張智麗，李晨光，張興國(guó)，孫宇，崔薇，喬鳳娟，孫炳欣

長(zhǎng)春市疾病預(yù)防控制中心，吉林長(zhǎng)春 130033

手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）是一種由多種腸道病毒引起的、我國(guó)法定報(bào)告管理的丙類傳染?。?］，主要通過(guò)糞-口途徑傳播，也可通過(guò)呼吸道和接觸傳播，5歲以下嬰幼兒為主要易感人群，好發(fā)于夏秋季［2］。自從我國(guó)將HFMD列入丙類傳染病管理后，長(zhǎng)春市HFMD病例報(bào)告始終位于丙類傳染病前列［3］。2008—2012年，長(zhǎng)春地區(qū)HFMD優(yōu)勢(shì)病原為腸道病毒71型（enteroviruses 71，EV-71）［4］，而近年來(lái)病原構(gòu)成逐漸發(fā)生變化，EV-71占比逐漸下降，柯薩奇病毒A組16型（coxsackievirus A16，CV-A16）及其他腸道病毒比重逐漸增加［5-6］。HFMD至今仍無(wú)有效疫苗及特異性治療手段。因此，加強(qiáng)疾病監(jiān)測(cè)，準(zhǔn)確處置疫情，開(kāi)展健康教育是控制該病流行的關(guān)鍵［7］。本研究分析了2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例的病原學(xué)特征，為今后開(kāi)展本地區(qū)傳染病的預(yù)防控制工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣本 收集2012—2018年長(zhǎng)春市哨點(diǎn)醫(yī)院和長(zhǎng)春地區(qū)各縣（市）區(qū)疾控中心采集的HFMD病例的肛拭子、糞便、咽拭子樣本（獲得長(zhǎng)春市疾病預(yù)防控制中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)）。嚴(yán)格按照衛(wèi)生部印發(fā)的《手足口病預(yù)防控制指南（2009版）》［8］要求采集、運(yùn)輸、保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床診斷病例。在流行季節(jié)發(fā)病，常見(jiàn)于學(xué)齡前兒童，嬰幼兒多見(jiàn)，發(fā)熱伴手、足、口、臀部皮疹，部分病例可無(wú)發(fā)熱；極少數(shù)重癥病例皮疹不典型，臨床診斷困難，需結(jié)合病原學(xué)或血清學(xué)檢查進(jìn)行診斷。②確診病例。臨床診斷病例具有下列之一者即可確診：腸道病毒（CV-A16、EV-71等）特異性核酸檢測(cè)陽(yáng)性；分離出腸道病毒，并鑒定為CV-A16、EV-71或其他可引起HFMD的腸道病毒；急性期及恢復(fù)期血清CV-A16、EV-71或其他可引起HFMD的腸道病毒中和抗體有4倍以上升高。

1.2主要試劑及儀器 全自動(dòng)核酸提取儀、腸道病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碩世生物科技股份有限公司；RT-PCR試劑盒（210212）、毛細(xì)管電泳儀（卡夾QIAxcel，DNA Screening Cartridge）購(gòu)自德國(guó)凱杰（QIAGEN）公司。

1.3病毒核酸提取及PCR檢測(cè) 采用全自動(dòng)核酸提取儀提取樣本核酸后，再利用腸道病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本中總腸道病毒、腸道病毒A組71型（EV-A71）和CV-A16進(jìn)行熒光定量PCR。其中非EV-A71陽(yáng)性樣本VP1區(qū)利用引物［CV-A6-VP1-F：5′-TGTTGGGCACG（A）CACGTCTGGGA-3′，CV-A6-VP1-R：5′-CCAGCATAATTTGGGTTGGCT（C）TTG-3′；CV-A16-VP1-F：5′-CAGTAATACACACTAC（T）AGGGCA-3′，CV-A16-VP1-R：5′-ACCCTATAGTTGCCT（C）ACATATA-3′；CV-A10-VP1-F：5′-ATGGCDACAGGCAAGATGCT-3′，CV-A10-VP1-R：5′-ATAYCTAGCAGGGTAATACTC-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成］進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為1 000 bp。反應(yīng)條件為：55℃30 min；94℃2 min；94℃15 s，55℃30 s，68℃40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物用毛細(xì)管電泳儀（卡夾QIAxcel，DNA Screening Cartridge）進(jìn)行檢測(cè)，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.4生物信息學(xué)分析 用LaserGene軟件包中Mega-Align軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，截取VP1區(qū)進(jìn)行后續(xù)分析。用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的非EV-A71各基因型代表株的參比序列均來(lái)自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。采用NJ（neighbor-joiningmethod）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，利用MEGA X軟件，設(shè)置bootstrap值為1 000。

