汪 穎 張玉潔 焦子惠 李雪麗 王 凱 達曉偉 孫 坤 張 輝

（西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070）

‘苦水’玫瑰（×Yu. et.Ku.）是玫瑰精油主產(chǎn)區(qū)蘭州市永登縣的主栽品種，以迷人的芳香而聞名于世界?！嗨倒宓脑耘鄥^(qū)每年可見“花開時繁團錦簇，秋季里不見一果”的景象，即便是在花期無人采摘的大片玫瑰園地。由于‘苦水’玫瑰在生產(chǎn)上主要受關注的是花，研究上主要關注其花部的各種經(jīng)濟性狀，如花色、花香、精油及其生物活性成分等；同時，‘苦水’玫瑰多采用壓條扦插等營養(yǎng)擴繁的生產(chǎn)方式，使人們一直忽視這個問題：芬芳的玫瑰谷從來不缺少蜜蜂等辛勤的傳粉者，‘苦水’玫瑰為什么不會像月季一樣結出豐碩的果實呢？

‘苦水’玫瑰所在的薔薇科（Rosaceae）有多種果樹，如杏（）、李（）和蘋果（）等都具有配子體型自交不親和性，即自花授粉不能結實，在生產(chǎn)上必須配置授粉品種或進行人工輔助授粉才能保證坐果。薔薇屬不同植物間能進行雜交產(chǎn)生可育后代，且雜交和多倍化是薔薇屬植物進化的主要因素?，F(xiàn)代月季多由品種間雜交和遠緣雜交而來，親緣關系越近雜交親和性越好。李玉舒通過對‘堇蝶’（‘Jindie’）、‘婉粉’（‘Wanfen’）、‘玉蕊霞光’（‘Yurui Xiaguang’）等栽培玫瑰品種的花瓣數(shù)目與結實性的比較研究，發(fā)現(xiàn)玫瑰的結實性與花瓣的數(shù)目有關，也與雄蕊瓣化的程度有關。薔薇屬大部分植物的染色體倍性都已經(jīng)陸續(xù)報道，‘苦水’玫瑰染色體為14條，屬1A型，但關于其小孢子母細胞減數(shù)分裂相關內容卻鮮見報道。染色體的數(shù)目和結構決定植物的生殖過程，減數(shù)分裂過程的穩(wěn)定保證了后代遺傳的穩(wěn)定性和連續(xù)性，其中任何異常均會影響花粉育性。另外，雄性不育也是植物種內生殖障礙的重要機制之一。為此，本研究通過遺傳雜交實驗研究了‘苦水’玫瑰的有性生殖水平，對‘苦水’玫瑰的花部特征及花粉的形態(tài)與功能進行了觀察研究，同時細胞學層面觀察小孢子的發(fā)生過程，以揭示‘苦水’玫瑰千花無果這一現(xiàn)象的內在原因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇‘苦水’玫瑰以及4 個其他薔薇屬的種（品種）為試驗材料（見表1），各供試材料都經(jīng)過形態(tài)特征和cpDNA分子水平的鑒定。

表1 玫瑰材料Table 1 A list of rose materials studied

1.2 試驗方法

‘苦水’玫瑰花期在4 月底至6 月初，5 月為盛花期，與‘豐花’玫瑰、‘四季’玫瑰和‘艷霞’玫瑰的花期基本重合，與重瓣黃刺玫的末花期相遇，授粉材料在花蕾成熟至外層花被微開裂時標記待用。自交材料直接套袋隔離，次日（上午10：00前）人工輔助自交授粉后套袋掛牌。異交雙親材料用鑷子去雄，收集花藥于1.5 mL 離心管，母本材料避免傷及柱頭，用硫酸紙袋保護隔離；花藥散粉后用棉球蘸取授予柱頭，套袋標記?！嗨倒遄越皇诜?0個，雜交每個組合不少于10個。精細田間管理，記錄落果情況，于8月果實著色后采摘。陰干后解剖果實，種子計數(shù)。

對供試的5個材料各取15朵盛開花朵，分離觀察花瓣、雄蕊及雌蕊等三輪花器官的形態(tài)并計數(shù)，其中瓣化雄蕊表現(xiàn)為雄蕊畸形，瓣化有翅狀結構，邊緣或頂端殘存黃色花藥。定義：雄蕊瓣化率=瓣化雄蕊數(shù)量/（瓣化雄蕊數(shù)量+正常雄蕊數(shù)量），利用SPSS 21 檢驗數(shù)據(jù)的方差齊性，完成雄蕊瓣化率的單因素方差分析，比較材料之間的均值差異性。

