陳俊宇 盧峰 陳婉瑩 何永輝 劉歡歡 印志同

摘要：生育期是玉米重要的性狀之一，其中抽穗期、散粉期和吐絲期是3個(gè)最重要的指標(biāo)。以玉米自交系LDC-1和YS501構(gòu)建的186個(gè)重組自交系為材料，在2個(gè)大田種植環(huán)境下對(duì)抽穗期、散粉期和吐絲期3個(gè)生育期相關(guān)性狀進(jìn)行QTL解析?；贛aize10k芯片數(shù)據(jù)構(gòu)建總長(zhǎng)為2 569.89 cM的高密度遺傳圖譜，共包含2 624個(gè)bin，相鄰標(biāo)記間的平均距離為0.98 cM。共檢測(cè)到32個(gè)生育期相關(guān)性狀QTLs，似然函數(shù)比值對(duì)數(shù)值（logarithm of odds，簡(jiǎn)稱LOD）為2.52～10.86，貢獻(xiàn)了3.33%～17.19%的表型變異。其中qDTT9-1、qDTS9-2在不同環(huán)境中穩(wěn)定表達(dá)且效應(yīng)較大，在育種中可能具有較大利用價(jià)值。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步精細(xì)定位生育期相關(guān)性狀QTLs和利用分子標(biāo)記輔助選擇開展品種改良提供參考。

關(guān)鍵詞：玉米;生育期;遺傳圖譜;QTL定位

中圖分類號(hào)： S513.03? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）08-0063-06

生育期是玉米重要的性狀之一，不同玉米品種生育期存在較大差異。在生產(chǎn)中，需要依據(jù)種植地區(qū)與播種時(shí)間選擇生育期適宜的玉米品種以保證產(chǎn)量的穩(wěn)定，因此通過(guò)育種手段選育適宜生育期品種就顯得尤為重要。而抽穗期、散粉期、吐絲期作為3個(gè)最重要的生育指標(biāo)，在玉米生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中占據(jù)重要地位，不僅與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變有關(guān)，還與花期協(xié)調(diào)和籽粒產(chǎn)量密切相關(guān)[1-2]。

抽穗期、散粉期、吐絲期等性狀均為典型的數(shù)量性狀，由多基因控制。目前，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)玉米生育期相關(guān)性狀進(jìn)行了較多的QTL定位分析[3-6]。公強(qiáng)等以CN165×單330（早熟種質(zhì)）構(gòu)建F2 ∶3家系對(duì)花期相關(guān)性狀進(jìn)行QTL鑒定，在3個(gè)環(huán)境檢測(cè)到26個(gè)生育期相關(guān)性狀的QTLs，可以解釋的表型變異為7.1%～26.5%，3個(gè)環(huán)境中均于第8染色體上的phi060～umc2401區(qū)間檢測(cè)到了與抽穗時(shí)間相關(guān)的QTL，其余QTL并未在3個(gè)環(huán)境重復(fù)檢測(cè)到[7]。李玉玲等利用同樣來(lái)源F2 ∶3和BC2S1群體對(duì)玉米生育期相關(guān)性狀進(jìn)行初步定位與分析，發(fā)現(xiàn)在2類群體中QTL檢測(cè)結(jié)果存在較大差異，其中F2 ∶3群體檢測(cè)出的QTL數(shù)目和貢獻(xiàn)率均高于BC2S1，同時(shí)指出遺傳背景差異對(duì)生育期主效QTL的檢測(cè)影響較大[8]。Buckler等利用1組5 000個(gè)重組自交系在8個(gè)環(huán)境條件下對(duì)植株進(jìn)行表型鑒定，檢測(cè)到控制開花期、吐絲期等性狀的位點(diǎn)均超過(guò)50個(gè)，未檢測(cè)到單一大效應(yīng)的QTL，只有7個(gè)等位基因?qū)﹂_花時(shí)間的影響超過(guò)1 d，該結(jié)果說(shuō)明開花期性狀是由多個(gè)微效基因所控制的[9]。Coles等通過(guò)溫帶玉米自交系和熱帶自交系構(gòu)建了4個(gè)群體，利用多群體聯(lián)合分析鑒定出了控制開花時(shí)間的基因組區(qū)域[10]。目前，有關(guān)生育期相關(guān)基因的克隆研究方面也取得了一定進(jìn)展，已經(jīng)克隆的基因包括第1染色體上的DWARF8（D8）和INDETERMINATE GROWTH1（ID1）、第7染色體的DELAYED FLOWERING 1（dlf1）以及位于第8染色體的VEGETATIVE TOGENERATIVE TRANSITION1（VGT1）[11-15]，這些基因通過(guò)自主調(diào)控玉米開花轉(zhuǎn)換、介導(dǎo)開花誘導(dǎo)信號(hào)的傳遞和調(diào)控營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變等途徑調(diào)節(jié)玉米生育期。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者在生育期相關(guān)基因定位和克隆方面取得了一些進(jìn)展，但是由于不同研究中群體類型、遺傳背景、群體規(guī)模、統(tǒng)計(jì)方法等因素的差異，檢測(cè)的QTL結(jié)果不盡相同，在不同環(huán)境中能穩(wěn)定檢測(cè)到的QTL仍較少。除此以外，大多數(shù)定位和克隆的基因或位點(diǎn)的利用在育種實(shí)踐中存在困難或局限，因此仍需開發(fā)新的位點(diǎn)。