2 結(jié)果

2.1VP1區(qū)基因進(jìn)化分析

2012—2018年長(zhǎng)春市2 621例核酸檢測(cè)陽(yáng)性病例中，非EV-A71陽(yáng)性樣本VP1區(qū)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示，共獲得83條CV-A16序列、30條CV-A6序列和10條CV-A10序列。

2.1.1CV-A16分離株VP1區(qū)基因進(jìn)化分析 基于VP1區(qū)（891 bp），對(duì)CV-A16序列及其各基因型和亞型參考株序列進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A16毒株相對(duì)集中，83條序列均屬于B1亞型，其中8條屬于B1a亞型（2012年1條，2018年7條），其他均屬于B1b亞型。見(jiàn)圖1。

圖1 2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A16型VP1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of VP1 protein of CV-A16 in Changchun City from 2012 to 2018

2.1.2CV-A6分離株VP1區(qū)基因進(jìn)化分析 基于VP1區(qū)（915 bp），對(duì)CV-A6序列及其各基因型和亞型參考株序列進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A6毒株相對(duì)集中，30條序列均屬于D3亞型。見(jiàn)圖2。

圖2 2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A6型VP1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of VP1 protein of CV-A6 in Changchun City from 2012 to 2018

2.1.3CV-A10分離株VP1區(qū)基因進(jìn)化分析 基于VP1區(qū)（894 bp），對(duì)CV-A10序列及其各基因型和亞型參考株序列進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A10毒株相對(duì)集中，10條序列均屬于D2亞型。見(jiàn)圖3。

圖3 2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A10型VP1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of VP1 protein of CV-A10 in Changchun City from 2012 to 2018

2.2VP1區(qū)核苷酸序列同源性分析

2.2.1CV-A16流行株VP1區(qū)同源性分析 結(jié)果顯示，CV-A16各流行株與CV-A16原型株的同源性為75.0%~77.0%，B1a亞型分支與B1a亞型參考株的同源性為92.3%~98.5%，B1b亞型分支與B1b亞型參考株的同源性為94.5%~99.2%，與B1c亞型同源性為88.4%~91.7%，與B2亞型同源性為89.3%~93.0%，其中與B1b亞型同源性較高，各株間同源性為88.2%~100.0%。見(jiàn)圖4。

圖4 2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A16型基于VP1區(qū)序列的同源性分析Fig.4 Homology of CV-A16 based on sequence of VP1 region in HFMD cases in Changchun City from 2012 to 2018

2.2.2CV-A6流行株VP1區(qū)同源性分析 結(jié)果顯示，CV-A6各流行株與CV-A6原型株的同源性為82.7%~83.5%，與B1亞型參考株的同源性為81.9%~93.7%，與B2亞型參考株的同源性為82.1%~84.5%，與C1亞型參考株的同源性為85.1%~86.5%，與C2亞型參考株的同源性為83.8%~84.8%，與D1亞型參考株的同源性為89.7%~91.1%，與D2亞型參考株的同源性為89.2%~91.3%，與D3亞型參考株的同源性為92.8%~98.1%，其中與D3亞型同源性較高，各株間同源性為91.6%~99.8%。見(jiàn)圖5。

圖5 2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A6型基于VP1區(qū)序列的同源性分析Fig.5 Homology of CV-A6 based on sequence of VP1 region in HFMD cases in Changchun City from 2012 to 2018

2.2.3CV-A10流行株VP1區(qū)同源性分析 結(jié)果顯示，CV-A10各流行株與CV-A10原型株的同源性為76.3%~77.0%，與B亞型參考株的同源性為78.9%~80.3%，與C亞型參考株的同源性為82.9%~83.8%，與D1亞型參考株的同源性為94.1%~95.4%，與D2亞型參考株得同源性為96.4%~98.4%，與D3亞型參考株的同源性為94.6%~96.1%，其中與D2亞型同源性較高，各株間同源性為96.4%~100.0%。見(jiàn)圖6。

圖6 2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A10型基于VP1區(qū)序列的同源性分析Fig.6 Homology of CV-A10 based on sequence of VP1 region in HFMD cases in Changchun City from 2012 to 2018

