郭英杰 劉曉婕 張 帥 劉 洋 張 萍 許晨晨 朱學(xué)海*

(1.張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 黍子研究所，河北 張家口 075032；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，北京 100193)

黍子是一年生禾本科作物，具有生育周期短、抗旱耐瘠、耐鹽堿和抗風(fēng)沙等特點(diǎn)，是我國(guó)干旱半干旱地區(qū)主要的糧食作物之一，同時(shí)在鹽堿地開(kāi)發(fā)利用、沙漠治理以及晚播救災(zāi)等方面也發(fā)揮著重要作用[1-3]。此外，由于黍子中含豐富的粗蛋白、膳食纖維、常量元素和微量元素，作為一種健康食品已被消費(fèi)者廣泛關(guān)注[4]。但目前我國(guó)黍子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展相對(duì)于其他作物較緩慢，主要體現(xiàn)在生產(chǎn)技術(shù)水平較低，仍沿襲傳統(tǒng)種植模式，耕作管理粗放，機(jī)械化程度低，另一方面種質(zhì)資源的改良優(yōu)化投入較少，種植品種仍以傳統(tǒng)農(nóng)家種為主，品種混雜、退化嚴(yán)重且產(chǎn)量低[5-7]，因此通過(guò)選育新品種來(lái)實(shí)現(xiàn)黍子優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)和適應(yīng)未來(lái)機(jī)械化種植勢(shì)在必行。

由于誘變育種可以在短時(shí)間內(nèi)獲得一些常規(guī)育種難以獲得的新突變和新種質(zhì)，并極大地拓寬遺傳變異范圍，豐富突變體資源庫(kù)，因此誘變育種已成為常規(guī)選擇育種和雜交育種的重要補(bǔ)充，得到廣泛應(yīng)用[8-9]。劉美桃等[10]利用EMS誘變獲得了谷子抗除草劑‘拿捕凈’株系；陳天子等[11]通過(guò)EMS誘變獲得了水稻非轉(zhuǎn)基因抗除草劑種質(zhì)；Kuraparthy等[12]用EMS誘變二倍體小麥并成功克隆到控制分蘗的TIN3基因；Brunelle等[13]利用EMS處理玉米植株后發(fā)現(xiàn)玉米EMB基因座。以上研究為育種提供了寶貴的種子資源。EMS誘變具有突變率高、變異譜廣、染色體畸變率較小、誘變成本低和操作簡(jiǎn)單便利等優(yōu)點(diǎn)，已成為挖掘水稻和小麥等多種作物基因資源的有力工具，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者青睞[14]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于EMS誘變黍子生理的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)EMS誘變野生型黍子構(gòu)建突變體庫(kù)，并從中篩選到穩(wěn)定遺傳的矮稈突變體‘87’，通過(guò)對(duì)矮稈突變體‘87’的表型及赤霉素敏感性分析，旨在探究黍子突變體矮化生理機(jī)制，以期為改良黍子株型和培育抗倒高產(chǎn)新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生型黍子材料選取‘石湖千斤糜’，國(guó)編號(hào)‘5711’，在張家口市種植編號(hào)為‘260’(野生型‘260’)及其經(jīng)0.4%(w/v) EMS誘變20 h獲得的穩(wěn)定遺傳的突變體，暫命名為矮稈突變體‘87’。試驗(yàn)材料均來(lái)自河北省張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院黍子研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

農(nóng)藝性狀調(diào)查：試驗(yàn)于2017年6月在張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院沙嶺子試驗(yàn)站(40°41′ N，114°54′ E，海拔587 m)進(jìn)行。每個(gè)材料種植2小區(qū)，小區(qū)長(zhǎng)20 m，寬6 m，株距15 cm，行距30 cm，肥水管理措施同一般生產(chǎn)大田。出苗后在每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)隨機(jī)選取野生型‘260’和矮稈突變體‘87’植株各10株，并掛牌標(biāo)記。成熟期測(cè)定掛牌植株的株高、節(jié)間長(zhǎng)、基部第一節(jié)莖粗以及穗部等性狀。

主莖剖面細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：選取抽穗期矮稈突變體‘87’和野生型‘260’第5節(jié)間的中間部位作為橫、縱向切片材料，委托武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司進(jìn)行組織軟化、包埋、染色、切片制作與細(xì)胞觀察。

內(nèi)源GA含量測(cè)定：在抽穗期和成熟期分別采集野生型‘260’和矮稈突變體‘87’的劍葉，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 測(cè)定抽穗期GA3和GA4含量，成熟期的GA1+GA3含量。

外源GA敏感性分析：在種植小區(qū)內(nèi)挑選10株長(zhǎng)勢(shì)一致的矮稈突變體‘87’植株，選取其中5株從7月19日開(kāi)始每隔7 d噴施1次50 mg/L的外源GA3(外源GA3為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品)，另外5株每次噴施等量清水作為對(duì)照，共噴施3次，噴施程度為處理液充分而又均勻分布于整個(gè)植株表面，此外每次噴施前測(cè)量植株高度。

數(shù)據(jù)處理與分析：試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、作圖，采用IBM SPSS Statistics 24軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 矮稈突變體‘87’的表型差異分析