本研究以玉米自交系LDC-1和YS501所衍生的重組自交系，構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜，對(duì)生育期相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位，探尋能夠在多個(gè)環(huán)境條件下均能穩(wěn)定表達(dá)的QTL，旨在為解析玉米生育期的遺傳機(jī)制、挖掘生育期有關(guān)基因及開展玉米分子育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為玉米商用雜交種天玉88的2個(gè)親本自交系LDC-1和YS501，以及該雜交種連續(xù)自交7代衍生的186個(gè)重組自交系。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料在2020、2021年2年分別種植于2個(gè)環(huán)境中：2020年夏種植在揚(yáng)州大學(xué)揚(yáng)子津校區(qū)試驗(yàn)田（E1，32.4°N、119.4°E）;2021年夏種植在鎮(zhèn)江世業(yè)洲試驗(yàn)田（E2，32.2°N、119.5°E）。田間采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，2次重復(fù)，每行10株，行長(zhǎng)2 m，行距為60 cm，株距為20 cm，田間管理同一般大田。

1.3 性狀調(diào)查

在玉米整個(gè)生長(zhǎng)階段調(diào)查玉米從播種到抽穗、散粉、吐絲的時(shí)間作為生育期相關(guān)指標(biāo)，其中抽穗期（days to tasseling，簡(jiǎn)稱DTT）記為從播種到抽出雄穗的時(shí)間，散粉期（days to pollen-shedding，簡(jiǎn)稱DTP）記為從播種到開花散粉的時(shí)間，吐絲期（days to silking，簡(jiǎn)稱DTS）記為從播種到雌穗吐絲的時(shí)間。以上數(shù)據(jù)以家系為單位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

基于SPSS23.0軟件對(duì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、相關(guān)分析和描述統(tǒng)計(jì)，利用Microsoft Excel 2016處理基因型數(shù)據(jù)。

1.5 連鎖圖譜構(gòu)建與QTL分析

由北京中玉金標(biāo)記生物技術(shù)股份有限公司對(duì)親本及其衍生的重組自交系群體進(jìn)行Mazie10K基因型檢測(cè)。使用Microsoft Excel 2016軟件按照以下步驟處理獲得的基因型數(shù)據(jù)：（1）刪除親本基因型雜合與親本間無(wú)多態(tài)性的標(biāo)記;（2）刪掉雜合率和缺失率大于20%的SNP標(biāo)記;（3）篩選出等位基因頻率大于0.05的標(biāo)記;（4）利用binmap R包對(duì)獲得的SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行糾錯(cuò)。遺傳圖譜基于R/qtl構(gòu)建，通過(guò)Kosambi函數(shù)計(jì)算標(biāo)記間距離，遺傳圖距的單位為厘摩（centimorgan，簡(jiǎn)稱cM）。

各參數(shù)的QTLs檢測(cè)采用Windows QTL Cartographer 2.5軟件完成，使用Kosambi函數(shù)轉(zhuǎn)化重組率為圖距，作圖步長(zhǎng)為1.00 cM;采用復(fù)合區(qū)間作圖法檢測(cè)QTL位點(diǎn)，通過(guò)1 000次重排獲得QTL顯著的LOD閾值（P<0.05）。同一條染色體上的同一性狀LOD相距10 cM左右;置信區(qū)間出現(xiàn)重疊的位點(diǎn)被認(rèn)為是同一QTL[16]。

