李青林，張文濤，徐慧，孫京京

低磷脅迫下黃瓜木質(zhì)部與韌皮部汁液的代謝物變化

李青林*，張文濤，徐慧，孫京京

江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013

【背景】木質(zhì)部汁液負(fù)責(zé)為地上部分運輸水和營養(yǎng)物質(zhì)，韌皮部汁液則主要負(fù)責(zé)光合產(chǎn)物的運輸，在植株受到非生物脅迫時，它們會發(fā)生不同的變化?！灸康摹垦芯康土酌{迫下黃瓜木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)各種代謝物含量變化，探究黃瓜在低磷脅迫下的代謝變化規(guī)律，為黃瓜磷匱乏狀態(tài)診斷提供新思路與依據(jù)?！痉椒ā坎杉Ａ姿剑?.25 mmol?L-1）與低磷脅迫（0.3125 mmol?L-1）下黃瓜植株的木質(zhì)部與韌皮部汁液，經(jīng)三甲基硅烷化衍生化處理后用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）進(jìn)行檢測和定性定量分析。【結(jié)果】低磷脅迫下木質(zhì)部汁液內(nèi)糖類沒有發(fā)生顯著變化，多數(shù)氨基酸的含量與正常情況相比明顯上升，有機(jī)酸中的蘋果酸呈顯著下降趨勢，軟脂酸、油酸等則顯著高于正常水平；低磷脅迫下的韌皮部汁液中，糖類與氨基酸多數(shù)低于正常水平，草酸、琥珀酸等有機(jī)酸的含量也明顯降低。此外，為篩選黃瓜木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)潛在的生物標(biāo)志物，使用OPLS-DA與獨立樣本T檢測方法對GC-MS試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果表明，在黃瓜木質(zhì)部汁液檢出8種低磷脅迫下的潛在生物標(biāo)志物（VIP>1，<0.05），分別為尸胺、蘋果酸、四氨基丁酸、軟脂酸、肌醇、纖維二糖、N, N-二甲基十二酰胺與單硬脂酸甘油酯；在黃瓜韌皮部汁液中檢出7種低磷脅迫下的潛在生物標(biāo)志物（VIP>1，<0.05），分別為絲氨酸、亞油酸、10, 13-環(huán)氧-11-甲基十八碳-10, 12-二烯酸、脫氫樅酸、N, N-二甲基十二酰胺、2, 2'-亞甲基雙（6-叔丁基-4-甲基苯酚）、L-2-哌啶酸?！窘Y(jié)論】低磷脅迫下，黃瓜的木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)的糖類、氨基酸和有機(jī)酸均發(fā)生了變化，但是變化趨勢并不相同。分別在木質(zhì)部和韌皮部汁液中篩選出8種和7種生物標(biāo)志物，可為黃瓜磷匱乏狀態(tài)診斷提供新思路與依據(jù)。生物標(biāo)志物中，蘋果酸、四氨基丁酸、軟脂酸、絲氨酸與亞油酸的檢測手段已經(jīng)較為成熟，以其為檢測對象的黃瓜磷匱乏狀態(tài)診斷方法具有較好的實用性。

