程思，羅園，羅莎杰，代建剛，李美鳳，饒朝龍，陳艷*

1(成都中醫(yī)藥大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，四川 成都，611130)2(成都中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川 成都，611130)

藤椒，學(xué)名竹葉花椒(ZanthoxylumarmatureDC.)，屬于蕓香科花椒屬花椒亞屬，是我國花椒種質(zhì)資源中的特色品種，具有獨(dú)特的麻香風(fēng)味[1]。四川省洪雅縣是我國最大的藤椒產(chǎn)地。近年來，形成了以四川洪雅藤椒油為調(diào)味料的“藤椒菜品”系列[2]。已有研究表明，藤椒中主要有效成分為揮發(fā)油、生物堿、木脂素和酰胺類物質(zhì)等[3]。藤椒除果實可食用外，其根、莖、葉具有多種藥用特性，傳統(tǒng)上用于疾病治療，如驅(qū)蟲、解熱、開胃、胃痛、消化不良和牙痛[4]。

目前，人們將天然抗氧化成分和抑菌材料(如藥食同源中藥材和天然香料提取物)用于食品和日化品工業(yè)中的興趣與日俱增[5]。藤椒揮發(fā)油作為天然產(chǎn)物，評價其抗氧化活性，對其在食品和日化領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。另外，病原微生物易引起食品變質(zhì)和食物中毒，對人類健康造成危害，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，天然抑菌劑的開發(fā)應(yīng)用對保障人體健康也起著重要作用。

藤椒揮發(fā)油是表征藤椒香氣強(qiáng)度的主要指標(biāo)，并且具有抗氧化、抑菌和抗炎等生物活性[6]。目前，國內(nèi)外對藤椒揮發(fā)油的研究主要集中在比較不同提取方法對藤椒揮發(fā)油得率的影響，不同品種、產(chǎn)地、檢測條件等對藤椒揮發(fā)油成分分析的影響及其部分生物活性的研究，還沒有關(guān)于藤椒揮發(fā)油對微生物生長作用機(jī)理的報道[7]。因此，本研究通過GC-MS分析水提藤椒揮發(fā)油的化學(xué)成分，采用體外試驗評估其抗氧化和抑菌能力，并通過OD值測定致病菌生長以及掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察菌體形態(tài)，進(jìn)一步探究其抗菌活性及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮藤椒，四川省洪雅縣；Na2SO4、赤血鹽鉀、FeSO4·7H2O、維生素C、濃鹽酸、無水酒精、FeCl3、Na2HPO4、三氯醋酸、NaH2PO4、NaOH、H2O2、2-羥基苯甲酸、連苯三酚、二甲基酮、DPPH、三羥甲基氨基甲烷[tris (hydroxymethyl) methyl aminomethane THAM，Tris]，均為分析純，成都科龍化學(xué)試劑公司；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellaenterica)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、痢疾志賀氏菌(Shigellacastellani)，由成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實驗室提供。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；醫(yī)用離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；L2S可見分光光度計，上海儀電(集團(tuán))有限公司；THZ-92A臺式恒溫振蕩器，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；303As-1電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；XW-80A旋渦混合器，上海青浦滬西儀器廠；SU-3500掃描電鏡，日立株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 藤椒揮發(fā)油的提取

將清理干凈的藤椒，去除藤椒籽粒，只保留果皮。準(zhǔn)確稱取60.00 g藤椒果皮，在1 000 mL平底燒瓶中加入600 mL蒸餾水和玻璃珠數(shù)顆，連接揮發(fā)油提取器，同時將蒸餾接收器注滿蒸餾水，隨后緩慢加熱平底燒瓶。4 h后冷卻至室溫，從接收管中獲得藤椒揮發(fā)油粗品[1]。向藤椒揮發(fā)油粗品中加入0.05 g的Na2SO4，在常溫下靜置12 h后，通過0.22 μm的微孔過濾膜濾去Na2SO4，備用。

