程 赫 田雙慧 張 洋 劉 聰 夏德安 魏志剛

（1. 林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業(yè)大學，哈爾濱 150040；2. 國家林業(yè)和草原局鹽堿地研究中心，中國林業(yè)科學研究院，北京 100091）

非特異性脂質轉運蛋白（non-specific lipid transfer proteins，nsLTP）廣泛存在于高等植物中，是一類在體外膜之間介導磷脂轉移的堿性蛋白，具有8個保守的半胱氨酸基序（C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXC-Xn-C-Xn-C，8 CM）（其中的二硫鍵能形成穩(wěn)定的疏水結構），是其參與結合和轉運各種脂質（如脂肪酰輔酶A、磷脂和脂肪酸等）的調控活性中心。nsLTP蛋白于1975年首次在馬鈴薯（）發(fā)芽塊莖中被發(fā)現(xiàn)，隨后，在油菜（）、黃瓜（）和火炬松（）等多種植物中相繼克隆出。根據(jù)其編碼蛋白分子量、序列相似和脂質轉移效率的差異性，植物nsLTP 可分為nsLTP1（8～10 kDa）和nsLTP2（約7 kDa）2種類型，其中nsLTP1 型的疏水腔呈隧道狀，而nsLTP2 型則呈三角形的空心狀。

研究發(fā)現(xiàn)，植物參與細胞壁松弛和延伸、花藥和花粉的發(fā)育與萌發(fā)等生長發(fā)育的多個生物學過程，如被家族沉默的水稻（）花粉外壁發(fā)育缺陷、花粉育性降低，玉米（）nsLTP 蛋白能與一種鈣調素結合蛋白相互作用，從而調節(jié)自身的生理活性。同時，植物在生物與非生物脅迫響應中也能發(fā)揮重要作用，如過表達小鹽芥（）的轉基因株系在鹽脅迫下生物量和葉綠素值顯著高于野生型植株。擬南芥（）脂質轉運蛋白AZI1 不僅能與蛋白激酶MPK3相互作用形成復合物，也能夠被MPK3 上調表達，從而介導其鹽脅迫響應。此外，植物對脫落酸、水楊酸、赤霉毒和乙烯等激素脅迫也具有響應性，如馬鈴薯中在水楊酸、茉莉酸和脫落酸的誘導下表達量有明顯的上調趨勢。

先前研究已經(jīng)在擬南芥、水稻和小麥（）等模式植物中分別鑒定出了49、52、106 個基因并對其進行了全基因組分析。由于8 個保守的半胱氨酸的結構不同，被分為9 大類、被分為10 類，且處于相同類別的基因在多條染色體上形成了基因簇，說明該基因家族的擴增主要是由串聯(lián)復制事件演化而來；結構分析表明該家族內含子—外顯子結構多樣性較低，多數(shù)基因無內含子；在鹽和干旱脅迫條件下家族基因被上調表達，說明該家族基因在響應逆境脅迫方面可能具有重要的功能。毛果楊（）作為首個全基因組測序的木本植物，是研究木材形成、季節(jié)性生長、性別分化以及木本植物逆境脅迫響應的模式植物。然而，目前為止，尚未見家族基因的研究報導。本項研究從全基因組水平對家族成員的基因數(shù)量、親緣關系、基因結構、染色體定位、編碼蛋白保守基序分布與數(shù)量等特征進行研究。同時，利用qRT-PCR 技術并結合轉錄組數(shù)據(jù)，對其組織與逆境脅迫響應特性進行初步研究。本項研究將為在楊樹生長發(fā)育與逆境脅迫下的生物學功能分析與鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 PtrnsLTP 家族成員的確定以及系統(tǒng)進化分析

為了鑒定毛果楊基因家族的成員，首先利用已知的擬南芥家族各基因編碼氨基酸序列在毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）進行搜索，將獲得的序列結果匯總整理，剔除重復序列后作為候選基因。為了驗證初始結果的可靠性，將候選基因的氨基酸序列上傳至HMMER 網(wǎng)站（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）以及NCBI 保守結構域數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）鑒定其是否具有家族保守結構域。通過上述步驟，初步確定家族包含39個基因。

下載和編碼的氨基酸序列，通過MEGA6.0 軟件中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ），校驗參數(shù)Bootstrap 重復10 000 次，構建進化樹，隨后在iTOL（https：//itol.embl.de/）網(wǎng)站上對生成的進化樹進行可視化處理。

利用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）在線預測PtrnsLTP 蛋白理化性質，包括氨基酸數(shù)目、分子量和等電點等；從Phytozome 數(shù)據(jù)庫中獲取該基因家族的染色體位置、基因序列、氨基酸序列、開放閱讀框長度以及氨基酸長度等信息，并根據(jù)基因所在的染色體號以及位置對其命名；通過Plant-mPLoc（http：//www. csbio. sjtu. edu. cn/bioinf/plant-multi/）網(wǎng)站，在線預測家族成員的亞細胞定位信息。