黃瓜；木質(zhì)部；韌皮部；磷脅迫；代謝組學(xué)；生物標(biāo)志物

0 引言

【研究意義】木質(zhì)部與韌皮部汁液在植物養(yǎng)分和信號的傳輸與分配中起著關(guān)鍵作用[1]，木質(zhì)部汁液主要將根系吸收的水分和礦質(zhì)養(yǎng)分從土壤輸送到植物的地上部分，其中還含有許多其他有機(jī)化合物，包括羧酸鹽、激素、氨基酸、肽和蛋白質(zhì)[2]；韌皮部汁液的主要作用是將光合產(chǎn)物從進(jìn)行光合作用的源器官運輸?shù)綆炱鞴?，其主要成分是糖，還有蛋白質(zhì)、氨基酸、酰氨、維生素、無機(jī)鹽和植物激素等[3]。研究低磷脅迫下植株木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)代謝物含量的變化規(guī)律，對加深植物在低磷脅迫下代謝變化規(guī)律的認(rèn)識，探究新的植物磷匱乏檢測手段具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在受到非生物脅迫時，植株會調(diào)整代謝網(wǎng)絡(luò)以保證植株正常生長發(fā)育[4]，從而影響體內(nèi)各種代謝物的含量。代謝組學(xué)可以通過對植株體內(nèi)的各種小分子化合物進(jìn)行定性定量分析，研究代謝物的變化規(guī)律[5]，進(jìn)而反映植物在非生物脅迫下的生理變化。同時，代謝組學(xué)分析能夠發(fā)現(xiàn)在不同組間具有顯著性差異的某種或若干種代謝物，即為生物標(biāo)志物，其在生物體代謝過程和生理變化機(jī)制的研究中具有重要作用[6]。Sung等[7]通過對番茄葉片和根系在氮、磷或鉀脅迫下的新陳代謝變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這3種礦物質(zhì)脅迫都會影響能量生產(chǎn)和氨基酸代謝。zhao等[8]通過高效液相色譜質(zhì)譜分析低溫下草菇的代謝變化，確定了216種潛在生物標(biāo)志物，揭示了耐低溫草菇菌株的耐低溫機(jī)理。Zhang等[9]使用核磁共振波譜分析鹽脅迫下煙草植株的代謝響應(yīng)。對植株進(jìn)行代謝組學(xué)研究，能探究植株在不同環(huán)境影響下的代謝變化規(guī)律。對生物標(biāo)志物的含量進(jìn)行測量，能在一定程度上反映植株的生理狀態(tài)，為植株生長環(huán)境的調(diào)控提供指導(dǎo)?！颈狙芯壳腥朦c】近年來傳感器工藝不斷發(fā)展，其在農(nóng)業(yè)上也有所運用[10]，借助微針傳感器可以在低損傷的情況下對木質(zhì)部或韌皮部汁液的某些生物特性參數(shù)進(jìn)行測量，以黃瓜木質(zhì)部或韌皮部汁液為檢測對象的低損傷檢測方法成為可能。但是現(xiàn)階段針對黃瓜的代謝組學(xué)研究主要對象多為黃瓜的根部或葉片[11-13]，針對黃瓜木質(zhì)部與韌皮部汁液在非生物脅迫下的代謝變化規(guī)律和生物標(biāo)志物的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用GC-MS技術(shù)對正常與低磷脅迫下黃瓜木質(zhì)部和韌皮部汁液內(nèi)的代謝物進(jìn)行定性定量，分析低磷脅迫下汁液內(nèi)糖類、氨基酸和有機(jī)酸含量的變化，并篩選出潛在生物標(biāo)志物，旨在使用代謝組學(xué)技術(shù)加深對低磷脅迫下黃瓜木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)代謝物組分變化規(guī)律的認(rèn)識，為通過木質(zhì)部或韌皮部汁液進(jìn)行黃瓜磷養(yǎng)分狀態(tài)的診斷提供依據(jù)，為新的黃瓜磷匱乏狀態(tài)檢測方法提供方向，為黃瓜的精細(xì)化種植提供參考。

1 材料與方法

試驗于2020年在江蘇大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備與技術(shù)教育部重點試驗室玻璃溫室進(jìn)行。

1.1 試驗材料與儀器

試驗材料：黃瓜品種為‘津研四號’，種植期間溫室溫度范圍為18—35℃，光照采用自然光照，種植期間標(biāo)準(zhǔn)光照下平均日照時間為5.13 h，平均日輻照量13.2 MJ?m-2。

試驗儀器與設(shè)備：GCMS-QP2010氣相色譜質(zhì)譜分析儀（日本島津公司）；HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國安捷倫公司）；超聲洗浴儀（上?？茖?dǎo)公司）；臺式高速冷凍離心機(jī)（Neofuge 18R，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；FreeZone12Plus冷凍干燥機(jī)（北京中科科爾儀器有限公司）；DH-101-2BY電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津中環(huán)電爐股份有限公司）。

1.2 樣本培育

采用鎮(zhèn)江培蕾基質(zhì)科技發(fā)展有限公司的植物培養(yǎng)基進(jìn)行育苗，待黃瓜苗生長到3片真葉時進(jìn)行移栽工作，移栽后采用無土栽培方式進(jìn)行樣本培育，基質(zhì)為2—4 mm珍珠巖，使用霍格蘭配方營養(yǎng)液進(jìn)行澆灌，營養(yǎng)液的組成成分：A溶液（Ca(NO3)2·4H2O 945 mg?L-1、KNO379 mg?L-1、NH4NO340 mg?L-1、Fe-EDTA (13.1%) 7 mg?L-1）；B溶液（KNO3604 mg?L-1、KH2PO4170 mg?L-1、MgSO4·7H2O 339 mg?L-1、MnSO4?4H2O 1.7 mg?L-1、ZnSO4·7H2O 1.45 mg?L-1、Na2B4O7·10H2O 2.45 mg?L-1、CuSO4·5H2O 0.19 mg?L-1、Na2MoO4·2H2O 0.12 mg?L-1），將A、B兩溶液等量混合進(jìn)行澆灌，營養(yǎng)液的補(bǔ)充時間為每天早上7:00—8:00?？傸S瓜培育數(shù)為60株，當(dāng)黃瓜生長到七葉一心時，選取長勢基本一致的12株黃瓜幼苗（株高、莖粗上下偏差在20%以內(nèi)），并將其分為試驗組（6株）與對照組（6株）。對試驗組進(jìn)行低磷脅迫處理，缺磷處理下黃瓜試驗組的營養(yǎng)液中磷含量為正常水平的25%，實施方式是將B溶液中的KH2PO4降低至42.5mg?L-1，并使用63.75mg?L-1的K2SO4保證K+濃度正常，對照組不做任何處理，按照原營養(yǎng)液配方進(jìn)行培育。

