王柄權(quán) 程凌寒 方宇 李維薇 劉佳妮

摘要：為探究草地貪夜蛾對毒害物質(zhì)的反防御策略。以添加0.5%煙堿、0.05%黃酮、0.5%棉酚、0.01%水楊酸、0.1%香豆素5種植物次生代謝物質(zhì)的人工飼料進行飼養(yǎng)草地貪夜蛾5齡幼蟲，48 h后分別測定草地貪夜蛾中腸和脂肪體的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等4種酶的活性，同時采用半定量RT-PCR方法檢測CYP4L13、CYP4M14基因在中腸和脂肪體中的表達水平。其中取食煙堿、黃酮、棉酚、香豆素和水楊酸均能誘導(dǎo)中腸GSTs活性增強，棉酚、香豆素和水楊酸在脂肪體中可顯著誘導(dǎo)GSTs的活性增強6倍以上。取食棉酚可誘導(dǎo)草地貪夜蛾中腸CarE活性增強1.57倍，而取食煙堿可誘導(dǎo)脂肪體CarE的活性顯著增加。與對照相比，取食煙堿、黃酮、棉酚、香豆素后，草地貪夜蛾頭部AchE活性分別提高1.34、0.50、0.82、0.68倍。草地貪夜蛾中腸和脂肪體中CYPM14、CYPL13可被不同植物次生代謝物質(zhì)誘導(dǎo)表達增強，同時增加P450含量。與對照相比，取食黃酮、棉酚、水楊酸后，其中腸P450的含量分別增加3.14、2.43、3.93倍。草地貪夜蛾的解毒能力可通過植物次生代謝物質(zhì)誘導(dǎo)增強，從而提高其對有毒物質(zhì)的抵抗力。

關(guān)鍵詞：植物次生代謝物;草地貪夜蛾;解毒酶;細(xì)胞色素P450

中圖分類號：S433.4 ??文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）08-0011-04

對于絕大多數(shù)植食性昆蟲而言，植物次生代謝物質(zhì)對其生長、發(fā)育和繁殖產(chǎn)生重要影響，并在化學(xué)防御中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)知的很多植物次生代謝物都對昆蟲具有防御作用[1]。植物次生代謝物質(zhì)抗蟲效果不僅取決于它們對脆弱昆蟲系統(tǒng)的效力，還取決于昆蟲對這種挑戰(zhàn)的反應(yīng)[2]。植物和昆蟲在長期的生物演化過程中，為戰(zhàn)勝寄主植物的毒害，植食性昆蟲發(fā)展了忌避取食、解毒代謝等多種適應(yīng)次生代謝物質(zhì)的途徑，其中解毒代謝中的相關(guān)解毒酶系扮演著重要的角色[3]。多種解毒酶的相互作用不僅能影響昆蟲取食，在一定程度上還能使昆蟲對殺蟲劑產(chǎn)生耐藥性和抗藥性的能力增強[4]。有研究表明，通過誘導(dǎo)可顯著增加解毒酶活性，但針對同種誘導(dǎo)，不同昆蟲所作出的應(yīng)激響應(yīng)存在顯著差異。細(xì)胞色素P450是一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白超家族，普遍存在于昆蟲體內(nèi)，兼具氧化和單氧化相關(guān)功能，能參與部分昆蟲保幼激素、蛻皮激素以及植物次生代謝有毒物質(zhì)的代謝過程，在內(nèi)源性和外源性代謝中發(fā)揮重要作用[5]。大多數(shù)昆蟲對寄主植物的適應(yīng)性主要由細(xì)胞色素P450家族基因的代謝解毒作用水平?jīng)Q定[6]。草地貪夜蛾[Spodoptera frugiperda（J.E. Smith）]屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）灰翅夜蛾屬（Spodoptera），原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，是一種遷飛能力極強的世界性害蟲。2019年1月在我國云南省首次發(fā)現(xiàn)，至今已在25個?。ㄊ?、區(qū)）造成危害，該蟲主要危害玉米、小麥、花生、高粱、棉花和蔬菜等作物[7]。目前，主要依靠化學(xué)方法控制草地貪夜蛾，但長期大量使用化學(xué)藥劑，不但害蟲會在短時間內(nèi)產(chǎn)生抗藥性，而且造成環(huán)境污染。本試驗選擇煙堿、黃酮、棉酚、水楊酸和香豆素5種常見的植物次生代謝產(chǎn)物研究草地貪夜蛾的解毒酶活性和相關(guān)基因表達，探明草地貪夜蛾適應(yīng)次生代謝物的生理生化機制，探索廣食性害蟲的耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