本研究中QTL命名參考McCouch等的方法[17]，規(guī)則如下：生育期相關(guān)性狀的QTL以qDTT2-1為例，q表示QTL，DTT為性狀英文字母縮寫，2-1表示在2號(hào)染色體檢測(cè)到的第1個(gè)QTL。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳圖譜構(gòu)建

利用10K的SNP標(biāo)記檢測(cè)RIL群體的基因型，采用滑動(dòng)窗口法，將連續(xù)多個(gè)標(biāo)記基因型結(jié)果相同的SNP視為1個(gè)bin，排除基因型錯(cuò)誤的SNP標(biāo)記。經(jīng)過(guò)篩選后bin map共包含2 624個(gè)bin（表1、圖1），構(gòu)建bin map遺傳圖譜，全長(zhǎng)為2 569.89 cM，標(biāo)記密度為1.02 bin/cM，標(biāo)記間平均距離為0.98 cM。bin標(biāo)記在每條染色體上的分布疏密不均，且密集區(qū)域不同，其中第1染色體的遺傳距離最長(zhǎng)（417.96 cM），且標(biāo)記密度也最大，為1.14 bin/cM;第10染色體的遺傳距離最短，為158.69 cM;第3染色體的標(biāo)記密度最小，為0.89 bin/cM。依據(jù)bin在各染色體上的信息，計(jì)算bin兩兩之間的重組率（圖1-B），表明鄰近bin之間連鎖程度較高，距離較遠(yuǎn)的bin之間連鎖程度低，bin map質(zhì)量較好。

2.2 重組自交系群體以及親本的表型分析

對(duì)RIL群體和親本的生育期相關(guān)性狀進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析（表2），發(fā)現(xiàn)2個(gè)環(huán)境中父母本生育期相關(guān)性狀均存在顯著差異，其中抽穗期的差異最大，LDC-1比YS501平均延遲了2.7 d。RIL群體中3個(gè)生育期的數(shù)據(jù)在不同環(huán)境的偏度和峰度絕對(duì)值均小于1（吐絲期峰度除外），大都近似正態(tài)分布（圖2）。3個(gè)性狀的遺傳差異和環(huán)境差異都達(dá)到極顯著水平，各個(gè)性狀的廣義遺傳力為68.98%～73.81%（表2）。

對(duì)2個(gè)不同環(huán)境條件下玉米R(shí)IL群體的抽穗期、散粉期和吐絲期進(jìn)行相關(guān)性分析（表3），結(jié)果表明，2個(gè)環(huán)境條件下玉米R(shí)IL群體抽穗期、散粉期、 吐絲期兩兩之間均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均大于0.7。

2.3 生育期相關(guān)性狀的QTL定位

采用復(fù)合區(qū)間作圖法（CIM）對(duì)抽穗期、散粉期和吐絲期3個(gè)性狀進(jìn)行QTL檢測(cè)，于2020年揚(yáng)州夏播和2021年鎮(zhèn)江夏播2個(gè)環(huán)境中共檢測(cè)到32個(gè)調(diào)控目標(biāo)性狀的QTLs（表4、圖3），LOD值為2.52～10.86，表型變異貢獻(xiàn)率為3.33%～17.19%。

由2個(gè)環(huán)境的定位結(jié)果可知，共檢測(cè)到10個(gè)控制抽穗期的QTLs，分布在第1、2、4、6、7、9、10染色體上，解釋了3.77%～15.71%的表型變異，LOD值為2.73～9.89。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在第9染色體上的QTL qDTT9-1于2個(gè)環(huán)境中重復(fù)檢測(cè)到，且該QTL表型貢獻(xiàn)率最大，在E1、E2環(huán)境分別為15.71%、10.91%，加性效應(yīng)均為負(fù)值，推測(cè)可能是同一QTL，來(lái)自母本LDC-1的等位基因?qū)Τ樗肫谄鸬搅颂崆暗淖饔谩?/p>

在2個(gè)不同的環(huán)境中共檢測(cè)到11個(gè)控制散粉期的QTL，分布在第2、3、4、6、9、10染色體上，LOD值為2.52～8.97，解釋了3.81%～15.32%的表型變異。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，于E1環(huán)境定位到的qDTP4-1對(duì)表型的貢獻(xiàn)率最大，該QTL加性效應(yīng)為1.41，解釋了15.32%的表型變異，增效基因來(lái)自母本LDC-1。