1.3 黃瓜木質(zhì)部與韌皮部汁液取樣

每周對黃瓜植株的株高和離地3 cm處的莖粗進(jìn)行測量，確定黃瓜植株每周的株高和莖粗增長量，測量結(jié)果見表1，可以看出在低磷脅迫的第一周，植株株高和莖粗的增長就已有所放緩，但是并沒有顯著性差異。在第二周內(nèi)，植株的株高和莖粗增長量均與正常處理植株有顯著區(qū)別，證實了兩周的低磷脅迫會導(dǎo)致黃瓜植株的性狀與正常狀態(tài)產(chǎn)生差異[14]，表明黃瓜的生理代謝已經(jīng)產(chǎn)生了明顯變化，此時的檢測結(jié)果更為可靠，更能反映黃瓜木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)代謝物在低磷脅迫下的含量變化規(guī)律，因此，本研究在低磷脅迫的14 d后進(jìn)行取樣。取樣時，將植株莖稈切斷，從近地段切口取得汁液為木質(zhì)部汁液[15]；從另一端切口取得的為韌皮部汁液[16]。

表1 不同磷處理下黃瓜植株的表型參數(shù)每周變化量

同列不同小寫字母表示差異顯著（<0.05）Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (<0.05)

使用消毒后的鋒利刀片，在離地3—5 cm處切斷黃瓜莖稈，使用去離子水清洗兩端創(chuàng)傷面，再使用消毒后的脫脂棉吸干水分，棄去第一滴后開始分別從兩端切口收集木質(zhì)部與韌皮部汁液。收集到的汁液放于樣本管中，置于液氮暫存。每株黃瓜取得木質(zhì)部汁液樣本與韌皮部汁液樣本各1個，取樣量為100—300 μL，共取得樣本24個（表2）。

1.4 樣本三甲基化衍生化處理

每例樣本30 μL，加入170 μL去離子水，800 μL甲醇乙腈（1﹕1，v/v），53 KHz冰浴超聲1 h， -20℃孵育1 h沉淀蛋白，14 000×4℃離心20 min，取上清液400 μL，加入60 μL核糖醇（0.2 mg?mL-1）作為內(nèi)參代謝物，渦旋10 s，然后進(jìn)行真空冷凍干燥，得到干燥提取物；往干燥后的樣本中加入80 μL的15 mg?mL-1甲氧胺吡啶溶液復(fù)溶，渦旋振蕩30 s。使用恒溫箱37℃反應(yīng)90 min然后快速加入80 μL的BSTFA試劑（含1% TMCS）；使用恒溫箱70℃反應(yīng)60 min，取出后等待測定。

表2 黃瓜分組表

組別名中，第一個英文字母“P”代表試驗方法為磷脅迫，中間的數(shù)字“25”“100”分別代表磷含量為25%與100%，最后的字母“X”與“P”分別為木質(zhì)部和韌皮部的英文首字母（Xylem，Phloem）。下同

n the group aliases, the first English letter “P” represents that the test method is phosphorus stress, the numbers “25” and “100” in the middle represent the phosphorus content of 25% and 100%, respectively, and the last letters “X” and “P” are the English initials of xylem and phloem, respectively.The same as below

1.5 GC-MS分析

使用島津GCMS-QP2010氣相色譜質(zhì)譜分析儀對前處理后的樣本進(jìn)行檢測。

色譜條件：進(jìn)樣量：1 μL；載氣：氦氣；前進(jìn)樣口吹掃流速：3 mL·min-1；流速：1 mL·min-1；柱溫：初始溫度90℃保持15 s，以10℃·min-1升至180℃，再以5℃·min-1升至240℃，再以20℃·min-1繼續(xù)升至285℃保持11.5 min。

