃度的溶液中5 s后放入盒中飼養(yǎng)。以0.5%吐溫80水溶液作陰性對照，除蟲菊酯作陽性對照。每種提取物每個(gè)濃度處理幼蟲10頭，重復(fù)5次。處理1、3、5、7 d時(shí)檢查幼蟲存活狀態(tài)，并根據(jù)公式（2）、公式（3）計(jì)算死亡率及校正死亡率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)算紫茉莉種子石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和水萃取物的拒食中濃度（AFC50）、半數(shù)致死濃度（LC50）、LC50值與AFC50值的95%置信區(qū)間及卡方等參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫茉莉種子萃取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的拒食活性

紫茉莉種子4部分萃取物及陽性對照印楝素對草地貪夜蛾3齡幼蟲24、48 h的拒食活性見表1。從表1可以看出，24、48 h時(shí)，紫茉莉種子石油醚萃取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的拒食活性較強(qiáng)，AFC50分別為0.238、0.068 g/L，明顯好于三氯甲烷相、乙酸乙酯相和水相的拒食活性。

2.2 紫茉莉種子萃取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的胃毒作用

紫茉莉種子石油醚相、三氯甲烷相和乙酸乙酯相萃取物在100 g/L（預(yù)試驗(yàn)所得濃度）濃度下對草地貪夜蛾3齡幼蟲進(jìn)行胃毒處理，校正死亡率見表2。從表2可以看出，濃度為100 g/L時(shí)，1 d時(shí)石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和水萃取物對草地貪夜蛾的校正死亡率均小于50%，紫茉莉種子石油醚萃取物的校正死亡率最高，為46.00%。3 d時(shí)，石油醚萃取物對草地貪夜蛾的校正死亡率大于50%，三氯甲烷相、乙酸乙酯相、水相的校正死亡率均小于50%，石油醚萃取物對草地貪夜蛾的校正死亡率最高，為74.00%。5 d時(shí)，石油醚萃取物和三氯甲烷萃取物的校正死亡率大于50%，分別為82.00%、6.89%，其余均小于50%。7 d時(shí)，石油醚萃取物和三氯甲烷萃取物對草地貪夜蛾的校正死亡率分別為86.00%、60.89%，其余均小于50%。

將胃毒試驗(yàn)校正死亡率大于50%的石油醚和三氯甲烷萃取物設(shè)置5個(gè)濃度梯度，采用浸葉法進(jìn)行胃毒試驗(yàn)，數(shù)據(jù)見表3。由表3可知， 1、3、5、7 d時(shí)，茉莉種子石油醚萃取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的LC50分別為300.393、53.104、23.324、19.816 g/L。7 d時(shí)，紫茉莉種子石油醚萃取物對草地貪夜蛾的殺蟲活性達(dá)到最高。1、3、5、7 d時(shí)，紫茉莉種子三氯甲烷萃取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的LC50分別為867.339、133.082、94.019、88.959 g/L，比較2種萃取物的LC50可知，紫茉莉種子石油醚萃取物的胃毒活性要明顯好于三氯甲烷相。

2.3 紫茉莉種子各萃取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的觸殺作用

紫茉莉種子石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相和水相在100 g/L的濃度下對草地貪夜蛾3齡幼蟲進(jìn)行觸殺試驗(yàn)，校正死亡率見表4。從表4可以看出，濃度為100 g/L時(shí)，1 d時(shí)石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取物對草地貪夜蛾的校正死亡率均大于50%，紫茉莉種子石油醚萃取物的校正死亡率最高，為92.00%。3 d時(shí)，石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相的校正死亡率均大于50%，石油醚萃取物對草地貪夜蛾的校正死亡率最高，為96.00%。5 d時(shí)，石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相的校正死亡率大于50%，分別為96.00%、64.00%、80.00%。7 d 時(shí)，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取物的校正死亡率和5 d時(shí)相同，水相的校正死亡率小于50%。將校正死亡率大于50%的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取物設(shè)置5個(gè)濃度梯度，采用浸蟲法進(jìn)行觸殺試驗(yàn)，結(jié)果見表5。

由表5可知，1、3、5、7 d時(shí)，紫茉莉種子石油醚萃取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的LC50分別為7.734、6.483、6.315、6.070 g/L。7 d時(shí)，紫茉莉種子石油醚萃取物對草地貪夜蛾的觸殺作用達(dá)到最強(qiáng);1、3、5、7 d時(shí)，紫茉莉種子三氯甲烷萃取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的LC50分別為92.614、91.061、91.061、88.782 g/L，乙酸乙酯萃取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的LC50分別為54.674、49.821、49.821、49.821 g/L，三者對比可知紫茉莉種子石油醚萃取物的殺蟲效果明顯優(yōu)于三氯甲烷萃取物和乙酸乙酯萃取物。

