牛宏澤，馬政禹，靳天宇，石 磊，任有蛇

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801)

目前，受精液保存技術(shù)限制，綿羊精液通過低溫保存為主，這既能保存一定時(shí)間，還能保證較高的受胎率。在低溫保存過程中，精子產(chǎn)生的大量活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）會損傷質(zhì)膜，破壞精子的結(jié)構(gòu)與功能。因此，精液低溫保存的關(guān)鍵是在稀釋液中添加一定量的牛血清蛋白、褪黑素、維生素E等抗氧化物質(zhì)，從而緩解保存過程中精子受到的氧化損傷。

蜂王漿是工蜂下咽腺和下頜腺的分泌物，其含有多種能清除氧自由基的物質(zhì)，可緩解氧化損傷。研究表明，在稀釋液中添加適宜濃度的蜂王漿能顯著提高精子的活率、活力、運(yùn)動能力、質(zhì)膜完整性和頂體完整率，從而延長精液保存時(shí)間，并且蜂王漿中的糖類能夠?yàn)榫踊顒犹峁┠茉?。精子攝能需要糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，GLUTs 蛋白是由基因編碼的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖、果糖等多種糖類，已知的GLUTs 結(jié)構(gòu)有14種。目前發(fā)現(xiàn)與哺乳動物精子有關(guān)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有GLUT 1～3、GLUT 5 和GLUT 8。其中GLUT 3 是精子質(zhì)膜上豐富的膜蛋白之一，介導(dǎo)糖轉(zhuǎn)運(yùn)，能夠直接影響精子線粒體的活性；GLUT 8 是睪丸組織內(nèi)主要的糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，與精子的發(fā)生密切相關(guān)，靳天宇等發(fā)現(xiàn)綿羊精子中GLUT 3 和GLUT 8 的分布在精子中線粒體密集區(qū)域，表明它們與精子線粒體的能量代謝相關(guān)。

有關(guān)蜂王漿對低溫保存綿羊精子質(zhì)量的影響及其機(jī)制尚不明確，本實(shí)驗(yàn)在稀釋液中添加不同濃度的蜂王漿，研究其對低溫保存綿羊精子質(zhì)量和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT 3和GLUT 8 表達(dá)的影響，為其在動物精液保存中的研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 蜂王漿來自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)蜂實(shí)驗(yàn)室，由意大利蜜蜂采集油菜花蜜粉后分泌，收集時(shí)間為2018 年12 月，蜂王漿分裝至-20℃長期保存。Tris、果糖、檸檬酸、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、青鏈霉素混合液、甘氨酸均購于北京索萊寶生物科技有限公司，JC-1、碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）購于美國Med Chem Express 公司，Anti-GLUT 3 antibody、Anti-GLUT 8 antibody、-actin antibody 購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，熒光二抗購自美國LI-COR 公司，硝酸纖維膜、脫脂奶粉、SDS-PAGE 凝膠試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、RIPA 蛋白裂解液、廣譜蛋白酶抑制劑購自武漢博士德生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 選用山西省太谷縣保森畜牧集團(tuán)有限公司體況良好的2～3 歲杜泊種公羊8 只，假陰道法采集精液后，將鮮精活率不低于0.8 的精液混池，用于后續(xù)試驗(yàn)。本研究采精時(shí)間為2018 年12 月—2019 年12 月。

1.3 精液處理 100 mL稀釋液22.3 mmol/L Tris，5.3 mmol/L果糖，7.2 mmol/L 檸檬酸，15 mL 卵黃和10 mL 100 IU單位青鏈霉素，配置完成后搖勻并5℃保存。將稀釋液分為5 組，分別添加0.00%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%的蜂王漿，分別將5 組精液逐步稀釋至8 倍，放入5℃冰箱使其2 h 內(nèi)降至5℃，然后保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 取保存0、24、48 h 和72 h 的精液，置于37℃水浴鍋中孵育3 min，輕輕混勻，分別檢測精子的活率（Motility）、活力（Viability）、運(yùn)動參數(shù)、質(zhì)膜完整性和線粒體活性。