質(zhì)譜條件：前進(jìn)樣口溫度：280℃；傳輸線溫度：245℃；離子源溫度：220℃；電離電壓：-70 eV；掃描方式：20—600 m/z（全掃描）；掃描速度：100 spectra/s；溶劑延遲：480 s。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

1.6.1 代謝物的定性定量 使用島津儀器的GCMS Real Time Analysis軟件，結(jié)合NIST數(shù)據(jù)庫確定檢出代謝物名稱，根據(jù)核糖醇內(nèi)標(biāo)物的濃度，使用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化法確定每種代謝物的濃度。

1.6.2 代謝物的PCA分析 PCA是多元統(tǒng)計分析中最常見的無監(jiān)督模式的數(shù)據(jù)分析方法，能將大量相關(guān)變量通過線性變換轉(zhuǎn)化為一組最能代表數(shù)據(jù)特征的不相關(guān)的變量，展示數(shù)據(jù)組內(nèi)的重復(fù)性和組間的差異性，評估數(shù)據(jù)的可重復(fù)性，發(fā)現(xiàn)異常值，提高數(shù)據(jù)精準(zhǔn)度[17]。本研究使用PCA判斷低磷脅迫下黃瓜木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)代謝物含量是否發(fā)生了明顯變化。

1.6.3 糖、氨基酸和有機(jī)酸含量分析 糖、氨基酸和有機(jī)酸都是植物正常生長發(fā)育必不可缺的營養(yǎng)成分，糖為植物的生長發(fā)育儲備和提供能量[18]；氨基酸參與植物體內(nèi)各種生理代謝活動，增強(qiáng)植株抗逆性[19]；有機(jī)酸同樣涉及到抗逆性等生理代謝反應(yīng)[20]。為了解植株在磷匱乏時的生理反應(yīng)，將黃瓜木質(zhì)部與韌皮部汁液在正常與低磷脅迫下的糖、氨基酸和有機(jī)酸的含量進(jìn)行對比，分析是否有顯著性差異。

1.6.4 潛在生物標(biāo)志物篩選 使用正交偏最小二乘法（OPLS-DA）和獨立樣本t檢測對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并篩選潛在生物標(biāo)志物。OPLS-DA能選擇區(qū)分各組的特征變量，確定樣本間的關(guān)系，建立代謝物表達(dá)量與分組關(guān)系之間的模型，獲取組間差異信息，預(yù)測樣品分組[21]。獨立樣本t檢測用于分析定性數(shù)據(jù)與定量數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，可檢驗數(shù)據(jù)間的差異[22]。將OPLS-DA與獨立樣本T檢測相結(jié)合，是常見的生物標(biāo)志物篩選方式[23]。

2 結(jié)果

2.1 木質(zhì)部與韌皮部汁液的主成分分析

圖1分別為使用SIMCA-P軟件（14.1版，瑞典）得到的低磷脅迫與正常處理黃瓜木質(zhì)部汁液和韌皮部汁液內(nèi)代謝物的PCA得分圖，圖1-A是木質(zhì)部汁液的PCA分析，此時第一和第二主成分的解釋率分別為33.0%和19.7%；圖1-B是韌皮部汁液的PCA分析，第一和第二主成分的解釋率分別為37.0%和17.2%。根據(jù)樣本在PCA得分圖上的分布來看，木質(zhì)部和韌皮部汁液中的低磷組和正常磷組被明顯區(qū)分，說明磷脅迫下，黃瓜木質(zhì)部汁液和韌皮部汁液內(nèi)各種代謝物的含量變化明顯。

2.2 磷脅迫對黃瓜木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)糖、氨基酸和有機(jī)酸含量的影響

2.2.1 對糖組分含量的影響 圖2為低磷脅迫下木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)糖分的變化。其中，木質(zhì)部汁液內(nèi)檢出蔗糖、果糖、葡萄糖、山梨醇共4種糖類；韌皮部汁液中，除了同樣能檢出木質(zhì)部中的4種糖類外，還檢出海藻糖。在韌皮部汁液中，糖組分的含量普遍高于木質(zhì)部汁液，這符合木質(zhì)部與韌皮部汁液分別運輸根系合成物與葉片合成物的功能特性。低磷脅迫下，木質(zhì)部汁液內(nèi)的各種糖類均高于正常磷供應(yīng)情況，平均提升15%以上，但在統(tǒng)計學(xué)上，木質(zhì)部汁液內(nèi)的各種糖類含量均未發(fā)生顯著變化。低磷脅迫下韌皮部汁液中不同糖組分的變化趨勢則略有不同，其中蔗糖、海藻糖和山梨醇的含量顯著降低（< 0.05），分別是正常水平的72.3%、52.1%和50.6%，葡萄糖和果糖的含量雖然有所升高，但未達(dá)到顯著性差異水平。

