王寧，章宦勝，苗潔，陳海園

（溫州市質(zhì)量技術(shù)檢測(cè)科學(xué)研究院，浙江 溫州 325007）

引言

對(duì)苯二胺、鄰苯二胺和間苯二胺是廣泛應(yīng)用于皮革、毛皮生產(chǎn)領(lǐng)域的染色劑和染料中間體[1-2]，但也是國(guó)際公認(rèn)的致癌物質(zhì)。其中對(duì)苯二胺和間苯二胺均被列入世界衛(wèi)生組織下屬國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）公布的 3 類致癌物質(zhì)清單中，鄰苯二胺早在1998 年即被列入美國(guó)加州 65 號(hào)提案的致癌化學(xué)品清單中。另外，苯二胺類物質(zhì)經(jīng)皮膚或呼吸道進(jìn)入人體后，還具有免疫毒性、臟器毒性、致突變性 等危害[3-5]。我國(guó)作為鞋類生產(chǎn)和出口大國(guó)，在近年來的國(guó)際貿(mào)易壁壘、國(guó)內(nèi)鞋產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級(jí)以及國(guó)民 對(duì)于健康安全需求提升的多重作用下，我國(guó)對(duì)于鞋產(chǎn)品中有毒有害物質(zhì)也日趨重視[6]。2012 年等同采用ISO/TR 16178：2010 制 定 發(fā) 布 的 GB/T 29292-2012《鞋類 鞋類和鞋類部件中存在的限量物質(zhì)》[7]中將對(duì)苯二胺列為“懷疑對(duì)穿著者有危害的物質(zhì)”，皮革是其可能存在的主要部件種類。鄰苯二胺和間苯二胺雖然沒有列入其中，但在化妝品行業(yè)已被認(rèn)定為禁用物質(zhì)[8]，在今后皮革及鞋類行業(yè)發(fā)展中也應(yīng)給予更多的重視。在檢測(cè)方法方面，苯二胺類的檢測(cè)方法研究主要集中在化妝品、空氣、水源等方面[4-5,9-11]，而在鞋類、皮革領(lǐng)域研究較為少見，且研究主要針對(duì)對(duì)苯二胺的氣相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用法[12-13]，至今鞋類、皮革領(lǐng)域還沒有發(fā)布相應(yīng)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)。本文建立了一種高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，對(duì)鞋類皮革部件中對(duì)苯二胺、鄰苯二胺和間苯二胺開展含量測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備

高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜儀 （1290 Infinity II/G6495A 型），美國(guó) Agilent 公司；超聲波清洗器（SB-800DT 型），寧波新芝生物科技有限公司；數(shù)顯振蕩搖床（HS 501 型），德國(guó) IKA 公司；電子天平（精度 0.0001 g），瑞士 Mettler Toledo 公司；電子天平（精度 0.001 g），德國(guó) Sartorius 公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和試劑

對(duì)苯二胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（p-PDA，CAS：106-50-3，純度 99.7%）、 鄰 苯 二 胺 標(biāo) 準(zhǔn) 物 質(zhì)（o-PDA，CAS：95-54-5， 純 度 99.9%）、 間 苯 二 胺 標(biāo) 準(zhǔn) 物 質(zhì)（m-PDA，CAS：108-45-2，純度 99.9%），北京曼哈格生物科技有限公司生產(chǎn)；甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯均為色譜純，由上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司提供。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取 10.0 mg 對(duì)苯二胺、鄰苯二胺、間苯二胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配制 成 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為 997、999、999 mg/L 的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃避光保存。分別移取 1003、1001、1001 μL 的苯二胺、鄰苯二胺、間苯二胺單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于 10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度均為 100 mg/L 的混合 標(biāo)準(zhǔn)中間液，4 ℃避光保存。臨用時(shí)，用混合標(biāo)準(zhǔn)中間液逐級(jí)稀釋，甲 醇 定 容 ，配 制 成 5、10、20、50、100、200、500 μg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取 0.5 g（精確至 0.001 g）剪碎的鞋用皮革樣品（任意一邊長(zhǎng)度不大于 3 mm）置于 20 mL 棕色頂空瓶中，加入 10 mL 甲醇后加蓋密封，待試樣完全浸濕后在超聲波清洗器中超聲提取 60 min，將提取液潷至 30 mL 棕色頂空瓶中密閉保存，將試樣再次加入 10 mL 甲醇超聲提取 60 min，合并兩次提取液，混勻后取適量經(jīng) 0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾，用高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析測(cè)定。

1.5 液相色譜和質(zhì)譜條件

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱為 ZORBAX Extend C18 （3.0 mm×100 mm，3.5 μm），柱溫為 30 ℃，流動(dòng)相為甲醇和水，體積比為 10∶90，流速為 0.3 mL/min，進(jìn)樣量為 1 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離 （ESI+） 模式下，干燥氣溫度 280℃，干燥氣流速 14 L/min，霧化器壓力 35 psi，鞘氣溫度 300 ℃，鞘氣流速 6 L/min，毛細(xì)管電壓 4000 V，監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），三種苯二胺的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)見表 1。

表1 三種苯二胺的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)Tab. 1 MRM parameters of 3 kinds of phenylenediamines

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

選擇 ZORBAX Extend C18 （3.0 mm×100 mm,3.5 μm）為分析用色譜柱，分別考察了甲醇 / 水、乙腈 / 水、甲醇 /5 mmol/L 乙酸銨水溶液、乙腈 /5 mmol/L 乙酸銨水溶液流動(dòng)相體系對(duì)三種待測(cè)組分的分離效果。在 0.3 mL/min 流速下，甲醇 / 水體系獲得的分離度和響應(yīng)性最好，在水相中加入 5 mmol/L乙酸銨可以有效改善對(duì)苯二胺的峰型，但間苯二胺和鄰苯二胺的響應(yīng)值較甲醇 / 水體系存在顯著的降低。乙腈 / 水和乙腈 /5 mmol/L 乙酸銨水溶液體系雖然也能獲得良好的分離度，但三種待測(cè)組分的響應(yīng)值均較低。因此最終選定甲醇 / 水為流動(dòng)相，且經(jīng)比例 調(diào) 整 比 較 后 確 定 甲 醇 / 水 的 流 動(dòng) 相 體 積 比 為10∶90。