1.4.1 精子運(yùn)動能力測定 取10 μL 精液，壓片后在400 倍鏡下在計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)中檢測精子活率、活力、直線運(yùn)動速率（Straight-line Velocity，VSL）、路徑速度（Average Path Velocity，VAP）及曲線運(yùn)動速率（Curvilinear Velocity，VCL）。

1.4.2 質(zhì)膜完整性測定 采用低滲膨脹實(shí)驗(yàn)測定質(zhì)膜完整性。吸取10 μL 精液加入預(yù)熱的離心管中，再加入100 μL 預(yù)熱的低滲溶液（稱取1.35 g 果糖和0.375 g 檸檬酸鈉，溶于100 mL 蒸餾水）37℃水浴鍋孵育30 min后混勻，吸取混合液滴于載玻片涂片，風(fēng)干后在400 倍顯微鏡下觀察，隨機(jī)拍取400 個(gè)以上精子。質(zhì)膜完整性=（彎尾精子數(shù)/總精子數(shù)）×100%。

1.4.3 線粒體活性測定 通過JC-1 與PI 雙熒光探針技術(shù)檢測線粒體活性。吸取80 μL 精液加入預(yù)熱的離心管中，加入4 μL JC-1 和2 μL PI，避光孵育30 min，然后加入總體積10%的Hancock's Solution 溶液混勻，吸取混合液于載玻片上，壓片后400 倍熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)400 個(gè)以上精子。線粒體活性=（尾部呈黃色熒光的精子數(shù)/總精子數(shù)）×100%。

1.4.4 綿羊精子能量代謝蛋白的豐度的檢測 采用Western Blot 法檢測綿羊精子能量代謝蛋白的豐度。取保存0、24、48 h 和72 h 精子的總蛋白并測定蛋白濃度，按照精子蛋白:蛋白上樣緩沖液=4:1，加入上樣緩沖液，在95℃條件下變性10 min。保證每孔上樣的蛋白量為50 μg，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳（濃縮膠5% 80 V 30 min，分離膠10% 120 V 1.5 h）后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，將膜浸于5% 脫脂奶粉中室溫封閉1 h。然后將不同的膜浸于GLUT 3（1:500）、GLUT 8（1:800）、-actin（1:5000）蛋白抗體孵育4℃過夜。TBST 漂洗3 次，每次10 min，加入熒光二抗（1:15000）避光孵育1 h 后，TBST 漂洗3 次，每次10 min，用OdysseyCLΧ 雙色近紅外成像系統(tǒng)拍照。GLUT 蛋白豐度值=GLUT 蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，用LSD 法進(jìn)行多重比較。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。Western Blot 結(jié)果用Image J 軟件進(jìn)行分析，通過Graphpad Prism 7.0 作圖。＜0.05 表示差異顯著，＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 稀釋液中添加蜂王漿對低溫保存的綿羊精子運(yùn)動能力的影響 由表1 和表2 可知，保存0 h 和24 h，5 個(gè)處理組間精子的活率和活力差異均不顯著；在保存48 h和72 h 時(shí)，0.75% 蜂王漿組的精子活率和活力顯著高于對照組，其余試驗(yàn)組與對照組間、試驗(yàn)組間精子活率和活力的差異均不顯著。