由圖1可知，矮稈突變體‘87’拔節(jié)期的株高、莖節(jié)數(shù)和分蘗數(shù)遠(yuǎn)低于野生型‘260’。由表1可知，成熟期矮稈突變體‘87’的株高僅為野生型‘260’的46.7%，分蘗數(shù)增加1.7個(gè)，差異均達(dá)顯著水平；莖節(jié)數(shù)和野生型‘260’差異不顯著；矮稈突變體‘87’地上第一節(jié)莖粗比野生型‘260’增加14.1%。

表1 野生型‘260’和矮稈突變體‘87’成熟期株型結(jié)構(gòu)Table 1 The plant structure of wild-type ‘260’ and dwarf mutant ‘87’ at mature stage

圖1 拔節(jié)期矮稈突變體‘87’和野生型‘260’株型比較Fig.1 Comparison of plant type between dwarf mutant ‘87’ and wild-type ‘260’ at jointing stage

由圖2可知，矮稈突變體‘87’和野生型‘260’節(jié)間長(zhǎng)度變化趨勢(shì)基本一致，均表現(xiàn)為隨莖節(jié)數(shù)的增加節(jié)間長(zhǎng)度先上升后下降，地上第4莖節(jié)節(jié)間長(zhǎng)度最大。矮稈突變體‘87’基部第1莖節(jié)莖長(zhǎng)僅為野生型的32.3%，第2～5節(jié)長(zhǎng)為野生型的40.0%左右，第6～9節(jié)長(zhǎng)為野生型的45.7%～49.2%。以莖節(jié)長(zhǎng)度比值作線性趨勢(shì)線后可知矮稈突變體‘87’基部縮短較多，莖節(jié)上部縮短較少。

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。Different lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 level. The same below.圖2 成熟期矮稈野生型‘260’和突變體‘87’節(jié)間長(zhǎng)度及節(jié)間比率Fig.2 Internode length and ratio of wild-type ‘260’and dwarf mutant ‘87’ at mature stage

比較野生型‘260’和矮稈突變體‘87’成熟期穗部性狀可知，矮稈突變體‘87’的穗柄長(zhǎng)度、穗長(zhǎng)和千粒重相比于野生型‘260’均有下降，降幅分別為54.5%、31.8%、1.7%，見(jiàn)表2。

表2 野生型‘260’和矮稈突變體‘87’成熟期穗部性狀Table 2 Panicle characters of wild-type ‘260’ and dwarf mutant ‘87’ at mature stage

2.2 主莖剖面細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察分析

由圖3可知， 野生型‘260’和矮稈突變體‘87’縱切細(xì)胞排列均較為規(guī)則，但矮稈突變體‘87’地上第五節(jié)間中5個(gè)連續(xù)縱向細(xì)胞長(zhǎng)度為341.0 nm，明顯小于野生型‘260’的長(zhǎng)度，這表明矮稈突變體‘87’主莖的節(jié)間較短是由于細(xì)胞縱向長(zhǎng)度減小所致。矮稈突變體‘87’地上第五節(jié)間中5個(gè)連續(xù)橫向細(xì)胞長(zhǎng)度為320.0 nm，野生型‘260’的5個(gè)連續(xù)縱向細(xì)胞長(zhǎng)度為316.5 nm(圖3(c)和(d))，說(shuō)明矮稈突變體‘87’和野生型‘260’的莖稈橫切面的細(xì)胞長(zhǎng)度基本一致，因此推測(cè)矮稈突變體‘87’莖粗的增加可能是由于單位面積細(xì)胞數(shù)目增加導(dǎo)致。

(a)和(c)分別為野生型‘260’地上第五莖間縱和橫剖面結(jié)構(gòu)；(b)和(d)分別為矮稈突變體‘87’地上第五莖間縱和橫剖面結(jié)構(gòu)(a) and (c) are the longitudinal and transverse cross-sectional structure of the fifth aboveground stem of the wild-type ‘260’，respectively; (b) and (d) are the longitudinal and transverse cross-sectional structure of the fifth aboveground stem of the dwarf mutant ‘87’，respectively.圖3 成熟期野生型‘260’和矮稈突變體‘87’地上第五莖間縱、橫剖面結(jié)構(gòu)比較Fig.3 Comparison on the longitudinal and transverse cross-sectional structure of the fifth stem aboveground between wild-type ‘260’ and dwarf mutant ‘87’ at mature stage

2.3 矮稈突變體‘87’對(duì)外源GA3敏感性分析

通過(guò)不同時(shí)期對(duì)矮稈突變體‘87’噴施外源GA3及清水，并測(cè)量植株高度后可以看出，2種處理植株高度均增加，同一測(cè)定日期2種處理的株高差異不顯著(圖4)。相較于07-19株高，07-26和08-02噴施外源GA后株高增長(zhǎng)率分別為16.0%和47.4%；噴施清水后株高增長(zhǎng)率分別為24.1%和48.6%，2種處理株高的增長(zhǎng)率相近，可見(jiàn)矮稈突變體‘87’對(duì)GA3反應(yīng)不敏感。