對(duì)于檢測(cè)到的吐絲期相關(guān)QTL，11個(gè)QTL分布于除第7、8染色體外的其余8條染色體上，解釋的表型貢獻(xiàn)率為3.33%～17.19%，LOD值為2.55～10.86。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)， qDTS9-2在2個(gè)環(huán)境中均被檢測(cè)到，且2個(gè)環(huán)境條件下的表型貢獻(xiàn)率均高于10%，在E1、E2環(huán)境分別為17.19%、12.35%，LOD值最高為10.86，為吐絲期主效QTL，加性效應(yīng)為負(fù)，該增效基因來(lái)自父本YS501。

3 討論與結(jié)論

本研究于2個(gè)環(huán)境中共檢測(cè)到32個(gè)控制生育期相關(guān)性狀的QTLs，分布在除了第8染色體以外的9條染色體上。其中檢測(cè)到的部分QTL與前人具有一致性，本研究檢測(cè)到的qDTP3-2與曹浩飛等基于單片段代換系群體在3號(hào)染色體上umc1844-umc1320-bnlg1182標(biāo)記區(qū)間內(nèi)檢測(cè)到的散粉期QTL qDTA3-2的定位區(qū)間重疊[18];7號(hào)染色體上的qDTT7-2與高世斌等利用N87-1×9526在7號(hào)染色體標(biāo)記區(qū)間bnlg1805內(nèi)定位到的開花期相關(guān)性狀QTL區(qū)間重疊[19];9號(hào)染色體上的qDTT9-1、qDTS9-2與魏海忠等利用玉米自交系80007和80044所構(gòu)建的重組自交系群體在第9染色體上于標(biāo)記bnlg127-umc2337內(nèi)定位到的生育期相關(guān)性狀主效QTL區(qū)間重疊[20]，這些與前人相似的結(jié)果說(shuō)明本研究QTL檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性與可靠性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其中qDTT9-1、qDTS9-2于E1、E2 2個(gè)環(huán)境中均能檢測(cè)到，且表型貢獻(xiàn)率較大（大于10%），上述QTL可能具有較高的育種利用價(jià)值，為后續(xù)開展精細(xì)定位與基因克隆等方面的研究奠定了基礎(chǔ)。另外本研究還存在一些前人未發(fā)現(xiàn)的新QTL，但只在單環(huán)境中被檢測(cè)到，如qDTT4-1、qDTP4-1等，這些QTL仍需進(jìn)一步利用不同群體驗(yàn)證其真實(shí)性。

生育期作為典型的數(shù)量性狀，對(duì)環(huán)境的變化較為敏感，因此在不同環(huán)境下控制生育期的基因表達(dá)可能不盡相同，這就會(huì)導(dǎo)致QTL檢測(cè)結(jié)果有所差異。在本研究中，通過(guò)對(duì)2個(gè)環(huán)境的QTL檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，不同環(huán)境下的定位結(jié)果差異較大，只有2個(gè)QTL在2個(gè)環(huán)境中均被檢測(cè)到，大多數(shù)QTL只在單環(huán)境中被檢測(cè)到，QTL在多個(gè)環(huán)境下的重復(fù)性不高，這可能是由于試驗(yàn)的環(huán)境差異所致。相關(guān)研究也表明，環(huán)境的差異對(duì)生育期相關(guān)性狀的影響較大，其中氣溫和光照是最主要的影響因素[21]。本試驗(yàn)中2個(gè)環(huán)境條件下的播種時(shí)間以及地理位置等因素導(dǎo)致試驗(yàn)環(huán)境間的氣溫和光照差異較為明顯，這可能是導(dǎo)致控制抽穗期等性狀的基因定位結(jié)果存在差異的原因。

此外，眾多研究者提出不同性狀的QTL位置相同應(yīng)該與表型數(shù)據(jù)的相關(guān)性有關(guān)[22-23]。在本研究中生育期相關(guān)性狀的表型數(shù)據(jù)在同一環(huán)境下高度正相關(guān)，而檢測(cè)結(jié)果也出現(xiàn)了QTL成簇分布的現(xiàn)象，如于第4染色體相同區(qū)間檢測(cè)到控制多個(gè)生育期相關(guān)性狀的QTL簇，在第9染色體相同位置78.1～99.8 cM內(nèi)檢測(cè)到到多個(gè)QTL成簇分布（圖3）。

參考文獻(xiàn)：

[1]蘭進(jìn)好. 玉米開花期相關(guān)性狀的QTL分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2010，30（3）：471-480.