草地貪夜蛾幼蟲采集于2020年4月昆明學(xué)院安寧象石村實習(xí)基地農(nóng)場，在實驗室室內(nèi)飼養(yǎng)，溫度為（26 ±2） ℃，濕度為60%～80%，光—暗周期為 14 h—10 h。剛孵化的草地貪夜蛾幼蟲放入裝有人工飼料的飼養(yǎng)箱（30 cm×18 cm×5 cm）中[8]，每天添加新鮮飼料并觀察記錄[8]，清理糞便。挑選大小一致的5齡幼蟲分別用含有0.5%煙堿、0.05%黃酮、0.5%棉酚、0.01%水楊酸、0.1%香豆素的人工飼料進行飼養(yǎng)，對照為正常取食人工飼料的草地貪夜蛾。飼喂48 h后，分別提取貪夜蛾中腸和脂肪體，每個處理20頭蟲，重復(fù)3次，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 酶源提取 將5齡幼蟲置于冰上，沿背中線剖開蟲體，輕輕用鑷子取出中腸，加入預(yù)冷的 0.04 mol/L 的磷酸緩沖液中沖洗，并置于離心管中，5頭幼蟲合并1個檢測樣，-80 ℃保存?zhèn)溆茫貜?fù)3次。加入1 000 μL 0.1 mol/L緩沖液（pH值7.6）勻漿，全部溶液合并后于4 ℃下10 000 g離心 20 min，保留上清液待測。

1.2.2 各種酶活性測定 酶活性的測定采用以下方法：谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活力測定參照文獻[9]的方法;羧酸酯酶（CarE）活力測定參照文獻[10]的方法;乙酰膽堿酯酶的活力參考Ellman的方法[11]進行改良測定;細(xì)胞色素P450含量的測定參照文獻[12]的方法。

1.2.3 引物設(shè)計 PCR擴增引物根據(jù)GenBank中草地貪夜蛾的CYP4L13（FP340412.1）和CYP4M14（FP340419.1）序列設(shè)計[13]，以EF-1a（Elongation factor-1a）（U20129）為內(nèi)標(biāo)基因，引物分別為：CYP4L13 F（5′-ACGAACGTGAGTCTGCCTATGTGA-3′）、CYP4L13 R（5′-ACGSCGTCCGGACCAAAAATC-3′）、CYP4M14 F（5′-TGATCYCGGACTTGCACTTG-3′）、CYP4M14 R（5′-GTCCAGCGCTGAAAGGAATA-3′）、EF-1a F（5 ′-GACAAACGTACCATCGAGAAG-3′）。

1.2.4 總RNA提取 采用TRIzol Reagent（Invitrogen，USA）的方法進行總RNA的提取。將剛解剖的草地貪夜蛾中腸和脂肪體置于裝有預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH值7.8）中充分研磨，利用Nanodrop ND-1000檢測總RNA濃度和純度。

1.2.5 半定量RT-PCR檢測 依據(jù)iScript cDNA Synthesis kit（Bio-Rad，USA）方法進行cDNA合成。半定量RT-PCR采用25 μL反應(yīng)體系：10×Buffer 2.5 μL;cDNA模板1.0 μL;2.5 mmol dNTP 2.0 μL;ddH2O 18.3 μL;r Taq聚合酶0.2 μL;上下游引物各0.5 μL。反應(yīng)條件為 94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)。電泳后凝膠成像系統(tǒng)檢測目的基因表達量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物次生代謝物質(zhì)對草地貪夜蛾幼蟲乙酰膽堿酯酶活性的影響

研究發(fā)現(xiàn)，人工飼喂含有0.5%煙堿、0.05%黃酮、0.5%棉酚、0.1%香豆素的人工飼料48 h后，幼蟲頭部AChE活性較對照分別提高1.34、0.50、0.82、0.68倍（F=18.146，P<0.001）。而飼喂0.01%水楊酸人工飼料48 h后幼蟲頭部AChE活性有所降低。表明通過飼喂煙堿、黃酮、棉酚、香豆素能夠顯著誘導(dǎo)增強草地貪夜蛾頭部AChE活性（表1）。