除黃刺玫外，供試的其余4 種材料隨機選取3朵花上的各10 個將裂花藥，置于離心管中干燥。完全放粉后，在離心管中加入1 mL 2.5%的蔗糖溶液，吸取0.5 μL 的花粉液在100 倍顯微鏡下選取3個視野進行觀察。根據(jù)花粉顆粒的飽滿程度，區(qū)分大花粉和小花粉，分別計數(shù)。參考1.2.2 觀察結果，推算花粉胚珠比（P/O 值）以及大花粉與胚珠之比（BP/O值）。

參考王瓊等提供的栽培玫瑰花粉萌發(fā)的適宜條件，在0.3 g·L的蔗糖溶液中對上述4 種供試材料進行花粉懸滴培養(yǎng)，分別做3個重復對照。將花粉置于墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，于人工氣候箱中25 ℃培養(yǎng)。1、2、3、15、24 h，各時間段選取3 個400倍視野統(tǒng)計花粉萌發(fā)數(shù)量，拍照。

于4月下旬現(xiàn)蕾時開始采集處于不同發(fā)育階段的幼嫩花蕾若干。用卡諾試劑（（無水乙醇）∶（冰醋酸）=3∶1）固定12～24 h，固定好的材料用75%的乙醇清洗后再置于75%的乙醇于4 ℃保存。

參考李懋學的常規(guī)花粉染色觀察，改良石炭酸品紅溶液染色。將保存的花蕾于解剖鏡下剖離花藥，花藥在10%HCL 中室溫解離15 min，蒸餾水漂洗后石炭酸品紅染液染色20 min。切碎花藥蓋上蓋玻片并輕敲蓋玻片使細胞分散，最后封片用于鏡檢。光學顯微鏡拍照記錄減數(shù)分裂的整個過程及其中出現(xiàn)的異常分裂現(xiàn)象。

2 結果與分析

2.1 ‘苦水’玫瑰的授粉結實性

‘苦水’玫瑰的自然授粉與人工輔助自交授粉均無法成功坐果，具有嚴格的不結實性（見表2）。授粉初期可見子房微微膨大，數(shù)天后萎蔫從果柄處脫落。

表2 ‘苦水’玫瑰的遺傳雜交Table 2 Genetic hybridizations involving R. sertata × R.rugosa

收集‘豐花’玫瑰、‘四季’玫瑰、‘艷霞’玫瑰及重瓣黃刺玫的花粉，授在去雄‘苦水’玫瑰的柱頭上，7～10 d 可見明顯肉質漿果，授粉2 月后果皮著色，解剖后可見顆粒飽滿的種子（見圖1A）。4 種供試材料中，‘苦水’玫瑰與‘艷霞’玫瑰的雜交結籽數(shù)最高，平均每個漿果含16.33 個種子?！嗨倒迮c重瓣黃刺玫初步完成的8次雜交試驗，其結果與其他材料結果相似，即‘苦水’玫瑰做母本有結實，果實大小如圖1B所示。

圖1 ‘苦水’玫瑰為母本的異交結實情況A.KSRR×YXRR的果實及種子；B.KSRR×CBRX的果實Fig.1 Production of cross pollination for style of‘Kushui’rose A.Fruits and seeds from KSRR×YXRR；B.Fruits from KSRR×CBRX

‘苦水’玫瑰的花粉授到‘豐花’玫瑰、‘四季’玫瑰、‘艷霞’及重瓣黃刺玫的柱頭上，子房膨大后可留存多日，內無正常發(fā)育的種子，均無法獲得異交果實。

2.2 花部特征觀察

在4 種玫瑰材料的花部發(fā)現(xiàn)均有雄蕊花瓣化現(xiàn)象存在，圖2A 為‘苦水’玫瑰的三輪花器官形態(tài)，第3行為花瓣化的雄蕊結構。Levene統(tǒng)計檢驗瓣化百分率的方差齊性，在未假定方差齊性的情況下利用Dunnett T3進行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)‘四季’玫瑰雄蕊的瓣化程度最低，雄蕊瓣化百分比均值為1.54%，其余3 種品種玫瑰都具有較高的雄蕊花瓣化現(xiàn)象，‘艷霞’玫瑰達到了6.58%，‘豐花’玫瑰和‘苦水’玫瑰分別為5.06%和5.74%，三者之間差異不顯著（見圖2B）。