1.2 同源基因的Ka和Ks分析

通過Blastp 比對氨基酸序列，利用TBtools 軟件分析同源基因對之間的Ka（異意替換）和Ks（同意替換）以及二者的比率。這個比率可以判斷是否有選擇壓力作用于這個蛋白質編碼的基因。若Ka/Ks=1 則同義突變和非同義突變將以同樣的速率被固定，即中性選擇，突變不會影響蛋白質的結構和功能；若Ka/Ks＞1，氨基酸發(fā)生了改變，此時的非同義突變會提高植物的生存力，即正選擇；只有當Ka/Ks＜1 時，非同義突變是有害的，即負選擇，使得突變具有純化作用。

1.3 PtrnsLTP的結構及保守基序分析

通過GSDS 網(wǎng)站（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/in?dex.php）將的內含子和外顯子信息進行可視化，并結合MEGA6.0 軟件對其進化樹文本進行基因進化樹比對分析。

利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）網(wǎng)站對PtrnsLTP 氨基酸序列進行保守基序分析，TBtools軟件對該分析結果進行可視化處理。

1.4 PtrnsLTP組織表達鹽脅迫響應特性分析

組織表達特異性分析：通過Phytozome 數(shù)據(jù)庫，下載各在各組織中的表達量數(shù)據(jù)，并與qRT-PCR 分析結果相互驗證。野生型毛果楊來自中國科學院上海生物科學研究所，用組織培養(yǎng)的方法擴繁后。將1 月大小的組培苗移栽到土壤中，在25 ℃、長日照（光照16 h 黑暗8 h）環(huán)境下溫室中培養(yǎng)3 周。分別采集根、莖和葉組織，利用植物總RNA 提取試劑盒（MiniBEST，TaKaRa）提取總RNA，然后采用PrimeScriptRT reagent Kit（Per?fect Real Time，TaKaRa）試劑盒反轉錄RNA 獲得cDNA 用于qRT-PCR。每組處理重復3 次，采用2法計算相對表達量并利用TBtools可視化。

鹽脅迫下的響應特性：將幼苗隨機分成7 組，每組包含5 棵毛果楊幼苗。用100 mmol?LNaCl處理3、6、12、24、48、72 h 同時用水處理作為對照組。分別采集上述處理組內各植株材料的根、莖和葉組織，提取總RNA 后反轉錄獲得cDNA 進行qRT-PCR 分析。每組處理重復3 次，采用2法計算相對表達量并利用TBtools可視化。

根據(jù)熒光定量引物設計原則，設計家族基因定量引物，以為內參基因（見表1）。在賽默飛ABI 7500實時熒光定量PCR儀上進行試驗，體系如下：2×TransStart TOP/Tip Green qPCR Supermix 10 μL、上下游混合引物（10 μmol·L）0.4 μL、cDNA1.5 μL，PassiveReference Dye（50×）0.4 μL，加ddHO 至20 μL。反應程序：94 ℃30 s；94 ℃5 s，60 ℃15 s，72 ℃35 s，循環(huán)40次；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃30 s。

表1 PtrnsLTP定量引物序列Table 1 PtrnsLTP quantitative primer sequence

2 結果分析

2.1 PtrnsLTP系統(tǒng)進化

以家族基因序列為參考，在毛果楊基因組中鑒定出39個，其編碼蛋白均含有植物nsLTP 典型的C--C-Xn-CC-Xn-CXC-Xn-C-Xn-C保守結構域。為了進一步分析家族成員間進化關系，構建了毛果楊和擬南芥編碼的蛋白序列進化樹。結果（見圖1）表明：毛果楊與擬南芥可分為5 個亞家族，不同的亞家族間用不同的背景顏色表示，同時外部的黑色和白色圓圈分別代表毛果楊及擬南芥nsLTP 家族基因。可以看出A 亞族有6 個、B 亞族有2 個、C 亞族有13 個、D 亞族有3 個、E 亞族有15 個成員，與其他物種的進化方式相似。

圖1 擬南芥和毛果楊nsLTP基因家族系統(tǒng)進化樹黑色圓圈標記PtrnsLTP，白色圓圈標記AtnsLTPFig.1 Phylogenetic tree of Arabidopsis thaliana and P.trichocarpa nsLTP gene family PtrnsLTP is marked with a black circle，AtnsLTP is marked with a white circle