圖1 木質(zhì)部（A）與韌皮部（B）汁液的PCA得分圖

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。下同Different lowercase letters mean significant difference (P<0.05).The same as below

2.2.2 對氨基酸含量的影響 木質(zhì)部汁液中主要檢出谷氨酸、甘氨酸等9種氨基酸，韌皮部共檢出14種氨基酸，比木質(zhì)部汁液多檢出鳥氨酸、脯氨酸等（圖3）。低磷脅迫的木質(zhì)部汁液中，纈氨酸的含量顯著低于正常水平（<0.05），僅為正常狀態(tài)的43.5%；而半胱氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、賴氨酸則顯著高于正常狀態(tài)（<0.05），分別是正常水平的165.3%、146.4%、200.5%、122.6%和137.4%。低磷處理下韌皮部汁液檢出的氨基酸中，僅鳥氨酸的含量顯著高于正常水平（<0.05），而蘇氨酸、甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、谷氨酸和瓜氨酸均顯著低于正常狀態(tài)（<0.05），分別是正常水平的83.0%、80.7%、59.3%、61.8%、83.1%、79.0%、59.0%和73.9%。

圖3 低磷脅迫下木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)氨基酸含量的變化

2.2.3 對常見有機(jī)酸含量的影響 木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)的有機(jī)酸種類有一定差別（圖4）。低磷脅迫下的木質(zhì)部汁液中，蘋果酸的含量顯著低于正常水平（<0.05），僅為正常狀態(tài)的38.2%，而乳酸、軟脂酸、油酸、肉豆蔻酸、四氨基丁酸、蘇糖酸的含量則顯著高于正常水平（<0.05），分別為正常水平的128.8%、108.0%、143.5%、111.8%、159.3%和172.5%。低磷脅迫的韌皮部汁液中，草酸、琥珀酸、亞油酸、肉豆蔻酸、四氨基丁酸、蘇糖酸和丙二酸的含量與正常水平相比有顯著降低（<0.05），分別為正常水平的79.4%、72.1%、55.2%、87.3%、64.3%、67.3%和57.8%，未發(fā)現(xiàn)顯著高于正常水平的有機(jī)酸。

2.3 木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)代謝物的潛在生物標(biāo)志物篩選

2.3.1 汁液內(nèi)代謝物的OPLS-DA分析 對木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)代謝物進(jìn)行OPLS-DA分析，得到OPLS- DA得分圖（圖5-A、B）。在OPLS-DA中，R2Y和Q2為模型的評價指標(biāo)，R2Y和Q2均大于0.5，說明模型效果較好。對于木質(zhì)部汁液，R2Y=0.992，Q2= 83.2%；對于韌皮部汁液，R2Y=1，Q2=97.8%，說明OPLS-DA得到的模型良好。

圖4 低磷脅迫下木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)有機(jī)酸含量的變化

使用OPLS-DA模型生成木質(zhì)部與韌皮部汁液代謝物的S-plot圖（圖5-C、D）。S-plot圖能同時體現(xiàn)每個變量與模型某一成分之間的協(xié)變性和相關(guān)性，它們分別代表變量對模型的貢獻(xiàn)大小和變量的權(quán)重系數(shù)，可以用于篩選有意義的變量。S-plot圖中S型曲線上的每一個點代表一個代謝物，點與原點的距離越大，對分類的貢獻(xiàn)就越大，越靠近左下角和右上角的代謝物對樣品的分類貢獻(xiàn)越大，可以用變量權(quán)重重要性排序值（VIP）評價變量的貢獻(xiàn)大小，VIP>1即認(rèn)為此代謝物有較大貢獻(xiàn)。

為了防止模型過度擬合，使用200次置換檢驗驗證模型（圖5-E、F），置換檢驗要求Q2的回歸截距小于0.05，圖中木質(zhì)部汁液中Q2的回歸截距為-0.77，韌皮部汁液中為-1.16，均低于0.05，說明兩個模型均可靠，不存在過擬合情況。