表1 稀釋液中不同濃度蜂王漿對低溫保存綿羊精子活率的影響 %

表2 稀釋液中不同濃度RJ 對低溫保存綿羊精子活力的影響 %

由表3 可知，保存0 h 和24 h 時(shí)，5 個(gè)處理組間精子的VAP、VCL 和VSL 差異均不顯著。保存48 h 時(shí)，試驗(yàn)組精子的VAP 均顯著高于對照組，但試驗(yàn)組間差異不顯著；0.75%蜂王漿組的VCL 和VSL 顯著高于對照組，其他試驗(yàn)組與對照組間差異不顯著。保存72 h時(shí)，試驗(yàn)組精子的VAP 均顯著高于對照組，其中0.75%蜂王漿組精子VAP 顯著高于0.25%、1.00%蜂王漿組；0.75%、0.50%蜂王漿組精子的VCL 均顯著高于對照組，但與其他2 個(gè)試驗(yàn)組間差異不顯著；0.75%蜂王漿組精子的VSL 顯著高于對照組。

表3 稀釋液中不同濃度蜂王漿對低溫保存綿羊精子運(yùn)動參數(shù)的影響 μm/s

2.2 稀釋液中添加RJ 對低溫保存綿羊精子質(zhì)膜完整性和線粒體活性的影響 由表4 可知，保存0 h 和24 h 時(shí)，5個(gè)處理組間精子的質(zhì)膜完整性差異均不顯著。保存48 h，0.50%、0.75%蜂王漿組精子的質(zhì)膜完整性均顯著高于對照組。保存72 h，0.75%蜂王漿組精子的質(zhì)膜完整性顯著高于對照組，而其他間的差異均不顯著。

表4 稀釋液中不同濃度RJ 對低溫保存綿羊精子質(zhì)膜完整性的影響 %

由表5 可知，保存0 h，5 個(gè)處理組間精子的線粒體活性差異不顯著。保存24 h 時(shí)，0.75% 蜂王漿組的線粒體活性顯著高于對照組。保存48 h 和72 h 時(shí)，試驗(yàn)組精子的線粒體活性均顯著高于對照組，0.75%蜂王漿組精子的線粒體活性顯著高于0.25% 蜂王漿組；保存48 h 時(shí)0.50%蜂王漿組精子的線粒體活性也顯著高于0.25%蜂王漿組，但與0.75%、1.00%蜂王漿組間差異不顯著；保存72 h，0.50%、0.75%、1.00% 蜂王漿組間精子的線粒體活性差異不顯著。

表5 稀釋液中不同濃度蜂王漿對低溫保存綿羊精子線粒體活性的影響 %

2.3 保存時(shí)間和0.75% 蜂王漿對綿羊精子蛋白GLUT 3表達(dá)量的影響 由圖1 和圖2 可知，精子GLUT 3 的蛋白豐度隨保存天數(shù)延長而下降，但差異不顯著；保存72 h，0.75%蜂王漿組精子的GLUT 3 蛋白豐度顯著高于對照組。

圖1 低溫保存0～72 h 精子GLUT 3 蛋白豐度變化

圖2 精子蛋白GLUT 3 保存72 h 后豐度結(jié)果

2.4 保存時(shí)間和0.75% 蜂王漿對綿羊精子蛋白GLUT 8表達(dá)量的影響 圖3 和圖4 顯示，保存72 h GLUT 8蛋白豐度顯著低于0 h；與對照組相比，72 h 時(shí)0.75%蜂王漿組的GLUT 8 蛋白豐度顯著提高。

圖3 低溫保存0～72 h 精子GLUT 8 蛋白豐度變化

圖4 精子蛋白GLUT 8 保存72 h 后豐度結(jié)果

3 討 論

精液低溫保存過程中，精子會產(chǎn)生大量的ROS，引起氧化應(yīng)激，對精子造成損傷，降低精子質(zhì)量。低溫保存會使精液中ROS 和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平升高，從而降低精液中抗氧化酶的活性，導(dǎo)致精子的質(zhì)膜完整性和頂體完整率降低，使精子受到損傷。本實(shí)驗(yàn)在5℃保存72 h，各組精子的活率和活力均有所下降，精子已經(jīng)發(fā)生氧化應(yīng)激，其運(yùn)動能力、質(zhì)膜完整性和線粒體完整性均顯著降低，這表明5℃保存過程中綿羊精子質(zhì)量會有所下降。同時(shí)低溫引起精子的膜損傷會影響其對外界營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，Sancho 等研究發(fā)現(xiàn)，冷凍后的精子細(xì)胞膜上的GLUT 3 表達(dá)量顯著下降。本研究的Western Blot 結(jié)果顯示在精液5℃保存72 h 的過程中，精子中GLUT 3 和GLUT 8 的表達(dá)量隨著保存時(shí)間延長而逐漸下降，這可能是由于保存過程中精子產(chǎn)生過量的ROS，改變了線粒體膜的通透性，引起線粒體吸水膨脹導(dǎo)致外膜破裂。