2.2 植物次生代謝物質(zhì)對草地貪夜蛾GSTs活性的影響

與對照相比，5齡幼蟲飼喂含有0.5%煙堿、0.05%黃酮、0.5%棉酚、0.1%香豆素、0.01%水楊酸的人工飼料48 h后，其中腸中的GSTs活性分別增加1.69、0.97、0.41、1.41、2.05倍（F=19.217，P<0.001）。而在脂肪體中，所有的植物次生物質(zhì)都可顯著誘導(dǎo)增強GSTs的活性，其中棉酚、香豆素和水楊酸GSTs活性與對照相比顯著增強6倍以上（F=33.147，P<0.001）（表2）。表明人工飼喂煙堿、黃酮、棉酚、香豆素、水楊酸均能在一定程度上誘導(dǎo)增強草地貪夜蛾中腸和脂肪體中的GSTs活性。

2.3 植物次生代謝物質(zhì)對草地貪夜蛾CarE活性的影響

草地貪夜蛾5齡幼蟲取食含有0.5%棉酚的人工飼料48 h后，其中腸中CarE活性顯著增加0.57倍（F=21.317，P<0.001），而飼喂0.1%香豆素、0.01%水楊酸的中腸CarE活性受到抑制，分別為對照的0.83、0.91倍，且與對照相比存在顯著差異。而在脂肪體中，0.01%水楊酸CarE活性受到抑制，為對照的0.68倍，其余次生代謝物質(zhì)與對照相比有所增加，其中0.5%煙堿誘導(dǎo)CarE的活性顯著增加，其余無顯著差異（表3）。綜上所述，草地貪夜蛾取食植物次生物質(zhì)后，其中腸和脂肪體中的CarE活性的變化存在一定差異，且中腸中CarE活性表現(xiàn)得更為敏感。

2.4 植物次生代謝物質(zhì)對草地貪夜蛾細(xì)胞色素P450含量的影響

與對照相比，各處理中細(xì)胞色素P450含量變化存在一定差異，其中飼喂含有0.05%黃酮、0.5%棉酚、0.01%水楊酸人工飼料48 h后的中腸P450的含量分別增加3.14、2.43、3.93倍，且飼喂黃酮和水楊酸的增加效果更為顯著;而飼喂0.5%煙堿、0.1%香豆素對其含量無顯著影響。在脂肪體中，取食含有0.5%煙堿、0.05%黃酮、0.01%水楊酸人工飼料48 h后，其P450含量與對照相比分別增加0.56、1.69、2.25倍，且存在顯著差異;而飼喂0.5%棉酚、0.1%香豆素對P450含量無顯著影響（表4）。

2.5 植物次生代謝物質(zhì)對草地貪夜蛾CYP4L13、CYP4M14表達的影響

草地貪夜蛾5齡幼蟲經(jīng)飼喂含有不同植物次生代謝物質(zhì)的人工飼料后，其體內(nèi)2部位中的CYP4L13、CYP4M14均有所表達，且不同處理間誘導(dǎo)程度呈現(xiàn)一定差異。其中取食含有0.5%煙堿、0.05%黃酮、0.5%棉酚的人工飼料48 h后，中腸CYPL13的表達量和對照無明顯差異，沒有被誘導(dǎo)表達;取食含有0.01%水楊酸、0.1%香豆素的人工飼料其中腸CYPL13的表達量明顯減少。草地貪夜蛾幼蟲在取食含有0.05%黃酮、0.5%棉酚的人工飼料48 h后，其中腸CYPM14的表達量與對照相比均明顯增加，而取食含有0.5%煙堿、0.01%水楊酸、0.1%香豆素人工飼料48 h后的CYPM14均未被誘導(dǎo)。在脂肪體中，取食含有0.05%黃酮、0.5%棉酚的人工飼料48 h后CYPL13的表達量略有增加，而其余的無明顯表達;同時在各處理中CYPM14的表達量均呈現(xiàn)不同程度的增加，且CYPL13、CYPM14表達量在中腸與脂肪體2部位中存在一定差異（圖1）。