4種玫瑰的雌蕊群均由多個離生心皮組成，每個心皮含有1個球形胚珠，圖2B中的“雌蕊數(shù)”即雌蕊群的心皮數(shù)目就等于胚珠數(shù)，而“雄蕊數(shù)”并不包含花瓣化的雄蕊，因為瓣化雄蕊中并無成熟的花粉粒釋放出來。根據(jù)花粉計數(shù)和雌蕊數(shù)目計算4種玫瑰每朵花的花粉胚珠比（pollen-ovule ratio，P/O），結果均為2×10左右。由于供試材料的花粉飽滿度百分率和P/O為方差齊性，在假定方差齊性的情況下利用Gabriel進行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)4種玫瑰材料的P/O 均值之間沒有顯著的差異，‘苦水’玫瑰為2.17×10，‘艷霞’玫瑰、‘豐花’玫瑰和‘四季’玫瑰分別為2.53×10、2.17×10和1.91×10（見圖3B）。

圖2 ‘苦水’玫瑰的花器官形態(tài)（A）及不同材料的雄蕊瓣化狀況（B）不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）；**表示差異極顯著（P<0.01）Fig.2 Morphology of floral organ of‘Kushui’rose and petallization of stamens in four materials Different lowercase letters indicate significant difference（sP<0.05）；**means extremely significant difference（P<0.01）

圖3 ‘苦水’玫瑰花粉異型性和不同玫瑰花粉敗育情況A‘.苦水’玫瑰花粉異型性（400×）；B.不同玫瑰材料的花粉敗育狀況Fig.3 Pollen heteromorphorsis of‘Kushui’rose and pollen abortion of different materialsA.Pollen heteromorphorsis of KSRR（400×）；B.Pollen abortion of different materials

2.3 花粉異型性及萌發(fā)率

4種玫瑰的花粉都有敗育現(xiàn)象，花粉異型現(xiàn)象明顯。圖3A 顯示‘苦水’玫瑰除了顆粒飽滿的“大花粉”之外，還存在一系列大小不等的“小花粉”。比較而言，其余3種玫瑰的花粉都可以分為差異非常明顯的“大花粉”和“小花粉”，‘艷霞’玫瑰的花粉形態(tài)如圖4A 所示。統(tǒng)計花粉飽滿百分率顯示‘苦水’玫瑰的數(shù)值在4 種玫瑰中為最小，僅為16.73%，‘四季’玫瑰次之為30.86%，‘艷霞’玫瑰和‘豐花’玫瑰分別達到了54.91%和59.43%（圖3B）。僅把大花粉計算在內的大花粉胚珠比（Big pollen/ovules ratio，BP/O ratio）在4種材料中從小到大分別為0.36×10、0.55×10、1.31×10和1.37×10（見圖3B）。在未假定方差齊性的情況下各材料兩兩比較花粉飽滿百分率和BP/O 值，兩個統(tǒng)計參數(shù)除‘豐花’玫瑰與‘艷霞’玫瑰差異不顯著外，‘四季’玫瑰和‘苦水’玫瑰與其他材料都存在極顯著的差異（圖3B）。

除‘苦水’玫瑰外，其余3 種材料在0.3 g·L蔗糖懸滴中培養(yǎng)的花粉，1 h 后就可觀察到萌發(fā)現(xiàn)象，凸起處花粉壁變薄；2 h 后可見透明狀花粉管形態(tài)，圖4A 為‘艷霞’玫瑰在2 h 時于400×視野下的鏡檢結果；15 h 后3 種玫瑰花粉萌發(fā)率達到最大，‘四季’玫瑰單個視野統(tǒng)計結果可以達到44.44%?！嗨倒寤ǚ鄣母鲿r段檢測結果顯示都沒有萌發(fā)，僅在15 h 時于一個視野下觀察到一個花粉粒吸脹的情形（見圖4B）?！嗨倒宓幕ǚ畚浱幓ǚ郾诮缇€不清晰，破裂后有內容物流出，這與圖4A 所示‘艷霞’玫瑰萌發(fā)的花粉管具有明顯的不同。如圖5所示，統(tǒng)計玫瑰材料在15 h和24 h的萌發(fā)率得到數(shù)據(jù)均值，在未假定方差齊性的條件下檢測到‘四季’玫瑰具有顯著高于‘豐花’玫瑰和‘艷霞’玫瑰的萌發(fā)率，分別為20.44%、11.71%和11.01%，而‘苦水’玫瑰的萌發(fā)率近似為0。

圖4 玫瑰花粉在3%蔗糖溶液中的萌發(fā)情況A.萌發(fā)的‘艷霞’玫瑰花粉（2 h，400×）；B‘.苦水’玫瑰花粉的吸脹現(xiàn)象（15 h，400×）Fig.4 Pollen germination of rose in 3%sucrose solution A.Germination of YXRR pollens（2 h，400×）；B.Bulges of KSRR pol?len（s15 h，400×）