2.3CV-A16流行株變異位點(diǎn)分析 CV-A6和CVA10流行株突變位點(diǎn)并未發(fā)現(xiàn)明顯代表性，因此，選取CV-A16流行株進(jìn)行變異位點(diǎn)分析。將所獲序列中的代表序列經(jīng)MEGA X軟件翻譯獲得氨基酸序列后進(jìn)行變異位點(diǎn)分析，以病毒流行株JX068833.1 BJ08/07 B1b為參考株，結(jié)果顯示，CV-A16毒株中存在14個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異，有12株在第14位點(diǎn)上發(fā)生N天冬酰胺→S絲氨酸（N14S）的變異，其中9株同時(shí)存在L215P變異，1株（ccHFMC2017030）同時(shí)存在N14S、L215P和F131S變異，另有1株（cc-HFMC-2017007）存在N14S、M23L和T94A 3個(gè)位點(diǎn)變異。有9株存在M23L變異，其中8株為B1a亞型，這8株除ccHFMC2012015外，均同時(shí)存在T164K和V251I變異，ccHFMC2012015則同時(shí)存在N218S變異。有2株同時(shí)存在T11A變異，其中ccHFMC2-016046同時(shí)存在I262V變異。在ccHFMC2017008、ccHFMC201430、ccHFMC201421這3株中則分別可見(jiàn)A22T、I235V和T289A變異。見(jiàn)表1。

表1 2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例中CV-A16型VP1區(qū)氨基酸變異位點(diǎn)Tab.1 Variation sites of amino acids in VP1 region of CV-A16 in HFMD cases in Changchun City from 2012 to 2018

3 討論

HFMD是一種常見(jiàn)于嬰幼兒和兒童的急性腸道傳染病，病程復(fù)雜、癥狀多樣，多數(shù)可自愈，少數(shù)病例會(huì)出現(xiàn)重癥，甚至危及生命［9］。由于HFMD的病原具有多樣性，且病原之間經(jīng)常發(fā)生重組變異，因此，隨著每年優(yōu)勢(shì)病原株發(fā)生變遷，就會(huì)引起新一輪HFMD的暴發(fā)流行［10］，在世界范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)。

在國(guó)外，CV-A16常是大規(guī)模HFMD流行時(shí)的主要病原體［11］。以往研究多認(rèn)為CV-A16僅引起輕癥患者，但近年來(lái)，越來(lái)越多的報(bào)道顯示，CV-A16感染也可引起心肌、腦部和肺部等疾病，甚至引起死亡［12-14］。我國(guó)自1981年首次報(bào)道CV-A16型HFMD病例以來(lái)，其他多個(gè)省份相繼出現(xiàn)關(guān)于CV-A16型腸道病毒引起的HFMD暴發(fā)報(bào)道［15-16］。CV-A16被分為2個(gè)基因型：A和B基因型，而B(niǎo)基因亞型又分為B1和B2 2個(gè)亞型。對(duì)2012—2018年長(zhǎng)春市83株CV-A16病原株VP1區(qū)的進(jìn)化分析結(jié)果顯示，近7年長(zhǎng)春市CV-A16病原株均屬于B1基因亞型，其中8條屬于B1a亞型，其他均屬于B1b亞型。從CV-A16 VP1區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上可以看出，B1b亞型上包括2012—2018年各年份的毒株，而B(niǎo)1a亞型的分支上僅有2012年的1條和2018年的7條流行株，表明2012—2018年長(zhǎng)春市內(nèi)B1a和B1b亞型屬于共循環(huán)、共進(jìn)化的過(guò)程，而B(niǎo)1b亞型的CV-A16一直是優(yōu)勢(shì)流行株，2018年B1a亞型與B1b亞型共同流行，這與其他省市的報(bào)道相同［17-19］。將B1a和B1b分流支分別進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)B1b亞型分支與B1b亞型參考株同源性為94.5%~99.2%，B1a亞型分支與B1a亞型參考株同源性為92.3%~98.5%，各株間同源性為88.2%~100.0%，與廣東、北京、河南等中國(guó)其他省份的CV-A16代表株來(lái)源相近，表明與其他病原體相比為區(qū)域性暴發(fā)。