3 結(jié)論與討論

有研究表明，在沒有人為干預(yù)的條件下，非洲12個(gè)國家每年會(huì)因草地貪夜蛾造成830萬～2 060萬t的玉米損失，相當(dāng)于這12個(gè)國家3年平均玉米產(chǎn)量的21%～53%[25]。由于玉米是撒哈拉以南非洲地區(qū)人民的主要糧食作物，草地貪夜蛾對非洲人的生活和糧食安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。不僅如此，有研究發(fā)現(xiàn)在不防治的情況下，草地貪夜蛾對我國玉米的潛在經(jīng)濟(jì)損失平均值為1 432.26億元[26]。許多農(nóng)民嘗試使用化學(xué)合成農(nóng)藥來應(yīng)對草地貪夜蛾，但考慮到化學(xué)農(nóng)藥的安全性或草地貪夜蛾對其產(chǎn)生的抗性。因此，結(jié)構(gòu)復(fù)雜、靶標(biāo)多樣、機(jī)制獨(dú)特的植物源殺蟲劑的研究迫在眉睫[27]。

紫茉莉含有葫蘆巴堿、多肽、黃酮、萜類、香豆素等多種化學(xué)成分[28-30]，且具有一定的殺蟲作用。為了尋找對草地貪夜蛾具有顯著殺蟲活性的植物源殺蟲劑，本研究將殺蟲效果較好的紫茉莉種子粗提物分為石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相和水相4個(gè)部分，進(jìn)一步研究紫茉莉種子萃取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的殺蟲活性。研究結(jié)果表明，紫茉莉種子石油醚萃取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲有很強(qiáng)的拒食活性，24 h時(shí)AFC50為0.238 g/L，48 h時(shí)AFC50為 0.068 g/L，48 h的AFC50小于24 h的AFC50，其原因可能是由于試蟲在取食了少量的紫茉莉種子石油醚萃取物后，引起食欲減退所致。由此表明萃取物中可能存在某種化合物抑制了消化酶，使試蟲食欲降低或消化速度減緩，但還需通過進(jìn)一步試驗(yàn)來確定。紫茉莉種子石油醚萃取物對草地貪夜蛾的胃毒活性也較強(qiáng)，1、3、5、7 d時(shí)的LC50分別為300.393、53.104、23.324、19.816 g/L;觸殺活性測定中，1、3、5、7 d時(shí)的LC50分別為7.734、6.483、6.315、6.070 g/L。試蟲的死亡率隨著萃取物濃度的增加而上升，且觸殺試驗(yàn)的LC50小于胃毒試驗(yàn)的LC50，原因可能是萃取物中的有效成分主要作用于草地貪夜蛾幼蟲體表組織;胃毒試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，草地貪夜蛾取食萃取物浸漬的葉子7 d后，再喂以新鮮未處理的葉子，整個(gè)生長過程中草地貪夜蛾均有不同程度的生長抑制作用，如體型減小、生命周期延長、蛹的質(zhì)量減小，死亡率比對照明顯增加等。其原因可能是試蟲取食萃取物后引起體內(nèi)代謝紊亂而使生長發(fā)育受到抑制的結(jié)果。

Lima等報(bào)道了毛脈樹胡椒（Piper hispidum）葉子揮發(fā)油48、96 h時(shí)對草地貪夜蛾的胃毒活性，LC50分別為18.0、9.4 g/L[31];Flores等測定了蓖麻葉（Ricinus communis L.）甲醇提取物對草地夜蛾幼蟲的胃毒活性，LC50為13 469.12 g/L[32];樹胡椒（P. aduncum）的正己烷萃取物對草地貪夜蛾的胃毒活性的LC50 為8.22 g/L[33]。本研究胃毒試驗(yàn)的殺蟲效果明顯好于蓖麻葉。苦楝皮中的化學(xué)成分7-keto-gedunin對草地貪夜蛾的AFC50為0.80 g/L;四環(huán)三萜類化合物evodulone和7-deacyl-priceranone對草地貪夜蛾的AFC50分別為0.32、0.35 g/L[34]。本研究中24 h時(shí)紫茉莉種子石油醚萃取物對草地貪夜蛾的AFC50均優(yōu)于以上報(bào)道。通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）檢測得到紫茉莉石油醚萃取物的主要成分為油酸乙酯，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)樟樹石油醚相分離出的油酸乙酯對朱砂葉螨有很好的殺蟲活性[35]，因此紫茉莉種子石油醚相中可能是油酸乙酯在發(fā)揮殺蟲作用?？梢姡宪岳蚓哂虚_發(fā)為新型高效、靶點(diǎn)多樣的植物源農(nóng)藥的潛在價(jià)值。

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