1.2.2 揮發(fā)油的GC-MS分析

1.2.2.1 GC/MS檢測條件

參照陳艷等[8]的方法，具體條件如下：

①色譜條件：HP-5MS石英色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度280 ℃；升溫程序：起始柱溫60 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升溫到130 ℃，然后以20 ℃/min升溫到280 ℃；載氣為高純氦氣(純度為99.999%)，流速1 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，分流比20∶1。

②質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源，電子能量70 eV，離子溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描m/z35～550。掃描方式：全掃描；溶劑延遲3 min。調(diào)諧文件為自動調(diào)諧。

1.2.2.2 GC-MS分析方法

將得到的藤椒揮發(fā)油總離子流圖結(jié)合每個峰保留時間，在計算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，將得到的CAS號在http://www.ichemistry.cn上進(jìn)行檢索獲得具體化合物信息。

1.2.3 藤椒揮發(fā)油體外抗氧化活性測定

1.2.4 藤椒揮發(fā)油抑菌活性測定

1.2.4.1 抑菌圈直徑(diameter of inhibitory zone，DIZ)的測定

濾紙片法：用打孔器將濾紙制成直徑為6 mm的圓形小紙片，放入藤椒揮發(fā)油中浸泡24 h，在無菌條件下將其貼在已準(zhǔn)備好的各種涂致病菌平板上，每皿3片，等距擺放，每株菌做3次重復(fù)，同時用無菌水做對照，37 ℃培養(yǎng)24 h。采用十字交叉法測量DIZ(包括濾紙片直徑)：用直尺分別測量每個抑菌圈2個垂直方向的直徑大小，重復(fù)3次，取平均值[6]。

抑菌圈判定標(biāo)準(zhǔn)[1]：DIZ>15 mm為高度敏感，表明試樣對該菌具有較好的抑制作用；10～15 mm為中度敏感；8～10 mm為低度敏感；無抑菌圈為不敏感。

1.2.4.2 最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)的測定

肉湯微量稀釋法[12]：由于揮發(fā)油易揮發(fā)，因而采用試管法。取10支滅菌試管，將菌液稀釋到0.5個麥?zhǔn)蠞岫龋∠鄳?yīng)1 000 μL培養(yǎng)液于每支試管中，再依次加入藤椒揮發(fā)油0.5、1、2、4、6、8、10、12、14和16 μL。將揮發(fā)油配制成一系列梯度濃度的溶液，使得試管中含揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%和1.6%，放入恒溫振蕩器中37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察是否長菌并記錄生長情況，如果管底有膜狀生成物或試管液體渾濁則為陽性管；管內(nèi)液體澄清，肉眼見無菌生長則為陰性管，用無菌水作對照。每梯度做3次平行試驗，根據(jù)試管內(nèi)液體的渾濁程度判斷MIC，最低濃度的陰性管為MIC。

將測出的MIC及相鄰濃度的試管中液體，接種到瓊脂培養(yǎng)基上，用滅菌涂布棒涂抹均勻，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄實驗結(jié)果，無菌生長的最小濃度即為MBC。重復(fù)以上操作3次，取平均值。

1.2.5 藤椒揮發(fā)油抑菌機(jī)理研究

1.2.5.1 殺菌時間分析

參照DIAO等[13]的方法，由于藤椒揮發(fā)油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌具有較高的敏感性，因此這3種細(xì)菌被選做后續(xù)實驗的模式微生物。用1/2 MIC、MIC的藤椒揮發(fā)油和0.99%乙醇處理3種受試菌株，監(jiān)測12 h內(nèi)的OD值變化。在培養(yǎng)過程中，分別于0、1、2、3、5、7、9和12 h采集8個樣品，在600 nm處測定OD值。