變異位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，2012—2018年長(zhǎng)春市HFMD病例CV-A16毒株中存在14個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異，12株發(fā)現(xiàn)在第14位點(diǎn)上發(fā)生N天冬酰胺→S絲氨酸（N14S）的變異，這與2016年成都流行株（MW179030.1 ZG2016 B1b）相同，其中有9株同時(shí)存在L215P變異（2017年8株，2018年1株），提示該位點(diǎn)變異可能已演變?yōu)檩^穩(wěn)定的基因特征被流行傳遞下來(lái)。有9株存在M23L變異，其中8株為B1a亞型，這8株除ccHFMC2012015外，均同時(shí)存在T164K和V251I變異，這與2018年廣州流行株（MT119437.1 CHN/GZ/2018 B1a）相同。長(zhǎng)春市有1株（ccHFMC2017-007）存在N14S、M23L和T94A 3個(gè)位點(diǎn)變異，VP1第94~108位氨基酸肽段是一個(gè)保守型線性中和抗體，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗CV-A16感染的中和抗體［20］，這可能降低親和力和免疫優(yōu)勢(shì)，影響中和抗體結(jié)合。

自2008年，芬蘭暴發(fā)了1起由CV-A6引起的HFMD疫情后［21］，全球各地均有CV-A6引起HFMD暴發(fā)流行的報(bào)道［22-23］，長(zhǎng)春市2013年也曾暴發(fā)過(guò)由CV-A6引起的HFMD疫情［24］。目前國(guó)內(nèi)將CVA6主要?jiǎng)澐譃锳~D 4個(gè)基因型別，CV-A6原型株為A分支，未在國(guó)內(nèi)流行。對(duì)2012—2018年長(zhǎng)春市30株CV-A6病原株VP1區(qū)的進(jìn)化分析結(jié)果顯示，近7年長(zhǎng)春市CV-A6病原株均屬于D3基因亞型。2012—2018年長(zhǎng)春市CV-A6流行株與CV-A6原型株的同源性為82.7%~83.5%，與B1亞型參考株的同源性為81.9%~93.7%，與B2亞型參考株的同源性為82.1%~84.5%，與C1亞型的同源性為85.1%~86.5%，與C2亞型的同源性為83.8%~84.8%，與D1亞型的同源性為89.7%~91.1%，與D2亞型的同源性為89.2%~91.3%，與D3亞型的同源性為92.8%~98.1%，其中與D3亞型的同源性較高，各株間同源性為91.6%~99.8%。目前長(zhǎng)春主要流行的CV-A6毒株與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)流行的型別相同［25］，均為D3亞型，并未進(jìn)化出新的型別。

雖然CV-A10并不是長(zhǎng)春市HFMD的主要優(yōu)勢(shì)型別，但有研究表明，CV-A10與EV71相似，其感染導(dǎo)致重癥和死亡的頻率相對(duì)較高［26］。根據(jù)CV-A10的VP1基因序列，將CV-A10分為A~D 4個(gè)基因型，目前國(guó)內(nèi)主要流行從B型和C型亞型逐漸轉(zhuǎn)為D型亞型［26-27］。對(duì)2012—2018年長(zhǎng)春市10株CVA10病原株VP1區(qū)的進(jìn)化分析結(jié)果顯示，與CV-A10原型株的同源性為76.3%~77.0%，與B亞型參考株的同源性為78.9%~80.3%，與C亞型參考株的同源性為82.9%~83.8%，與D1亞型參考株的同源性為94.1%~95.4%，與D2亞型參考株的同源性為96.4%~98.4%，與D3亞型參考株的同源性為94.6%~96.1%，其中與D2亞型同源性較高，各株間同源性為96.4%~100.0%。表明長(zhǎng)春市2012—2018年CV-A10毒株為D2亞型，與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)主要流行的型別相同［28］，較為穩(wěn)定。

目前，非EV-A71型腸道病毒引起的HFMD疫情日益加重，而對(duì)其研究相對(duì)較少，疫苗研發(fā)基礎(chǔ)薄弱，研發(fā)難度大［29］。只有通過(guò)加強(qiáng)對(duì)HFMD病毒株的進(jìn)一步研究，掌握病毒變異及進(jìn)化狀態(tài)，才能控制HFMD的流行。本研究通過(guò)對(duì)2012—2018年長(zhǎng)春市非EV-A71毒株進(jìn)行分析，探討其傳播規(guī)律和進(jìn)化情況，對(duì)疾病防控具有重要意義。