范沁榕，楊 笑，胡仁靜，2

(1. 南通大學(xué)附屬無錫市第二人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 無錫 214002； 2. 青海省海東市平安區(qū)中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，青海 海東 810699)

高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae, HvKP)是肺炎克雷伯菌的高毒力變種，可引起肺炎合并肝膿腫、腦膜炎和眼內(nèi)炎，具有強侵襲性和預(yù)后差等特點[1]。HvKP在世界范圍內(nèi)感染率呈持續(xù)上升趨勢，及時高效地將臨床分離的HvKP與經(jīng)典低毒肺炎克雷伯菌(classicalKlebsiellapneumoniae, cKp)進行鑒別診斷顯得尤為重要，早期鑒別可降低HvKP造成的致殘率及病死率，為臨床感染控制和流行病學(xué)調(diào)研提供細菌學(xué)證據(jù)[2]。目前毒力篩查比較公認的金標準是小鼠毒力模型[3]，基層實驗室很難進行檢測。大蠟螟毒力模型因其可操作性強，準確性高，近年來得到廣泛應(yīng)用?？焖俣玖驒z測因時間短、可操作性強，臨床應(yīng)用越來越廣泛，目前比較常用的毒力基因有prmpA、prmpA2、iucA、iroN、fimH等[4]。PEG-344位于質(zhì)粒上，編碼內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白，其產(chǎn)物是代謝物轉(zhuǎn)運子超家族中的一種滲透酶。Bulger等[5]對菌株hvKP1(GenBank no. AOIZ00000000)通過體外腹腔積液、LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，小鼠感染模型等試驗發(fā)現(xiàn)，PEG-344是hvKP1造成小鼠肺部感染時不可或缺的毒力因素。2017年后逐漸出現(xiàn)有關(guān)該標志物的報道，但是在血流感染標本鑒別方面研究較少。本研究評估PEG-344對無錫地區(qū)血流感染中肺炎克雷伯菌毒力預(yù)測的價值。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集2020年1月—2021年12月南通大學(xué)附屬無錫市第二人民醫(yī)院血流感染患者血標本中分離的肺炎克雷伯菌，采用法國梅里埃全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(VITEK MS)進行鑒定。

1.2 黏液絲試驗 用接種環(huán)輕柔蘸取哥倫比亞血瓊脂平板上的單克隆菌落，若黏液絲長度>5 mm時，判定為黏液絲試驗陽性。

1.3 大蠟螟毒力檢測試驗[6]采用大蠟螟毒力試驗結(jié)果作為金標準進行分組，將菌株分為高毒力組和經(jīng)典組。本試驗選取重約250 mg的大蠟螟幼蟲，幼蟲購自天津惠裕德生物科技公司，試驗前剔除活動力欠佳或有灰黑色斑點的蟲體。倍比稀釋配制菌液，設(shè)菌液濃度從高到底分別為107、106、105......102CFU/mL的6個試驗組，第7組為注射磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組，第8組設(shè)置為空白對照組(對蟲體不做任何處理)。使用20.0 μL微量注射器從幼蟲右側(cè)的第一腹節(jié)進行注射，將大蠟螟放置37℃培養(yǎng)箱中進行孵育，每24 h觀察幼蟲存活量并記錄，觀察至144 h，繪制生存曲線，計算144 h的lgLD80，同一濃度需重復(fù)3次。試驗結(jié)束后大蠟螟做滅菌無害化處理。

1.4 wzi基因測序進行莢膜血清型檢測[7]采用水煮法提取菌株DNA，PCR反應(yīng)采用25 μL體系，包括上下游引物各1.0 μL，mix 12.5 μL，無taq酶水8.5 μL，DNA模板2 μL。擴增產(chǎn)物進行測序，比對獲得wzi對應(yīng)的型。