1.2.5.2 SEM觀察

參照DAKHEEL等[14]的方法，受試菌種在37 ℃的營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)過夜。將藤椒揮發(fā)油(對照、MIC)分別加入到懸菌液中。所有細(xì)胞懸液分別在37 ℃孵育12 h，4 ℃下5 000 r/min離心7 min，細(xì)胞用生理鹽水洗滌2～3次，4 ℃固定在體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛中，2 h后分別用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、90%和100%乙醇脫水10 min，然后用叔丁醇代替乙醇。脫水后，用CO2干燥，在離子鍍膜機(jī)中濺射鍍金2 min。用SEM觀察細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0和Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用單因素方差A(yù)檢驗和鄧肯檢驗。統(tǒng)計學(xué)意義的截斷值設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 藤椒揮發(fā)油成分分析

通過對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，經(jīng)過計算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索，結(jié)合保留時間及相關(guān)文獻(xiàn)資料[15]，結(jié)果見圖1和表1。本次從提取的揮發(fā)油組分中共鑒定出12種化合物，其中相對含量較高的為芳樟醇(46.43%)、檸檬烯(26.41%)、檜烯(10.84%)、β-蒎烯(1.60%)和大根香葉烯(1.34%)。芳樟醇具有抗齲齒、鎮(zhèn)靜、抗菌作用，可以用于合成香料、除臭劑、殺蟲劑[16]。檸檬烯具有良好的鎮(zhèn)咳、祛痰、抑菌作用[17]，復(fù)方檸檬烯在臨床上可用于利膽、溶石、促進(jìn)消化液分泌和排除腸內(nèi)積氣[18]。此次提取的鮮藤椒果皮中的揮發(fā)油成分與趙志峰等[19]的研究大致相同，在藤椒果皮中檸檬烯的含量高于全果，但芳樟醇的含量低于全果且未鑒別出石竹烯成分，由此可推測石竹烯僅存在于藤椒籽中。

圖1 藤椒揮發(fā)油總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile oil from Zanthoxylum armatum

表1 藤椒揮發(fā)油化學(xué)成分

2.2 藤椒揮發(fā)油體外抗氧化分析

2.2.1 藤椒揮發(fā)油的還原力

一種天然物質(zhì)清除自由基的能力與其還原能力是密不可分的[20]，在Fe2+-Fe3+氧化還原體系中，可以根據(jù)其顏色的變化來判斷還原程度，反應(yīng)后吸光度、還原能力和抗氧化性呈正相關(guān)[21]。如圖2所示，隨著維生素C和藤椒揮發(fā)油的質(zhì)量濃度的增加，維生素C、藤椒揮發(fā)油的還原力都逐漸增大。其中維生素C的還原效果上升呈斜線趨勢，而藤椒揮發(fā)油逐漸趨于平行。7 mg/mL的藤椒揮發(fā)油的吸光值(OD700=0.329)與0.025 mg/mL的維生素C的吸光值(OD700=0.334)相當(dāng)。

圖2 藤椒揮發(fā)油的還原力Fig.2 Reducing power of volatile oil

2.2.2 藤椒揮發(fā)油清除·OH能力

水楊酸比色法是利用H2O2和Fe2+發(fā)生Fenton反應(yīng)并呈現(xiàn)出相應(yīng)的顏色，510 nm處是其最大吸收峰。然而，當(dāng)反應(yīng)體系中存在·OH清除劑時，會與水楊酸競爭·OH，從而導(dǎo)致吸光度下降[22]。如圖3所示，維生素C、藤椒揮發(fā)油均表現(xiàn)出良好的·OH清除效果，表現(xiàn)為質(zhì)量濃度越大，清除效果越好。經(jīng)計算，維生素C和藤椒揮發(fā)油的IC50分別為0.3和18.1 mg/mL。在達(dá)到0.6 mg/mL后維生素C對·OH的清除率增加緩慢。試驗表明，藤椒揮發(fā)油具有一定的·OH清除作用。