2.3.2 木質(zhì)部與韌皮部汁液的獨立樣本t檢測和潛在生物標(biāo)志物篩選 結(jié)合OPLS-DA的VIP值與獨立樣本t檢測的值，按照VIP>1且<0.05的要求篩選磷脅迫下木質(zhì)部與韌皮部汁液的代謝物，最終分別篩選出8種和7種代謝物。木質(zhì)部汁液篩選出的8種代謝物（VIP>1，<0.05）分別為尸胺、蘋果酸、四氨基丁酸、軟脂酸、肌醇、纖維二糖、N, N-二甲基十二酰胺與單硬脂酸甘油酯（圖6）。韌皮部汁液篩選出的7種代謝物（VIP>1，<0.05）分別為絲氨酸、亞油酸、10, 13-環(huán)氧-11-甲基十八碳-10, 12-二烯酸、脫氫樅酸、N, N-二甲基十二酰胺、2, 2'-亞甲基雙（6-叔丁基-4-甲基苯酚）、L-2-哌啶酸（圖7）。這些符合條件的代謝物均在低磷與正常處理兩組樣本的分離中發(fā)揮了重要作用，被認(rèn)為是低磷脅迫下黃瓜木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)的潛在生物標(biāo)志物。

圖5 木質(zhì)部與韌皮部汁液的OPLS-DA得分圖（木質(zhì)部A、韌皮部B），S-plot圖（木質(zhì)部C、韌皮部D），200次置換檢驗結(jié)果（木質(zhì)部E、韌皮部F）

3 討論

3.1 磷脅迫影響黃瓜中糖、氨基酸和有機(jī)酸代謝

黃瓜在低磷情況下會對代謝進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以保證黃瓜正常生長。根據(jù)低磷脅迫下黃瓜木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)糖分變化，可以看出低磷脅迫阻礙了植株地上組織內(nèi)蔗糖、海藻糖和山梨醇的合成，導(dǎo)致向根部供應(yīng)的養(yǎng)分大量減少。根據(jù)低磷脅迫下黃瓜木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)氨基酸的變化，可以看出黃瓜韌皮部汁液中多種氨基酸的含量均減小，說明低磷脅迫同樣抑制植株地上組織的氨基酸合成。與此同時，植株根系增加了多種氨基酸的合成以抵抗外界脅迫對正常生長代謝的干擾，并對地上部分氨基酸合成量的減少進(jìn)行補(bǔ)償，比如大量生產(chǎn)谷氨酸以增加對磷的吸收效率，大量生產(chǎn)蘇氨酸增加對不利條件的耐受性。根據(jù)低磷脅迫下黃瓜木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)有機(jī)酸的變化，可以看出低磷脅迫影響各種有機(jī)酸的合成，特別是四氨基丁酸、蘇糖酸、肉豆蔻酸，它們在低磷脅迫下的木質(zhì)部和韌皮部汁液中的含量均與正常水平有顯著性差異，但是變化趨勢并不相同，這可能與植株不同部位應(yīng)對磷脅迫時的反應(yīng)機(jī)理不同有關(guān)。

圖6 木質(zhì)部汁液潛在生物標(biāo)志物的箱型圖

Fig.6 Boxplots of potential biomarkers of xylem sap

圖7 韌皮部汁液潛在生物標(biāo)志物的箱型圖

Fig.7 Boxplots of potential biomarkers of phloem sap

3.2 生物標(biāo)志物可用于估測黃瓜磷營養(yǎng)供應(yīng)

低磷脅迫下，植株會調(diào)節(jié)糖、氨基酸和有機(jī)酸的代謝，以減小磷供應(yīng)不足造成的不利影響，維持植株的正常生理代謝[24-25]。且這種變化會先于植株外部特征的變化，因此檢測植株的代謝物變化能夠較早反映植株的養(yǎng)分狀態(tài)。但相較于對所有代謝物進(jìn)行檢測，僅檢測生物標(biāo)志物即可反映植株的磷養(yǎng)分狀態(tài)，且檢測流程更短，檢測效率更高。如Gao等[26]通過比較低氮、低磷脅迫下萵苣葉片各種代謝產(chǎn)物的含量變化并篩選出代謝物標(biāo)志物，為萵苣早期營養(yǎng)脅迫的診斷提供依據(jù)。但針對植物木質(zhì)部或韌皮部汁液進(jìn)行代謝組學(xué)分析的案例較少。