[2]劉志齋，郭榮華，石云素，等. 中國(guó)玉米地方品種核心種質(zhì)花期相關(guān)性狀的表型多樣性研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（6）：1591-1602.

[3]胡彥民，吳 欣，李翠香，等. 玉米制種花期相關(guān)性狀的QTL分析[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（1）：11-16.

[4]孫婷婷，姜 昱，沈 鑫，等. 利用F2 ∶3群體對(duì)玉米花期相關(guān)性狀的QTL分析[J]. 玉米科學(xué)，2013，21（2）：42-46.

[5]Veldboom L R，Lee M，Woodman W L.Molecular marker-facilitated studies in an elite maize population：I.Linkage analysis and determination of QTL for morphological traits[J]. Theoretical and Applied Genetics，1994，88（1）：7-16.

[6]Austin D F，Lee M.Genetic resolution and verification of quantitative trait loci for flowering and plant height with recombinant inbred lines of maize[J]. Genome，1996，39（5）：957-968.

[7]公 強(qiáng)，王天宇，譚學(xué)林，等. 玉米優(yōu)異早熟種質(zhì)單330開花相關(guān)性狀的QTL分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2006，7（4）：437-441.

[8]李玉玲，李學(xué)慧，董永彬，等. 利用相同來(lái)源F2 ∶3和BC2S1群體定位玉米生育期QTL[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，22（6）：38-43.

[9]Buckler E S，Holland J B，Bradbury P J，et al. The genetic architecture of maize flowering time[J]. Science，2009，325（5941）：714-718.

[10]Coles N D，McMullen M D，Balint-Kurti P J，et al. Genetic control of photoperiod sensitivity in maize revealed by joint multiple population analysis[J]. Genetics，2010，184（3）：799-812.

[11]Thornsberry J M，Goodman M M，Doebley J，et al. Dwarf8 polymorphisms associate with variation in flowering time[J]. Nature Genetics，2001，28（3）：286-289.

[12]Colasanti J，Tremblay R，Wong A Y M，et al. The maize INDETERMINATE1 flowering time regulator defines a highly conserved zinc finger protein family in higher plants[J]. BMC Genomics，2006，7：158.

[13]Colasanti J，Yuan Z，Sundaresan V. The indeterminate gene encodes a zinc finger protein and regulates a leaf-generated signal required for the transition to flowering in maize[J]. Cell，1998，93（4）：593-603.

[14]Salvi S，Sponza G，Morgante M，et al. Conserved noncoding genomic sequences associated with a flowering-time quantitative trait locus in maize[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2007，104（27）：11376-11381.

[15]Muszynski M G，Dam T，Li B L，et al. Delayed flowering1 encodes a basic leucine zipper protein that mediates floral inductive signals at the shoot apex in maize[J]. Plant Physiology，2006，142（4）：1523-1536.

[16]Wang D，Portis A R.Increased sensitivity of oxidized large isoform of ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase （rubisco） activase to ADP inhibition is due to an interaction between its carboxyl extension and nucleotide-binding pocket[J]. The Journal of Biological Chemistry，2006，281（35）：25241-25249.

[17]McCouch S R，Chen X，Panaud O，et al. Microsatellite marker development，mapping and applications in rice genetics and breeding[J]. Plant Molecular Biology，1997，35（1/2）：89-99.

[18]曹浩飛，王 彬，毛克舉，等. 基于單片段代換系群體的玉米開花期性狀QTL分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，48（1）：6-10.

[19]高世斌，趙茂俊，潘光堂，等. 干旱脅迫與正常環(huán)境下控制玉米開花期性狀的QTL鑒定[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，18（5）：593-597.

[20]魏海忠，商 偉，鐘世宜，等. 利用重組自交系群體定位玉米生育期相關(guān)性狀QTL[J]. 玉米科學(xué)，2014，22（1）：49-55.

[21]劉月娥. 玉米對(duì)區(qū)域光、溫、水資源變化的響應(yīng)研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

[22]Abler B S B，Edwards M D，Stuber C W.Isoenzymatic identification of quantitative trait loci in crosses of elite maize inbreds[J]. Crop Science，1991，31（2）：267-274.

[23]Paterson A H，Damon S，Hewitt J D，et al. Mendelian factors underlying quantitative traits in tomato：comparison across species，generations，and environments[J]. Genetics，1991，127（1）：181-197.