2.2 PtrnsLTP基本特征

家族各基因編碼蛋白分子質量為8.58～16.95 kDa、pI 值為4.27～9.91，符合植物家族基因編碼蛋白的等電點基本特征（見表2）。亞細胞定位預測表明，編碼蛋白如PtrnsLTP1.1等14 個蛋白定位在細胞膜上，PtrnsLTP1.3等22個蛋白定位在細胞壁上，其中PtrnsLTP9.2、PtrnsLTP11.1和PtrnsLTP15.1在細胞膜和細胞壁上均有定位。

表2 PtrnsLTP家族概況Table 2 Overview of the PtrnsLTP gene family

2.3 PtrnsLTP的染色體定位及序列一致性

為了闡明家族基因在染色體上的分布，利用TBtools 構建了家族基因染色體定位以及同源關系圖。結果（見圖2）表明，主要分布在毛果楊1 號和16 號染色體上，各有6 個且16號染色體上的6 個基因形成了基因簇。4、9、11、12和14號染色體上各有3個，2、7、10、15和17號染色體上各有2個，其余染色體上均只含有1個基因。

圖2 PtrnsLTP染色體定位及序列一致性Fig.2 Chromosome location and sequence identity analysis of PtrnsLTP

Blastp 結 果 顯 示，和與同源片段長度大于300 bp且序列一致性高于80%，同樣的還有和、和、和、和（見圖3，表3），說明這7 對基因為基因復制事件進化而形成的旁系同源基因。

圖3 PtrnsLTP家族基因外顯子—內含子結構Fig.3 Exon-intron structure of PtrnsLTP family gene

表3 同源基因的Ka/Ks比值及序列一致性Table 3 Ka/Ks ratio and sequence identity of homologous genes

同源基因Ka/Ks 分析發(fā)現(xiàn)，家族共有7 對同源基因，其中6 對基因（和、和、和、和、和、和）的Ka/Ks 比值小于1，1 對（和）大于1（見表3），上述結果表明，家族各成員在進化過程中大多數(shù)基因經(jīng)過了純化選擇，少部分基因受到了正向選擇。值得注意的是這6 對基因處于同一個大的進化分支上，推測進化壓力的不同可能會導致基因功能的分化。

2.4 PtrnsLTP 外顯子和內含子分布以及編碼蛋白結構域

為了更好地闡明家族中各基因外顯子與內含子分布規(guī)律，利用GSDS網(wǎng)站對上述內容進行了可視化處理。結果表明（見圖3），不同基因的內含子與外顯子在基因中的分布方式相似，所有基因均無內含子，表明家族基因的結構在進化中極為保守。

家族編碼蛋白保守域分析發(fā)現(xiàn)，9 個保守基序中Motif 1 和Motif 2 為家族共有基序（見圖4）。雖然不同基因編碼蛋白所含基序數(shù)量與種類存在一定的差異，但相同分枝的基因編碼蛋白具有相似的基序組合，而不同亞家族、類型之間的基序存在明顯的差別。上述結果表明，不同亞家族的生物學功能在進化過程中可能產生了分化。

圖4 PtrnsLTP蛋白的保守基序分析Motif 1～9用不同的顏色表示；Motif 1～4序列展示在下方Fig.4 Conserved motif analysis of PtrnsLTP protein Motif 1～9 are represented by different colors，and Motif 1～4 sequences are shown below

2.5 PtrnsLTP組織表達特異性

為了解家族各成員在毛果楊生長發(fā)育中的生物學功能，我們對Phytozome 中家族各基因在不同組織部位的表達量數(shù)據(jù)并進行了初步分析，結果（見圖5A）表明，家族成員在毛果楊各組織表達量不同，其中除、、、、、以 及在網(wǎng)站無表達量數(shù)據(jù)以外，其余基因均在毛果楊不同部位有所表達。該家族大部分基因在莖部表達量較高，其次為葉部，相同進化分枝基因的表達模式相似。同時，我們利用qRT-PCR 技術對家族成員在毛果楊不同組織部的表達情況做進一步驗證，結果（見圖5B）表明，各家族成員在毛果楊根、莖和葉中的表達變化趨勢與phytozome 中各基因表達值基本吻合。上述結果初步表明，家族成員在毛果楊根、莖和葉發(fā)育過程中的生物學功能產生了分化。

圖5 PtrnsLTP組織表達特異性A.Phytozome網(wǎng)站數(shù)據(jù)；B.qRT-PCR結果Fig.5 PtrnsLTP tissue expression specificity A.Phytozome website data；B.qRT-PCR results

2.6 PtrnsLTP對鹽脅迫的響應特性

為鑒定家族成員的鹽脅迫響應特性，利用qRT-PCR 技術分析了不同時間鹽脅迫下家族成員在毛果楊根、莖、葉部的表達量。結果（見圖6）表明，39個成員均對鹽脅迫有不同程度的響應；根部組織中，隨著鹽脅迫時間的增加，除、、和表達量降低以外，其余基因表達量均有明顯的上升趨勢；莖部幾乎所有基因表達量隨著脅迫時間的增加呈現(xiàn)明顯的先升高后降低的“倒U”曲線趨勢，即隨著脅迫時間的增加表達量先升高，達到峰值后逐漸降低；同樣，葉部相同進化分支的基因如、和表達量也在12 h 時達到了峰值，而其他大部分基因表達量隨脅迫時間增加呈現(xiàn)明顯上升的趨勢。