本研究在低磷脅迫下的木質(zhì)部汁液中發(fā)現(xiàn)了8種具有明顯差異的代謝物，在韌皮部汁液中發(fā)現(xiàn)了7種具有明顯差異的代謝物，這些潛在生物標(biāo)志物能在一定程度上反映出黃瓜的磷素代謝狀況。在木質(zhì)部汁液中，參與眾多代謝途徑的關(guān)鍵代謝物蘋果酸的含量大幅下降，說明低磷脅迫影響了植物體內(nèi)的正常生長代謝，限制了植物生長發(fā)育；能增強(qiáng)植物抗逆性的尸胺與四氨基丁酸的含量顯著上升，說明植株正加強(qiáng)自身抗逆性以適應(yīng)低磷脅迫；作為重要生長因子的軟脂酸和肌醇的含量顯著上升，說明植株增加了生長因子的產(chǎn)出以維持生長發(fā)育。在韌皮部汁液中，增強(qiáng)植物抗逆性的L-2-哌啶酸顯著增加[27]，也是植株抗逆性增強(qiáng)的體現(xiàn)；參與植株代謝的絲氨酸和亞油酸顯著降低，顯示出低磷脅迫對于植株生理代謝反應(yīng)的抑制；誘導(dǎo)植株系統(tǒng)性獲得抗性的脫氫樅酸顯著降低[28]，說明低磷脅迫下的植株對外界病菌局部侵染的抵抗力顯著下降。

同時，與正常磷供應(yīng)狀態(tài)相比，低磷脅迫下木質(zhì)部汁液的8種潛在生物標(biāo)志物中有7種高于正常水平，而韌皮部汁液中的7種生物標(biāo)志物含量則有6種低于正常水平，結(jié)合磷脅迫對木質(zhì)部與韌皮部汁液內(nèi)糖、氨基酸和無機(jī)酸含量的不同影響，發(fā)現(xiàn)在同樣的低磷脅迫下，黃瓜木質(zhì)部與韌皮部汁液的響應(yīng)機(jī)制有明顯差異，其他植物在同種非生物脅迫下也出現(xiàn)不同部位響應(yīng)機(jī)制有明顯差異的情況[29-30]。

3.3 易于實際檢測的生物標(biāo)志物

目前，對于植物體內(nèi)代謝物的檢測方法有核磁共振（NMR）、GC-MS、LC-MS等，這些檢測方法都需要離體檢測，且檢測設(shè)備體型巨大、成本高昂。相對而言，借助敏感電極進(jìn)行檢測的傳感器雖然精度有所不足，但是更方便、廉價，具有較高的普適性?，F(xiàn)階段有大量用于氨基酸、有機(jī)酸等有機(jī)物檢測的傳感器，也有直接植入植物體內(nèi)、對植物某一生長指標(biāo)進(jìn)行長期檢測的傳感器。因此，相較于色譜、質(zhì)譜等方法，通過體積小、成本低的傳感器檢測黃瓜磷脅迫下的生物標(biāo)志物，檢測成本更低，檢測效率更高。目前，在木質(zhì)部與韌皮部汁液發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物中，蘋果酸、四氨基丁酸、軟脂酸、絲氨酸與亞油酸的傳感器檢測較為完善，相對于其他生物標(biāo)志物，它們的實用性更強(qiáng)。

蘋果酸、四氨基丁酸、軟脂酸為木質(zhì)部汁液中的生物標(biāo)志物。DALAL等[31]基于蘋果酸濃度這一果實成熟的重要指標(biāo)，通過將蘋果酸酶固定在工作電極表面，制備了羧化多壁碳納米管（C-MWCNT）修飾的絲網(wǎng)印刷電化學(xué)傳感器，可用于蘋果酸檢測。SANGUBOTLA等[32]以玉米汁為原料合成碳點（CDs），并用3-氨基苯基硼酸（APBA）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）進(jìn)行功能化，得到了CANs；制備的CANs和酶GABase（四氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶和琥珀酸半醛脫氫酶的混合物）能以較高的靈敏度對四氨基丁酸進(jìn)行檢測。DUVANOVA等[33]用PM聚酰亞胺（1, 2, 4, 5-苯四甲酸二酐和4, 4′-二氨基二苯氧基）修飾電極，制備出可以檢測植物油中軟脂酸濃度的分子印跡聚合物（MIPs）壓電傳感器。

絲氨酸與亞油酸為韌皮部汁液中的生物標(biāo)志物。SINGH基于分子印跡技術(shù)，制備功能化金納米粒子（AuNPs），并用其修飾EQCM金電極，使用4-氨基硫酚作為電聚合組分，使用半胱氨酸單元通過兩性離子和氫鍵間的相互作用為識別氨基酸提供配體，制備出一種能夠檢測絲氨酸的壓電傳感器[34]。LU等[35]同時基于膳食脂肪的疏水性，采用氧化石墨烯和氣味結(jié)合蛋白（OBPs）修飾絲網(wǎng)印刷電極，研制了一種用于脂肪味覺檢測的味覺生物傳感器，能夠用于亞油酸的檢測。