1.5 毒力標志物的檢測 本研究選用位于毒力質(zhì)粒上的五種毒力基因prmpA(莢膜黏液表型調(diào)節(jié)基因)、prmpA2(莢膜黏液表型調(diào)節(jié)基因)、PEG-344 (內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因) 、PEG-1631(保守假定蛋白)、PEG-589(氨基葡萄糖內(nèi)酯脫碳酶家族調(diào)節(jié)基因)，具體引物序列見表1。

表1 毒力標志物的引物序列表

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad 6.0軟件進行數(shù)據(jù)的處理與分析，并繪制生存曲線圖。應(yīng)用SPSS 22.0進行144 h LD80和lgLD80計算，采用Shapiro-Wilk檢驗對lgLD80進行正態(tài)分布的檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用M(P25，P75)方式表示，采用Kruskal-WallisH檢驗進行多組間比較，Mann-WhitneyU檢驗進行兩組間比較。采用卡方檢驗進行診斷指標分析，具體包括：特異度、靈敏度、優(yōu)勢比等；若四格表中出現(xiàn)0，計算優(yōu)勢比的時候?qū)⒚扛褡拥念l數(shù)增加0.5。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株來源 共收集血流感染患者血標本分離的肺炎克雷伯菌36株。科室分布：肝膽外科6株，重癥監(jiān)護科8株，腎內(nèi)科6株，血液科6株，呼吸科4株，其他科室共6株。

2.2 wzi莢膜血清型結(jié)果 通過wzi 測序，并將wzi型與K/KL型進行匹配。36株菌血清型檢出情況如下：wzi-1-K1型占16.67%(6株)，wzi-57-K57型占11.11%(4株)，wzi-64-KL64型占8.33%(3株)，wzi-2-K2/30型占5.56% (2株)，wzi-50型占5.56%(2株)；其他型包括：wzi(4、5、16、18、20、60、63、72、81、100、101、115、130、170、173、187、322、325、350)各1株。目前公認的高毒力血清型wzi-1-K1、wzi-57-K57、wzi-4-K2、wzi-2-K2/30、wzi-5-K5、wzi-20-K20、wzi-16-K16均有檢出，總檢出率為44.44%。見表2。

表2 36株菌株wzi等位基因和對應(yīng)K/KL型分布

2.3 大蠟螟毒力試驗結(jié)果 觀察大蠟螟144 h的生存率，繪制幼蟲的生存曲線，計算LD80和lgLD80。大蠟螟毒力試驗顯示在濃度為102～107CFU/mL時，不同的菌株對大蠟螟幼蟲的致死率呈現(xiàn)濃度依賴性。根據(jù)菌株LD80并結(jié)合血清型判別菌株毒力，LD80<106CFU/mL為高毒力組，LD80≥106CFU/mL為經(jīng)典組。高毒力組包含16株菌，15株為常見高毒力血清型(wzi-1、wzi-57、wzi-4、wzi-2、wzi-5、wzi-20、wzi-16)的LD80為102～105CFU/mL；1株wxwh02(wzi-64)的LD80為103～104CFU/mL，該菌分離自侵襲性眼內(nèi)炎合并敗血癥患者，毒力顯著高于其他2株同型菌。20株經(jīng)典組非高毒力血清型的LD80為106～107CFU/mL；其中wxwh 30(wzi-2)的LD80為106～107CFU/mL。Shapiro-Wilk檢驗顯示高毒力組和經(jīng)典組lgLD80為非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，W值分別為0.879、0.633，P<0.05；采用非參數(shù)檢驗進行多組和兩組之間的比較，高毒力組lgLD80低于經(jīng)典組(Z=-0.914，P<0.01)；根據(jù)wzi血清型，采用Kruskal-Wallis檢驗進行多組之間比較，各組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=91.08，P<0.01)。見表3。部分菌株生存曲線見圖1，包括高毒力組wxwh01(wzi-1)、wxwh08(wzi-2)、wxwh11(wzi-5)、wxwh15(wzi-20)、wxwh18(wzi-57)、wxwh02(wzi-64)；經(jīng)典組：wxwh25(wzi-50)、wxwh35(wzi-64)。