有研究表明，蜂王漿的抗氧化特性源于其成分中含有可以清除自由基的酚類物質(zhì)。Asadi 等研究發(fā)現(xiàn)，對精索靜脈曲張誘導(dǎo)的大鼠補(bǔ)充200 mg/kg/d蜂王漿，其睪丸的總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）較對照組顯著提高，超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPx）活性也顯著增加，這表明添加適宜濃度的蜂王漿能夠緩解精子的氧化應(yīng)激，提高精子質(zhì)量。本研究中，添加0.75%的蜂王漿具有緩解氧化應(yīng)激造成的精子活率、活力下降與質(zhì)膜完整性降低的作用，還能維持保存過程中綿羊精子的線粒體活性，這與前人的研究結(jié)果一致。

精子中最重要的細(xì)胞器是線粒體，它具有促進(jìn)細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換，參與細(xì)胞凋亡的作用，與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低溫保存過程中0.75% 蜂王漿組的線粒體活性在72 h 顯著高于對照組，這是由于蜂王漿緩解了氧化應(yīng)激對線粒體的損傷，降低了線粒體通透性，減緩細(xì)胞色素的釋放，防止線粒體功能發(fā)生障礙。Shahzad 等研究表明0.1%的蜂王漿可提高水牛精子的運(yùn)動性能與活力，維持質(zhì)膜完整性，這與本研究結(jié)果一致。另外本研究發(fā)現(xiàn)，在稀釋液中添加0.75% 的蜂王漿，5℃保存72 h 后GLUT 3 和GLUT 8 的表達(dá)較對照組顯著提高。這是因?yàn)榉渫鯘{中含有的黃酮類物質(zhì)能夠降低精子細(xì)胞內(nèi)Ca濃度和酪氨酸激酶磷酸化程度，從而抑制精子獲能，保護(hù)GLUTs 蛋白，與本實(shí)驗(yàn)中的線粒體活性和質(zhì)膜完整性結(jié)果相互映證。

本研究中，保存72 h 時(shí)1.00% 蜂王漿組精子的各項(xiàng)參數(shù)均低于0.75% 蜂王漿組但高于對照組，這是因?yàn)镽OS 在體內(nèi)參與眾多正常生理反應(yīng)，但過量會導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)部的氧化還原系統(tǒng)失衡，如果機(jī)體補(bǔ)充外源性抗氧化劑則會防止這一現(xiàn)象發(fā)生。若是外源性抗氧化劑補(bǔ)充過量，即使有一定的抗氧化作用，但ROS 會繼續(xù)與這些過量的抗氧化劑結(jié)合，導(dǎo)致機(jī)體的氧化還原狀態(tài)依然不平衡。本實(shí)驗(yàn)中添加蜂王漿能緩解精子受到的氧化應(yīng)激，但補(bǔ)充過量又會使精子再次處于異常的氧化還原狀態(tài)中。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在綿羊精液的低溫保存過程中，稀釋液中添加0.75 %的蜂王漿能顯著提高精子活率、活力、質(zhì)膜完整性和線粒體活性，并通過影響綿羊精子中GLUT 3 和GLUT 8 的表達(dá)，調(diào)節(jié)綿羊精液低溫保存過程的能量代謝，從而改善低溫保存綿羊精子的質(zhì)量。