2.2 提取方式的選擇

目前實(shí)驗(yàn)室常見的提取方法主要有超聲提 取 、振蕩提取、索式提取等。索式提取操作較為繁瑣、提取時(shí)間較長(zhǎng)，并且本研究的三種待測(cè)組分在高溫下易被氧化，因此不考慮使用。本研究取鞋用 皮革陽性樣品，分別在常溫下進(jìn)行甲醇超聲提取和振蕩提取 ，處 理 時(shí) 間 均 為 60 min，所 得 提 取 效 果 如 圖 1 所示。結(jié)果表明，超聲提取與振蕩提取相比，三種苯二胺的提取量均較高，因此選用超聲提取作為本試驗(yàn)的提取方式。

圖1 三種苯二胺在不同提取方式下的提取效果Fig. 1 The extracting effects of 3 kinds of phenylenediamines with different extracting method

2.3 提取溶劑的選擇

分別用甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯作為 溶劑對(duì)皮革陽性樣品進(jìn)行超聲提取，所得結(jié)果見圖 2。由圖可見 ，甲醇 對(duì) 三 種 苯 二 胺 的 提 取 效 果 最 佳 ，乙 腈 次之，丙酮和乙酸乙酯提取效果相近且均較差。因 此確定選用甲醇作為本試驗(yàn)的提取溶劑。

2.4 提取時(shí)間與次數(shù)的選擇

為了考察超聲提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響，以陽性樣品加入甲醇后提取 20、30、40、50、60、70、80、90 min，對(duì)提取液中三種苯二胺的含量進(jìn)行測(cè)定，所得結(jié)果見圖 3。從圖中可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，三種苯二胺的提取量均表現(xiàn)出逐漸增大的趨勢(shì)，在 50 min 后增長(zhǎng)緩慢，在 60 min 時(shí)基本趨于穩(wěn)定，表明在該時(shí)間點(diǎn)提取濃度已基本達(dá)到平衡，因此確定萃取時(shí)間為 60 min。

圖3 不同提取時(shí)間對(duì)三種苯二胺提取效果的影響Fig. 3 The influence of extracting duration on the extracting effects of 3 kinds of phenylenediamines

為 確 保 皮 革 樣 品 中 的 目 標(biāo) 物 被 完 全 提 取 出來，對(duì)樣品進(jìn)行三次重復(fù)提取試驗(yàn)，一次、兩次、三次提取所得三種苯二胺的含量見圖 4。從圖中可以看出，經(jīng)過第二次提取，三種苯二胺的提取量均有所提升，以間苯二胺為例，第二次提取比第一次提取所得結(jié)果提升 27%。第三次提取所得結(jié)果與第二次相比沒有明顯差別，表明第二次提取已將樣品中的目標(biāo)物提取完全，因此確定試驗(yàn)的提取次數(shù)為兩次。

圖4 不同提取次數(shù)所得的三種苯二胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig. 4 The contents of 3 kinds of phenylenediamines obtained with different extraction frequencies

2.5 方法的線性和檢出限

按照 1.3 配 制一 系 列 標(biāo) 準(zhǔn) 工 作 溶 液 ， 進(jìn) 行HPLC-MS/MS 測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)、響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，所得三種苯二胺的線性回歸方程和關(guān)系數(shù) R2如表 2 所示。結(jié)果表明，三種苯二胺在 5～500 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2均大于 0.997。

表2 三種苯二胺的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab. 2 The linearity ranges, regression equations, correlation coefficients and detection limits for 3 kinds of phenylenediamines

按照 1.4～1.5 的步驟，采用空白樣品加標(biāo)的試驗(yàn)方法，通過所得譜圖信噪比為 3 所對(duì)應(yīng)的加標(biāo)水平來確定三種目標(biāo)物的檢出限。經(jīng)過試驗(yàn)，對(duì)苯二胺在本試驗(yàn)方法條件下的檢出限為 0.03 mg/kg，間苯二胺和鄰苯二胺的檢出限為 0.02 mg/kg。

2.6 方法的回收率和精密度

以 0.2、2、20 mg/kg 三個(gè)添加水平對(duì)鞋用皮革樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平進(jìn)行 6 次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，所得平均回收率和精密度列于表 3，其中精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。由表可知，在本試驗(yàn)方法條件下，三種苯二胺在 3 個(gè)添加水平下的平均回收率為 89.3%～105.7%，RSD 為 3.6%～8.1%。證明該法準(zhǔn)確性高，精密度良好。

表3 方法的精密度和回收率Tab. 3 Precision and recovery of the method

3 結(jié)論

建立了測(cè)定鞋類皮革部件中對(duì)苯二胺、鄰苯二胺、間苯二胺殘留量的 HPLC-MS/MS 方法，對(duì)提取方式、提取溶劑、提取時(shí)間和次數(shù)、HPLC-MS/MS 儀器參數(shù)等條件進(jìn)行研究確立。三種苯二胺在 5～500 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于 0.997，檢出限為 0.02～0.03 mg/kg，回收率在 89%～106%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在 3%～9%之間，該法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度良好，可用于鞋類皮革部件中對(duì)苯二胺、鄰苯二胺、間苯二胺殘留量的檢測(cè)分析。