重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-TFEB-HA的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定

韓納姝，方榮灃，王振江，李薇

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 精神衛(wèi)生學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110）

轉(zhuǎn)錄因子EB（Transcription Factor EB，TFEB）是小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，定位于6號染色體上，全長52 246 bp，編碼蛋白長度為19～159個氨基酸[1]。近年來，TFEB作為影響溶酶體功能、細(xì)胞自噬和細(xì)胞代謝等相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子成為研究熱點(diǎn)[2-3]。研究表明，TFEB是帕金森癥、阿爾茲海默癥等多種神經(jīng)退行性疾病及癌癥的重要轉(zhuǎn)錄因子[4]，在胰腺癌[5]、糖尿病[6]的治療中可能起著重要的調(diào)控功能。隨著研究的不斷深入，TFEB作為頑疾尤其是作為治療腫瘤疾病的一種新的策略靶點(diǎn)得到了越來越多的研究人員的關(guān)注[7]。TFEB與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系已經(jīng)取得了較多的研究成果。許多非整倍體腫瘤細(xì)胞系不顯示溶酶體飽和度，說明腫瘤細(xì)胞具有其他的機(jī)制來增強(qiáng)其降解能力[8]。腎細(xì)胞癌（RCC）是由腎小管上皮產(chǎn)生的異質(zhì)性腫瘤，其中的易位RCC（t-RCC）是由MiTF/TFE家族成員TFE3和低頻率的TFEB有關(guān)的基因融合引起的[9]，對高分期的腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)了包括TFEB在內(nèi)的染色體6p擴(kuò)增這一新的細(xì)胞遺傳學(xué)變化[5-10]。TFEB的表達(dá)與卵巢癌的自噬和侵襲性臨床特征相關(guān)，TFEB表達(dá)的高低是卵巢癌的預(yù)后因子[11]。過表達(dá)TFEBS142A突變體能夠刺激自噬發(fā)生，促進(jìn)腫瘤生長[12]。

本研究擬將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-TFEB-HA轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中并成功表達(dá)，為進(jìn)一步研究TFEB對細(xì)胞生長的影響提供一個新的有力的工具，同時也可以為進(jìn)一步研究從基因水平上治療腫瘤、神經(jīng)精神等疾病提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒、菌種及細(xì)胞

表達(dá)載體pcDNA3.1（+）質(zhì)粒、大腸桿菌（E.coli）Top 10、人子宮頸癌HeLa細(xì)胞，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

Pfu DNA聚合酶、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ及BamHⅠ）、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、蛋白預(yù)染Marker及TurboFect?等，Thermo公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒，上海生工；胰酶、DMEM高糖培養(yǎng)基，Sigma公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；Opti-MEM培養(yǎng)基，Gibco公司；羊抗兔TFEB抗體、羊抗鼠β-actin抗體， Santa公司；680 goat anti-rabbit IgG（H+L）、680 goat anti-mouse IgG（H+L），Invitrogen公司。引物合成和基因測序由北京華大基因公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

TC-3000型PCR基因擴(kuò)增儀，Techne公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一儀器廠；GelDocXR+型全自動DNA凝膠成像儀、Mini Protean 3 Cell型小垂直板電泳槽、1703940型半干轉(zhuǎn)膜儀、轉(zhuǎn)印槽，Bio-Rad公司；XDS-200型倒置顯微鏡，上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；BB15型細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo有限公司；CLX型Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)，LiCOR公司。

1.3 方法

1.3.1 設(shè)計(jì)引物

參考NCBI公布的人TFEB基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，兩端分別加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，下游引物連接HA標(biāo)簽。引物序列上游為5’-GGAATTCATGGCGTCACGCATAGGGTTGC-3'，下游為5'-CGGGATCCTTAAGCGTAATCTGGAACATC GTATGGGTACAGCACATCGCCCTCCTCCATGC-3'。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

以HeLa細(xì)胞基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：10× Pfu Buffer （含MgSO4) 10μL、dNTP Mix（10 mmol/L）2 μL、上下游引物（10 μmol/L）各2 μL、模板1 μL、Pfu DNA聚合酶（2.5 U/μL）1 μL、ddH2O 82 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 3 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收純化DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3.3 pcDNA3.1（+）-TFEB-HA表達(dá)載體的構(gòu)建

將純化后的目的基因片段與pcDNA3.1（+）載體分別用EcoRⅠ及BamHⅠ雙酶切后純化回收，T4DNA連接酶于16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTop 10感受態(tài)細(xì)胞，在含有200 μg/mL氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min，培養(yǎng)12～16 h。提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR驗(yàn)證、雙酶切驗(yàn)證及測序鑒定。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)

用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，定期換液傳代。

1.3.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

用 Turbofect? 將 pcDNA3.1（+）-TFEB-HA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞融合度達(dá)60%～70%的HeLa細(xì)胞中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h左右，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.6 Western Blot檢測

Western Blot檢測轉(zhuǎn)染及對照HeLa細(xì)胞TFEB蛋白表達(dá)水平，結(jié)果利用ODYSSEY紅外成像檢測。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

構(gòu)建了4個重組質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）-TFEB-HA，雙酶切（EcoRⅠ/BamHⅠ）此4個重組質(zhì)粒，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。重組質(zhì)粒1的雙酶切產(chǎn)物在約1 500 bp處有一特異性條帶，大小與TFEB基因相符，另一條帶的大小與pcDNA3.1（+）載體大小相符，2、3、4中無TFEB基因條帶。說明重組質(zhì)粒1構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）-TFEB-HA的雙酶切驗(yàn)證

將PCR驗(yàn)證和雙酶切驗(yàn)證均正確的重組質(zhì)粒1進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明融合基因無堿基突變和缺失，載體上插入的TFEB cDNA序列方向、位置及大小均正確，進(jìn)一步證明pcDNA3.1（+）-TFEB-HA重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 Western Blot檢測結(jié)果

按照方法1.3.5進(jìn)行轉(zhuǎn)染并用Western Blot檢測，如圖2所示，轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒細(xì)胞的蛋白量（TFEBHA）明顯多于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（Control），表明目的基因轉(zhuǎn)染成功。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如圖3顯示，TFEB-HA組的TFEB蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組。

圖2 Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后TFEB-HA蛋白表達(dá)

圖3 TFEB-HA蛋白表達(dá)水平

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建的質(zhì)粒能夠正確表達(dá)TFEB，構(gòu)建的載體可行性好、不破壞細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)，易于觀察，方便定量表達(dá)外源蛋白，為進(jìn)一步研究TFEB在腫瘤發(fā)生機(jī)制中的作用提供了一個新的工具，為從基因水平上治療腫瘤提供了一定的理論依據(jù)。