綜上，現(xiàn)階段已經(jīng)有可用于蘋果酸、氨酪酸、軟脂酸、絲氨酸與亞油酸檢測的傳感器。相較于其他生物標(biāo)志物，在通過傳感器確定其在木質(zhì)部或韌皮部汁液中的含量，并根據(jù)生物標(biāo)志物的含量進(jìn)行黃瓜磷匱乏診斷，更易于生產(chǎn)實際應(yīng)用。

4 結(jié)論

低磷脅迫下，植物汁液內(nèi)糖類、四氨基丁酸與有機(jī)酸的含量受到明顯影響，且木質(zhì)部與韌皮部汁液對低磷脅迫的響應(yīng)機(jī)制有很大差異。其中，低磷脅迫下，木質(zhì)部汁液中的糖無顯著變化，氨基酸和有機(jī)酸多呈顯著增加的趨勢，而韌皮部汁液中糖、氨基酸和有機(jī)酸則以顯著降低為主。同時，在黃瓜韌皮部汁液中篩選出蘋果酸、四氨基丁酸等8種潛在生物標(biāo)志物，在韌皮部汁液中篩選出L-2-哌啶酸、絲氨酸等7種潛在生物標(biāo)志物，這些潛在生物標(biāo)志物可用于黃瓜磷養(yǎng)分供應(yīng)狀況的評估，為植物的養(yǎng)分檢測以及磷肥的精準(zhǔn)供應(yīng)提供指導(dǎo)。

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LI QingLin*, ZHANG WenTao, XU Hui, SUN JingJing

College of Agricultural Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu

【Background】 Xylem sap is responsible for the transport of water and nutrients for the aerial part, while phloem sap is mainly responsible for the transport of photosynthetic products.When plants are subjected to abiotic stress, the sap of xylem and phloem undergoes different changes.【Objective】 The aim of this study was to investigate the content changes of various metabolites in cucumber xylem and phloem sap under low phosphorus stress, and to explore the metabolic changes of cucumber under low phosphorus stress, so as to provide new ideas and basis for the diagnosis of cucumber phosphorus deficiency.【Method】 The xylem and phloem sap were collected from cucumber plants under normal phosphorus level (1.25 mmol?L-1) and low phosphorus stress (0.3125 mmol?L-1).These sap samples were analyzed qualitatively and quantitatively by GC-MS after trimethylsilyl derivatization.【Result】In xylem sap under low phosphorus stress, there was no significant change in carbohydrates, and the content of most amino acids increased significantly.Among organic acids, the malic acid showed a significant downward trend, while others, such as palmitic acid and oleic acid, were significantly higher than the normal levels.In phloem sap under low phosphorus stress, most carbohydrates and amino acids were lower than the normal level, and the contents of organic acids, such as oxalic acid and succinic acid, were also significantly reduced.Further, in order to screen potential biomarkers in cucumber xylem and phloem sap, the detection data were further analyzed by OPLS-DA and Student's t test.Eight potential biomarkers (VIP>1,<0.05) under low phosphorus stress were detected in cucumber xylem sap, which were cadaverine, malic acid, 4-aminobutyric acid, palmitic acid, myo-inositol, cellobiose acid, N, N-dimethyldodecamide, and glycerol monostearate.Seven potential biomarkers (VIP>1,<0.05) under low phosphorus stress were detected in cucumber phloem sap, which were serine, linoleic acid, 9-(3-methyl-5-pentylfuran-2-yl) nonanoic acid, dehydroabietic acid, N, N-dimethyldodecamide, 2, 2'-methylenebis (6-tert-butyl-4-methylphenol), and L-2-piperic acid.【Conclusion】 Under low phosphorus stress, the carbohydrates, amino acids and organic acids in the xylem and phloem sap of cucumber changed, but the change trends were not the same.Eight and seven biomarkers were screened from xylem and phloem sap, which could provide new ideas and basis for the diagnosis of cucumber phosphorus deficiency.Among the biomarkers, the detection methods of malic acid, 4-aminobutyric acid, palmitic acid, serine and linoleic acid have been relatively mature, and the cucumber phosphorus deficiency diagnosis method based on them was more practical.

cucumber; xylem; phloem; phosphorus stress; metabolomics; biomarkers

2021-08-13；

2021-10-13

國家自然科學(xué)基金（62101217）、江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)裝備學(xué)部項目（NZXB20200203）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20190858）、中國博士后基金（2019M661754）

通信作者李青林，E-mail：776767151@qq.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）