圖6 PtrnsLTP在鹽脅迫不同時間下的表達特性Fig.6 Expression characteristics of PtrnsLTP under salt stress at different times

3 討論

脂質（磷脂）在維持植物細胞功能、生長發(fā)育以及各種脅迫的應答中起著重要作用，而nsLTP蛋白是植物體內脂質（磷脂和脂肪酸）跨膜轉運的主要載體。研究表明，植物nsLTP 對干旱、鹽堿和低溫等非生物脅迫具有較強的響應能力。目前為止，植物家族基本特性的研究主要集中在水稻和擬南芥等草本模式植物中，木本模式植物毛果楊家族的研究目前尚無報導。

3.1 PtrnsLTP家族基因基本特性

本項研究在毛果楊基因組中鑒定出39 個，按照進化關系將其分為5 個亞組族（見圖1），其編碼蛋白分別定位在細胞壁、細胞膜或在二者之間均有定位（見表2）。家族成員分布于毛果楊14 條染色體上，且各染色體上基因分布數(shù)量存在差異，其中1 號和16 號染色體上分布最多，分別有6 個（見圖2），而6 和8 號染色體上均只含有1個基因，表明導致家族成員擴張的歷史事件存在差異。家族中有7 對基因為旁系同源基因（見圖2 和表3），其中1 對旁系同源基因的Ka/Ks 比值大于1，證明其受到了正向選擇，6 對遠小于1，且這6 對基因處于同一個大的進化分支。該家族基因在進化過程當中既經(jīng)歷了純化選擇也經(jīng)歷了正向選擇，有害的非同義替換在進化過程中消失，極少數(shù)的無害或有益替換得以保留，上述結果表明，毛果楊家族基因在進化過程受到的選擇作用不同，因此其家族基因編碼蛋白的細胞定位與理化性狀產生了分化。同時，這一現(xiàn)象也預示了該基因家族的生物學功能產生了分化。家族基因均無內含子（見圖3），一般認為無內含子基因能夠連續(xù)編碼成蛋白質，且內含子與真核生物基因組的復雜程度有很大的關系，越復雜的生物體其體內的內含子數(shù)越多。此外近期研究表明，無內含子基因能夠更加快速的應答脅迫信號，預示著該家族基因在非生物脅迫下可能具有重要功能。與其他植物一樣，家族編碼蛋白含有多個基序，表明該基因家族生物學功能的多樣性，但所有基因均含有保守基序Motif 1 和Motif 2（見圖4），表明這兩個基序是該家族的特征基序，且是毛果楊生命活動所必需的。上述結果進一步預示了家族結構相對較為保守，但不同進化分枝基因可能在生物學功能上出現(xiàn)了分化。

3.2 PtrnsLTP家族基因參與鹽脅迫響應過程

結合毛果楊生物學網(wǎng)站表達譜數(shù)據(jù)（見圖5A）與本研究中qRT-PCR 結果（見圖5B）發(fā)現(xiàn)，家族成員在毛果楊根、莖和葉部均有表達，但表達量在3 種組織中存在差異，其中11 個基因在根部表達水平較高，15 個在莖部表達水平較高，13個在葉部表達水平較高，預示了各成員分別在毛果楊不同組織發(fā)育過程中扮演著不同的作用。前期研究表明，多涉及環(huán)境脅迫響應，而鹽脅迫又是最常見的環(huán)境脅迫之一。鹽脅迫過程主要分為兩部分即滲透脅迫和離子脅迫，滲透脅迫是植物在鹽漬土壤中經(jīng)歷的第1次脅迫，當鹽濃度達到臨界值時就會產生離子毒害。我們利用qRT-PCR 分析毛果楊在鹽脅迫不同時間下的表達情況（見圖6），結果進一步表明，家族基因對鹽脅迫具有不同程度的響應能力，與擬南芥中該家族在鹽脅迫中表現(xiàn)類似。值得注意的是莖部幾乎所有的基因在鹽脅迫12 h時表達水平顯著上升，而莖部又是輸送水、無機鹽以及有機物等維持植物體正常生長必不可少成分的關鍵部位。據(jù)此，我們推測該家族基因可能在植物鹽脅迫中主要參與滲透脅迫過程。

本研究通過對家族基因生物學功能的鑒定和鹽脅迫表達特征分析為今后更深入了解該基因家族奠定了基礎，同時也對基因資源的挖掘具有積極的意義。