表3 兩組wzi血清型144 h LD80和lgLD80的結(jié)果

2.4 黏液絲試驗結(jié)果評價 36株菌株中高毒力組的菌株黏液絲試驗陽性率為87.50%(14/16)，經(jīng)典組有3株菌落非常黏稠，用接種環(huán)極不容易挑起，黏液絲試驗雖然為陽性但是不能判定為高毒力菌株，經(jīng)典組陽性率為15.00%(3/20)。

2.5 毒力基因檢測結(jié)果 基于臨床診斷及大蠟螟毒力試驗進行分組，分別檢測prmpA、prmpA2、PEG-344 、PEG-1631、PEG-589毒力基因的PCR結(jié)果，同時結(jié)合黏液絲試驗對鑒別能力進行綜合評價。結(jié)果顯示：毒力基因中，PEG-344檢測的靈敏度、特異度優(yōu)勢比最高，除wzi-2(wxwh30)假陽性以外，其余結(jié)果與毒力試驗完全一致，PEG-1631、PEG-589檢測效能略低于PEG-344。目前應(yīng)用最多的prmpA、prmpA2在5個檢測指標中的檢測效能最低。黏液絲試驗的檢測效能低，尤其是對于經(jīng)典組的菌株，易造成假陽性。見表4。

表4 各類生物指標鑒別毒力的效能

3 討論

近年來，耐碳青霉烯類高毒力肺炎克雷伯菌(CR-HvKP)引起的感染不斷增多，我國出現(xiàn)的CR-HvKP主要由碳青霉烯類耐藥的ST11型肺炎克雷伯菌獲得毒力質(zhì)粒演變而來[8]，高毒力合并高耐藥的CR-HvKP成為新一代的“超級細菌”，給臨床帶來極大的挑戰(zhàn)[9]。精準完成毒力的鑒別對于臨床治療及流行病學(xué)研究極為重要。

本次研究選取2020—2021年從血流感染患者中分離的36株肺炎克雷伯菌，相較于臨床痰和尿標本，血標本中檢出病原體為定植菌的可能性更低；且肺炎克雷伯菌血流感染患者的病死率相對較高。該高毒力生物標志物PEG-344能夠快速篩查出高毒力的肺炎克雷伯菌，靈敏度為100%，特異度為95%，可為臨床及時調(diào)整用藥提供依據(jù)。

本課題組在2018年已完成肺炎克雷伯菌大蠟螟毒力模型的建立[6]，雖然微生物學(xué)者對大蠟螟模型的認可程度不一致，但是目前對基層實驗室而言，小鼠或兔的動物試驗很難開展，大蠟螟的操作相對簡便且成本低。雖然大蠟螟試驗也存在重復(fù)性低、暫無標準化操作流程的缺點，但是該試驗仍為毒力試驗的重要參考模型。本課題組的經(jīng)驗如下：①重復(fù)三次試驗；②對幼蟲蟲體的體重選擇的一致性；③接種者的手法，左手食指和大拇指輕捏蟲體，右手單手接種。

黏液絲試驗用于鑒定HvKP的可靠性存在爭議。本研究中在黏液絲試驗的靈敏度為87.50%，特異度為15.00%，低毒力的經(jīng)典組也存在黏液絲陽性的菌株，易造成假陽性的結(jié)論，從而造成HvKP的過度判讀，尤其是對于呼吸道標本假陽性的判讀，造成HvKP陽性率虛高。文獻[10]表明，無菌體液標本檢測中，肺炎克雷伯菌的黏液絲試驗被提議作為HvKP的一種篩查方法。