圖4 外源GA3對(duì)矮稈突變體‘87’株高的影響Fig.4 The effect of exogenous GA3 on plant height of dwarf mutant ‘87’

2.4 內(nèi)源GA含量分析

由圖5可知，抽穗期矮稈突變體‘87’和野生型‘260’內(nèi)源GA4含量分別高于GA3含量8.1%和5.6%，且矮稈突變體‘87’內(nèi)源GA3含量和GA4含量均高于野生型‘260’，但均未達(dá)顯著水平；成熟期，矮稈突變體‘87’內(nèi)源GA1+GA3含量比野生型‘260’增加14.4%。綜上，矮稈突變體‘87’的矮化性狀可能與內(nèi)源GA含量增高有關(guān)。

內(nèi)源GA3和內(nèi)源GA4測(cè)定時(shí)期為抽穗期，內(nèi)源GA1+GA3測(cè)定時(shí)期為成熟期。The measurement period of endogenous GA3 and endogenous GA4 is the heading period, and the measurement period of endogenous GA1+GA3 is the mature period.圖5 野生型‘260’和矮稈突變體‘87’內(nèi)源GA含量測(cè)定Fig.5 Determination of endogenous GA content in wild-type ‘260’ and dwarf mutant ‘87’

3 討 論

黍子是非常容易發(fā)生倒伏的禾本科作物，加之近年黍子產(chǎn)區(qū)降雨增多、溫度升高等極端天氣的出現(xiàn)，倒伏已成為黍子生產(chǎn)中存在的普遍問(wèn)題，嚴(yán)重影響了產(chǎn)量[15]。大量研究表明，株高、節(jié)間數(shù)和節(jié)間長(zhǎng)度等因素與倒伏有極顯著相關(guān)關(guān)系[16-17]，這是因?yàn)橹旮吲c地上部鮮重呈顯著正相關(guān)，地上部鮮重越大，莖稈基部的彎曲力矩越大，越容易發(fā)生倒伏[18]。但也有一些研究者認(rèn)為株高并不是影響倒伏的主要因素，在一定株高范圍內(nèi)，株高與倒伏并沒(méi)有必然的聯(lián)系，而莖稈基部粗度及充實(shí)度的貢獻(xiàn)更大[19-20]。本研究利用EMS誘變獲得的矮稈突變體‘87’節(jié)間數(shù)與野生型‘260’基本一致，而地上各節(jié)間長(zhǎng)度和株高均顯著低于野生型‘260’，且地上第五節(jié)間的縱向細(xì)胞長(zhǎng)度顯著低于野生型‘260’，可見(jiàn)矮稈突變體‘87’的株高降低是由于細(xì)胞縱向長(zhǎng)度減小使節(jié)間長(zhǎng)度下降所致，這一結(jié)果與Yang等[21]在矮稈甜瓜上的研究結(jié)論一致；相較于野生型‘260’，矮稈突變體‘87’基部莖粗增加，且莖稈橫切片單位面積內(nèi)細(xì)胞數(shù)目增加，從而使矮稈突變體‘87’的莖稈力學(xué)性能強(qiáng)于野生型‘260’[22]，正是矮稈突變體‘87’株高和莖稈力學(xué)性能上的改善，使其抗倒伏性優(yōu)于野生型‘260’。

矮稈突變體植株常常由于赤霉素的生物合成或信號(hào)傳導(dǎo)缺陷在表型上表現(xiàn)出矮化、分蘗增多、葉色變深、開(kāi)花推遲、花發(fā)育異常、產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成下降等變異[23-25]，這和本研究中獲得的矮稈突變體‘87’表型變化基本一致，成熟期矮稈突變體‘87’與野生型‘260’相比，株高下降、分蘗數(shù)增加，穗長(zhǎng)、千粒重顯著下降。通過(guò)對(duì)矮稈突變體‘87’施加外源激素及內(nèi)源激素含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，矮稈突變體‘87’在施加外源GA3后，株高變化與對(duì)照清水處理基本一致，且抽穗期內(nèi)源GA3和GA4含量及成熟期內(nèi)源GA1+GA3含量均高于野生型‘260’，其中成熟期內(nèi)源GA差異達(dá)顯著水平。這一結(jié)果與GA3鈍感型植株研究結(jié)果一致，當(dāng)施加外源GA后，植株表型沒(méi)有明顯響應(yīng)，不能恢復(fù)野生型表型[26]，且內(nèi)源活性GA水平高于野生型或與野生型相當(dāng)[27-28]。因此，推斷矮稈突變體‘87’是由于GA合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)生變化導(dǎo)致植株矮化，是一個(gè)GA不敏感性矮化突變體，有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，矮稈突變體‘87’由于莖稈縱向細(xì)胞數(shù)目減少，節(jié)間長(zhǎng)度下降，使其株高降低；由于莖稈橫向數(shù)目增加，使其莖稈變粗，從而增強(qiáng)抗倒伏性能。抽穗期和成熟期突變體‘87’植株內(nèi)源活性GA水平均高于野生型。因此，矮稈突變體‘87’可以作為黍子矮化育種的種質(zhì)材料。