圖3 藤椒揮發(fā)油對·OH的清除能力Fig.3 Scavenging ability of volatile oil on hydroxyl free radicals

2.2.3 藤椒揮發(fā)油清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基是以氮為中心的很穩(wěn)定的自由基[23]，由于3個苯環(huán)的π-π共軛作用和空間障礙使得氮原子上的單個電子無法形成電子對，從而導(dǎo)致DPPH自由基具有較好的穩(wěn)定性。而其呈現(xiàn)的顏色(紫色)隨溶劑(乙醇)的濃度變化而變化，其較強(qiáng)吸收峰在517 nm處。由于溶液中存在的抗氧化物質(zhì)會使得部分DPPH自由基被清除，導(dǎo)致溶液顏色從紫色變?yōu)辄S色，吸光值也相應(yīng)變小。研究表明，吸光度變小的程度與自由基去除程度具有相關(guān)性[24]。如圖4所示，在0.005～0.05 mg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，維生素C對DPPH自由基清除率表現(xiàn)為穩(wěn)中有升，且在50%及以上。藤椒揮發(fā)油對DPPH自由基的清除率表現(xiàn)出微弱的濃度依賴性，經(jīng)計算得維生素C和藤椒揮發(fā)油的IC50分別為0.2和56.3 mg/mL。

圖4 藤椒揮發(fā)油對DPPH自由基的清除能力 Fig.4 Scavenging ability of volatile oil on DPPH free radicals

2.2.4 藤椒揮發(fā)油清除·O2-能力

實驗采用鄰苯三酚自氧化法。在堿性環(huán)境下，鄰苯三酚會發(fā)生自動氧化，并且速度很快，生成有色產(chǎn)物和·O2-，·O2-又反過來催化自氧化，中間產(chǎn)物的含量受到·O2-濃度的影響，減少·O2-便可以降低有色產(chǎn)物的含量，并由此測定清除·O2-的能力[25]。如圖5所示，維生素C、藤椒揮發(fā)油都表現(xiàn)出良好的·O2-清除率。但是隨著濃度的增加，維生素C對·O2-的清除率增加的趨勢大于藤椒揮發(fā)油。通過計算得維生素C和藤椒揮發(fā)油的IC50分別為0.4和10.2 mg/mL。試驗表明，藤椒揮發(fā)油具備較好的·O2-清除效果。

圖5 藤椒揮發(fā)油對·O2-對清除能力Fig.5 Scavenging ability of volatile oil on superoxide anion free radicals

2.3 藤椒揮發(fā)油的抑菌活性分析

2.3.1 藤椒揮發(fā)油的DIZ、MIC和MBC測定

藤椒揮發(fā)油的DIZ、MIC和MBC如表2所示。藤椒揮發(fā)油對大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用。所有供試菌株的DIZ為9.1～13.5 mm，MIC為0.1%～1%，MBC為0.2%～1%。抑菌效果排序如下：痢疾志賀氏菌>鼠傷寒沙門氏菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>產(chǎn)氣腸桿菌，即藤椒揮發(fā)油對痢疾志賀氏菌抑菌能力最強(qiáng)。而大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是革蘭氏陰性和革蘭氏陽性食源性病菌的代表菌。因此，進(jìn)一步探討了對痢疾志賀氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用機(jī)理。

表2 藤椒揮發(fā)油對各供試菌種的DIZ、MIC和MBCTable 2 The DIZ, MIC and MBC of the volatile oil on each tested bacteria

2.4 藤椒揮發(fā)油的抑菌機(jī)理研究

2.4.1 殺菌時間分析

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和痢疾志賀氏菌為模式菌，通過OD法監(jiān)測不同濃度的藤椒揮發(fā)油對其生長的影響。藤椒揮發(fā)油對受試菌在600 nm處的OD值的影響如圖6所示。與對照組相比，暴露于藤椒揮發(fā)油1/2MIC和MIC的OD值變化不大，菌株數(shù)量基本保持不變。相反，隨著時間的推移，暴露于0.99%乙醇的對照組菌株的OD值呈上升趨勢?？芍?種受試菌株的活力喪失具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示藤椒揮發(fā)油是一種天然防腐劑，其殺菌效果與暴露時間和濃度有關(guān)。