本研究選擇5種毒力標志物進行毒力鑒定效能的評判，PEG-344的檢測效能最高，其次是PEG1631、PEG589、prmpA、prmpA2。PEG-344是位于質(zhì)粒上的編碼內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白，對菌株hvKP1小鼠感染模型等試驗發(fā)現(xiàn)，PEG-344與hvKP1造成小鼠肺部感染相關(guān)，但是與皮下感染無關(guān)。hvKP1的基因登錄號為AOIZ00000000，菌株hvKP1是2013年分離自1例24歲肝脾膿腫的越南男性患者的膿液標本，完成全基因組測序[11]。Hu等[12]發(fā)現(xiàn)65株HvKP PEG-344檢測的靈敏度為96.9%。Liao等[13]發(fā)現(xiàn)PEG-344的診斷靈敏度為99%、特異度為96%，準確性為97%，為檢測效能最高的指標。對PEG-344深入研究發(fā)現(xiàn)PEG-344與基因pagO具有同源性[14]，pagO存在于hvKP1的毒力質(zhì)粒上，已被命名為PEG-1860。PEG-1860(pagO)與PEG-344的相似性為81.6%，同源性為67.3%。PEG-344和PEG-1860都存在于hvKP1毒力質(zhì)粒上，而且這兩個基因似乎都參與了運輸。

prmpA、prmpA2則是位于質(zhì)粒上調(diào)控莢膜多糖表達的毒力基因[2]，prmpA、prmpA2的缺失將降低莢膜的產(chǎn)量和毒力，為目前廣泛應(yīng)用于肺炎克雷伯菌毒力篩查的基因指標。prmpA、prmpA2評價毒力效能相對理想，楊朋等[15]進行HvKP的分子標志物研究發(fā)現(xiàn)，iucA的靈敏度(90.9%)和特異度(97.7%)最高，其次為prmpA2(分別為83.6%、100.0%)。Lee等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在kpn-CG43中，prmpA和prmpA2都促進了莢膜的產(chǎn)生，但kpn-NTUH-K2044 中僅prmpA促進了莢膜的生成。prmpA、prmpA2之間的關(guān)聯(lián)需進一步深入研究。

本次研究發(fā)現(xiàn)高毒力組菌株wxwh02血清型為wzi-64-KL64(K64)，K64是我國耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的主要血清型[17]，wxwh02分離自1例肝膿腫合并眼內(nèi)炎、敗血癥的患者，患者出現(xiàn)侵襲性感染，結(jié)合大蠟螟毒力試驗確認為高毒力菌株，進一步進行黏液絲試驗、prmpA、prmpA2、PEG-344均為陽性，數(shù)據(jù)已發(fā)表[18]。經(jīng)典組中wxwh 30的血清型為wzi-2，是常見的高毒力血清型。wxwh02和wxwh30 的wzi 結(jié)果表明，僅通過莢膜血清分型不足以鑒定HvKP菌株。在耐藥和毒力的質(zhì)粒極容易傳播的現(xiàn)狀下，近年來出現(xiàn)了同時具有多重耐藥和高毒力兩種表型的肺炎克雷伯菌，非高毒力血清型的菌株也漸漸呈現(xiàn)高毒力的表現(xiàn)，因此，不可單憑血清型進行菌株毒力高低的判定，臨床需要引起重視。

耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌與HvKP在2015年之前為兩大獨立的致病模式，2015年之后耐藥的肺炎克雷伯菌ST11-K64獲得毒力質(zhì)粒形成超級細菌[19]。Jia等[20]對中國24所醫(yī)院2018年血流感染患者分離的239株肺炎克雷伯菌進行檢測，22.59%(54株)為HvKP，本研究分離自血流感染患者血標本的肺炎克雷伯菌中44.44%為HvKP，可見本地區(qū)血流感染患者的HvKP占比較高，因此，進行HvKP的感染防控尤為重要。對于臨床分離的肺炎克雷伯菌，尤其是社區(qū)感染、肝膿腫患者、具備遠處播散能力的菌株應(yīng)盡早鑒別毒力、盡早治療、盡早完成環(huán)境的消毒，阻斷質(zhì)粒的傳播路徑，減緩超級細菌蔓延的速度。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。