3 討論與結(jié)論

黃敏燕等通過向斜紋夜蛾5齡幼蟲飼喂不用濃度沒食子酸、蕓香苷等植物次生代謝物質(zhì)的方法研究斜紋夜蛾的解毒機制，發(fā)現(xiàn)不同類型的植物次生代謝物質(zhì)和解毒酶活性基因的表達共同影響了斜紋夜蛾的解毒代謝[14]。Zou等發(fā)現(xiàn)，不同寄主植物對斜紋夜蛾幼蟲的取食適應(yīng)從高到低依次為甘藍、黃瓜、甘薯、花生和辣椒，其谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶SlGSTE1可能與寄主植物的攝食適應(yīng)有關(guān)[15]。10種宿主植物對草地貪夜蛾GSTs的誘導(dǎo)作用不同，歐洲防風(fēng)誘導(dǎo)能力最強，棉花誘導(dǎo)能力最弱[16]。與此同時，植物次生代謝物質(zhì)不同，作用于昆蟲體內(nèi)解毒酶系的效果也有所差異，王瑞龍等研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸、花椒毒素、香豆素能夠誘導(dǎo)增強斜紋夜蛾中腸和脂肪體中GSTs的活性[17]。本研究結(jié)果表明，0.5%煙堿、0.05%黃酮、0.5%棉酚、0.1%香豆素、0.01%水楊酸能夠有效增強中腸GSTs活性，其中棉酚、香豆素和水楊酸在脂肪體中可誘導(dǎo)GSTs活性顯著增強6倍以上。另外，0.5%棉酚可誘導(dǎo)草地貪夜蛾中腸CarE活性增加，而0.1%香豆素和0.01%水楊酸誘導(dǎo)后CarE活性受到抑制，而在脂肪體中0.5%煙堿誘導(dǎo)CarE的活性顯著增加。劉佳妮等通過對馬鈴薯塊莖蛾進行連續(xù)5代的含煙堿飼料飼喂，發(fā)現(xiàn)煙堿處理后其體內(nèi)解毒酶CarE和GST的含量呈逐漸降低的趨勢，可能是馬鈴薯塊莖蛾為了適應(yīng)煙堿而作出的響應(yīng)[18]。

細(xì)胞色素P450是昆蟲體內(nèi)的主要解毒酶系，對昆蟲的生長、發(fā)育以及抵御外界脅迫等方面發(fā)揮著重要作用[19]。目前已鑒定的細(xì)胞色素P450大多屬于CYP4等27個家族，其中CYP4家族主要參與生物合成與代謝、外源有毒物質(zhì)代謝以及響應(yīng)外部環(huán)境脅迫，同時也與適應(yīng)寄主植物和耐藥性、抗藥性的形成密切相關(guān)[20]。張繼紅等通過向飼料中添加煙堿和棉酚的方法研究次生物質(zhì)對棉鈴蟲生長以及體內(nèi)酶系的影響時發(fā)現(xiàn)2個處理對其生長無明顯影響，但其中腸P450酶系的組成以及酶活性存在一定差異[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，草地貪夜蛾僅在取食含有黃酮和棉酚人工飼料后，CYPM14在中腸的表達量增加，而取食含有煙堿、黃酮、棉酚、水楊酸和香豆素5種次生代謝物質(zhì)后，脂肪體CYPM14表達量均有增加。草地貪夜蛾中腸CYPL13表達量的變化趨勢與CYPL14一致，僅在取食含有黃酮和棉酚人工飼料后，脂肪體中CYPL13的表達量略有增加，其余的無明顯表達。在中腸中，飼喂水楊酸和香豆素人工飼料后，CYPL13表達量減少。表明不同植物次生代謝物質(zhì)能誘導(dǎo)草地貪夜蛾中腸和脂肪體中CYPM14和CYPL13的表達增強，同時增加P450含量。煙草天蛾（Manducasexta）的幼蟲可以通過增加體內(nèi)P450含量來提高對次生代謝物質(zhì)的解毒作用[22]。薛明等發(fā)現(xiàn)，甜菜夜蛾幼蟲取食轉(zhuǎn)Bt基因棉后，其體內(nèi)AchE活性較取食普通棉花相比顯著增高[23]。本研究中草地貪夜蛾取食各植物次生物質(zhì)后表現(xiàn)出其頭部AchE活性增強的結(jié)論與之一致。

植物次生代謝產(chǎn)物在昆蟲和植物的共同進化中起關(guān)鍵作用，植物次生代謝物的類型很多，闡明次生代謝物誘導(dǎo)和調(diào)控昆蟲解毒酶的機制，對于揭示植物與昆蟲之間的協(xié)同進化關(guān)系以及制定害蟲防治策略都具有重要意義。

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