2.4.2 SEM觀察分析

SEM圖像顯示，藤椒揮發(fā)油處理的細(xì)菌和未處理的對照細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在差異。未處理的細(xì)胞完好無損(規(guī)則的桿狀或球狀)，表面光滑，如圖7-a、圖7-b、圖7-c所示。以MIC的藤椒揮發(fā)油處理的細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了相當(dāng)大的變化，細(xì)胞表面粗糙，有凹陷，如圖7-d、圖7-e、圖7-f所示。SEM觀察證實，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性受到了破壞，細(xì)菌的形態(tài)發(fā)生了很大的變化。圖7中處理組的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞外膜上有氣孔，這使得細(xì)胞成分很容易通過這些氣孔溢出，也導(dǎo)致了細(xì)胞的凹陷。由于氣孔的形成，細(xì)菌的外膜或細(xì)胞壁最有可能成為藤椒揮發(fā)油的細(xì)胞靶標(biāo)。此外，不同細(xì)菌種類間細(xì)胞壁組成的差異解釋了它們對藤椒揮發(fā)油的不同敏感性。試驗結(jié)果表明，藤椒揮發(fā)油的抑菌作用可能是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜或細(xì)胞壁，從而使細(xì)胞內(nèi)成分外漏。

a-大腸桿菌；b-金黃色葡萄球菌；c-痢疾志賀氏菌圖6 藤椒揮發(fā)油在37 ℃營養(yǎng)培養(yǎng)液中對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和痢疾志賀氏菌生長的影響Fig.6 Effects of volatile oil on the growth of E. coli, S. aureus and S. castellani in 37 ℃ nutrient culture medium

a-大腸桿菌對照組；b-金黃色葡萄球菌對照組； c-痢疾志賀氏菌對照組;d-大腸桿菌MBC組； e-金黃色葡萄球菌MBC組； f-痢疾志賀氏菌MBC組圖7 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和痢疾志賀氏菌 細(xì)胞表面形態(tài)的變化Fig.7 Changes of cell surface morphology of E. coli, S. aureus and S. castellani 注：使用掃描電子顯微鏡(×20 000)進(jìn)行觀察。對照組代表 未經(jīng)揮發(fā)油處理，MBC組代表經(jīng)藤椒揮發(fā)油處理6 h

3 結(jié)論

利用GC-MS進(jìn)行分析，藤椒揮發(fā)油組分中共鑒定出12種化合物，由芳樟醇(46.43%)、檸檬烯(26.41%)、檜烯(10.84%)、β-蒎烯(1.60%)、大根香葉烯(1.34%)等組成。體外抗氧化試驗結(jié)果表明，藤椒揮發(fā)油具備一定的抗氧化能力，且其抗氧化能力總體上是隨濃度的增加而增強(qiáng)，對·OH、DPPH自由基、·O2-清除率也隨濃度的增加而增大。抑菌實驗表明，水提藤椒揮發(fā)油對痢疾志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌均有不同程度的抑制作用，其中，對痢疾志賀氏菌的抑制作用最好，對產(chǎn)氣腸桿菌的抑制作用最弱。抑菌機(jī)理可能是通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁通透性，進(jìn)而導(dǎo)致胞內(nèi)成分外泄。

綜上，藤椒揮發(fā)油擁有良好的抗氧化和抑菌能力并包含多種功效性組分，可作為一種多功效型食品添加劑應(yīng)用到食品行業(yè)，為天然抗氧化劑、天然生物防腐劑的研究提供線索，為藤椒的綜合利用以及深加工產(chǎn)物的開辟提供參考。