圖5 玫瑰材料萌發(fā)率統(tǒng)計Fig.5 Germination rates of rose materials

2.4 小孢子母細胞減數(shù)分裂行為觀察

通過對‘苦水’玫瑰小孢子母細胞減數(shù)分裂后期Ⅰ（見圖6：Ac）和‘四季’玫瑰減數(shù)分裂前期Ⅰ（見圖6：Bj）的染色體觀察，發(fā)現(xiàn)兩種玫瑰染色體均為14 條（2n=2x=14）。兩種栽培玫瑰小孢子母細胞發(fā)育過程中均存在減數(shù)分裂各時相不同步的現(xiàn)象，同一花蕾不同花藥的發(fā)育程度不同，同一個花藥中的不同小孢子母細胞減數(shù)分裂進程不一致（見圖6：Bo），減數(shù)分裂的不同步程度嚴重。

本研究觀察到了‘苦水’玫瑰和‘四季’玫瑰幾乎所有的小孢子母細胞減數(shù)分裂時相（圖6箭頭所示）。‘四季’玫瑰小孢子母細胞外形圓潤，減數(shù)分裂過程中染色體協(xié)調分配，胞質均勻分裂，屬正常減數(shù)分裂行為（見圖6B）。與‘四季’玫瑰不同的是，‘苦水’玫瑰的減數(shù)分裂過程中觀察到細胞核與細胞質均有異常分裂現(xiàn)象。‘苦水’玫瑰中期Ⅰ（見圖6：Ab）、后期Ⅰ（見圖6：Ac）、中期Ⅱ（見圖6：Af）等多個時相中都可觀察到減數(shù)分裂細胞外形有一定程度的不規(guī)則形變。后期Ⅰ（見圖6：Ac）、末期Ⅱ（見圖6：Ag）、三分體（見圖6：Ai）等多個時相染色體的著色程度深淺不一，范圍不等，染色體分配行為具有明顯的不協(xié)調性?！嗨倒逯衅冖颍ㄒ妶D6：Af）和四分體時期（見圖6：Ah）中可觀察到成對的次級小孢子母細胞及四分體的細胞質著色范圍大小不一，表明存在胞質不均勻分裂。這種染色體和細胞質分裂的不均等會直接導致‘苦水’玫瑰減數(shù)分裂的產(chǎn)物中存在大量異常的四分體，甚至有明顯的三分體（見圖6：Ai）。

圖6 小孢子母細胞減數(shù)分裂過程（1 000×）A‘.苦水’玫瑰減數(shù)分裂過程（a.前期Ⅰ；b.中期Ⅰ；c.后期Ⅰ；d.末期Ⅰ；e.前期Ⅱ；f.中期Ⅱ；g.末期Ⅱ；h.四分體；i.三分體）；B‘.四季’玫瑰減數(shù)分裂過程（j.前期Ⅰ；k.中期Ⅰ；l.后期Ⅰ；m.末期Ⅰ；n.末期Ⅱ；o.減數(shù)分裂的不同步性）Fig.6 Meiosis process of pollen mother cell（s1 000×）A.Meiosis process of KSRR pollen mother cell（sa.Prophase Ⅰ；b.Metaphase Ⅰ；c.Anaphase Ⅰ；d.Telophase Ⅰ；e.Prophase Ⅱ；f.Metaphase Ⅱ；g.Telophase Ⅱ；h.Tetrad；I.Triad）；B.Meiosis process of SJRR pollen mother cell（sj.Prophase Ⅰ；k.Metaphase Ⅰ；l.Anaphase Ⅰ；m.Telophase Ⅰ；n.Telophase Ⅱ；o.Non?synchronism of meiosis）

3 討論

3.1 苦水玫瑰的雄性不育導致千花無果現(xiàn)象

單瓣玫瑰、復瓣玫瑰和多數(shù)重瓣玫瑰都具有很好的結實能力，但李玉舒對于自己命名的“紫緞”和“灑金紫緞”這兩個‘苦水’玫瑰品種都記載為“基本不結實”，她推測玫瑰的雄蕊瓣化程度與其結實性存在負相關性，本研究顯示‘苦水’玫瑰與其他油用玫瑰的雄蕊花瓣化程度沒有顯著差異，處于同一水平，推測對其結實性能的影響不大。

‘苦水’玫瑰所在的薔薇科具有配子體型自交不親和性，同屬薔薇亞科的草莓屬植物更是具有兩個控制自交不親和的S-位點。本研究發(fā)現(xiàn)‘苦水’玫瑰作為母本能夠正常授粉結實，而自交或作為父本與其他任何玫瑰品種間雜交都無法正常受精結實，表明存在明顯的花粉異?；蛐坌圆挥F(xiàn)象，同時，與重瓣黃刺玫的遠緣種間雜交的初步結果也支持該結論。同時，據(jù)柏斌等報道‘苦水’玫瑰的雜交育種實踐中也把其確定為雄性不育系。所以，雄性不育造成了’苦水‘玫瑰園區(qū)千花無果的獨特景象，而并非是由薔薇科常見的自交不親和性導致。當然，‘苦水’玫瑰雄性不育的這種上位效應一定程度會掩蓋其自交不親和性的表現(xiàn)，‘苦水’玫瑰是否具有完整的S-位點以及正常的S-基因并不清楚，還需進一步在基因層面做深入研究。

3.2 ‘苦水’玫瑰的小孢子減數(shù)分裂異常造成了花粉敗育

‘苦水’玫瑰具有與‘豐花’、‘四季’及‘艷霞’等玫瑰品種相似的花粉胚珠比（P/O 值），這說明在提供花粉數(shù)量方面它們具有相近的供粉效率，而受粉結實性能的差異主要取決于花粉質量。李玉舒等發(fā)現(xiàn)玫瑰品種中都不同程度地存在花粉敗育現(xiàn)象，敗育的花粉粒較正常的花粉粒小，內凹，空癟呈畸形，這與在本研究各種玫瑰材料中觀察到的現(xiàn)象相一致。然而，與其他材料僅具有大花粉和小花粉兩種差別明顯的類型不同，‘苦水’玫瑰的花粉鏡檢結果顯示除了正常的大花粉之外，還存在從大到小連續(xù)變異的異?；ǚ?，這種花粉敗育極大地降低了‘苦水’玫瑰作為父本在雜交授粉時的貢獻率。

染色體壓片試驗中觀察到‘苦水’玫瑰和‘四季’玫瑰的染色體均為14條，與招雪晴等的結果相一致，且兩種玫瑰的減數(shù)分裂各時相進程有嚴重的不同步性，該特性是薔薇屬植物普遍存在的減數(shù)分裂現(xiàn)象。陳瑤等認為植物小孢子母細胞減數(shù)分裂異常是導致花粉敗育的主要原因，在減數(shù)分裂的前期、后期、末期等任何一時期發(fā)生異常都會導致小孢子不能正常發(fā)育，降低了花粉育性。本研究發(fā)現(xiàn)小孢子母細胞減數(shù)分裂時染色體分配不協(xié)調，胞質不均等分裂等因素都影響了‘苦水’玫瑰正常的四分體發(fā)生和發(fā)育，甚至變?yōu)槿煮w，推測種種異常的減數(shù)分裂行為是造成‘苦水’玫瑰花粉敗育的主要原因，而且這種花粉敗育嚴重妨礙了其在雜交育種中做父本時的結實率，從而導致其具有雄性不育的特性。當然，植物花粉形成和發(fā)育過程中絨氈層也起著十分重要的作用，如果絨氈層功能失常，出現(xiàn)液泡化，過度肥大等現(xiàn)象，均會導致小孢子母細胞減數(shù)分裂不能正常進行。同時，異常的紡錘體方向被認為是三分體形成的原因，細胞不均等分配也可能形成三分體或多分體。然而，‘苦水’玫瑰減數(shù)分裂過程中絨氈層細胞如何變化？其小孢子母細胞異常受哪一種雄性不育機制控制？仍需要進一步的深入研究。

3.3 ‘苦水’玫瑰的雄性不育與遺傳雜交育種

生產(chǎn)上，‘苦水’玫瑰主要依靠壓條扦插等方式營養(yǎng)擴繁，長期的無性繁殖也導致‘苦水’玫瑰出現(xiàn)不同的自然變異類型，而且在外觀形態(tài)和內在香氣成分方面都具有明顯的差異，這種自然分化的性狀變異在‘苦水’玫瑰育種實踐中的應用尚需進一步探索。本研究發(fā)現(xiàn)花粉敗育導致‘苦水’玫瑰具有雄性不育現(xiàn)象，但其柱頭具有正常可授性，花柱能夠正常引導花粉管生長，特別是胚珠中具有正常可受精的卵細胞。所以，‘苦水’玫瑰可以作為母本進行雜交育種改良種質，這也是柏斌和牛元等能夠通過常規(guī)的雜交育種技術獲得大花型‘苦水’玫瑰新品種的原因。