腺相關(guān)病毒載體的研究進(jìn)展

陳平，張利娟 綜述，李娜 審校

嘉銘（固安）生物科技有限公司，河北 廊坊 065504

20 世紀(jì)80 年代發(fā)展起來的一種新型疾病治療方式——基因治療，是以改變或糾正人的遺傳物質(zhì)為基礎(chǔ)，將人正?；蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^相應(yīng)的載體導(dǎo)入人體靶細(xì)胞，以發(fā)揮糾正或補(bǔ)償有缺陷基因的作用，從而達(dá)到治療相應(yīng)疾病的目的。病毒載體是基因治療中最常采用的工具之一。腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）載體因其轉(zhuǎn)染效率高［1］，安全性高［2］，已成為目前基因治療中應(yīng)用最廣泛的病毒載體之一，特別是在2012 年，由荷蘭生物技術(shù)公司Uniqure 研發(fā)的第一個(gè)針對(duì)脂蛋白脂肪酶缺乏癥（lipoprotein lipase deficiency，LPLD）的基因藥物Glybera 通過歐盟認(rèn)證，并獲得歐洲首個(gè)被推薦上市的基因治療藥物以來，AAV 載體作為基因治療的載體引起了越來越多研究者的關(guān)注。本文就AAV 的發(fā)現(xiàn)與生物學(xué)特性、重組AAV（rAAV）載體的設(shè)計(jì)、AAV 在臨床基因治療中的應(yīng)用及其可能引發(fā)的不良反應(yīng)作一綜述，并對(duì)目前該病毒載體存在的問題及今后的研究方向進(jìn)行展望。

1 AAV 的發(fā)現(xiàn)與生物學(xué)特性

AAV 最初是以一種污染成分被發(fā)現(xiàn)的，目前已分離到13 種血清型：AAV1 ～AAV13。這13 種血清型在系統(tǒng)進(jìn)化樹中的相似性和差異性見圖1。此外，這些血清型的AAV 在衣殼氨基酸序列水平上也有很大差異，見表1。

表1 血清型AAV1 ～AAV13 衣殼同源性比較（%）Tab.1 Homology of capsids of AAV serotypes 1 to 13（%）

圖1 AAV 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of AAV

AAV 隸屬于細(xì)小病毒科依賴病毒屬，是一類微小、無被膜的線性單鏈DNA 病毒［3］。其基因組大小約4 700 bp，直徑20 ～26 nm。AAV 為一種缺陷型病毒，需要輔助病毒（腺病毒輔助功能基因包括E1a、E1b、E2a、E4orf6 和VA RNA，皰疹病毒輔助功能基因UL5、UL8、UL22、UL9 及調(diào)節(jié)蛋白ICP0、ICP4、ICP22［4］）等的存在，才能感染宿主細(xì)胞，產(chǎn)生新的病毒顆粒，無輔助病毒存在時(shí)，野生型AAV 只能整合到19 號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，形成潛伏感染，隨宿主細(xì)胞染色體復(fù)制而復(fù)制［3］。

AAV 基因組主要由反向重復(fù)序列（inverted terminal repeats，ITRs）和2 個(gè)ITR 之間的2 個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）組成，左側(cè)ORF 編碼Rep78、Rep68、Rep52 和Rep40，右側(cè)ORF 編碼3 個(gè)衣殼蛋白VP1（相對(duì)分子質(zhì)量87 000）、VP2（相對(duì)分子質(zhì)量72 000）、VP3（相對(duì)分子質(zhì)量62 000）［3］。AAV 衣殼由60 個(gè)衣殼蛋白構(gòu)成，排列成T = 1 的二十面體結(jié)構(gòu)［5］。

2 rAAV 載體

rAAV 載體通常是將野生型AAV（Wt-AAV）中的rep 和cap 基因被用于研究的目的基因所取代，只保留AAV 基因組兩端的2 個(gè)ITRs。rAAV 載體作為目前最受歡迎的載體，相較于其他病毒載體的優(yōu)缺點(diǎn)見表2。

表2 不同病毒載體系統(tǒng)的比較Tab.2 Comparison of different viral vector systems

2.1 rAAV 載體的設(shè)計(jì)

目前關(guān)于rAAV 載體的設(shè)計(jì)主要集中在兩方面：一方面是關(guān)于rAAV 衣殼改造設(shè)計(jì)，另一方面是rAAV 載體構(gòu)建的設(shè)計(jì)。

2.1.1 rAAV 衣殼的改造設(shè)計(jì)

自rAAVs 顯示出良好的臨床應(yīng)用前景以來，人們?cè)噲D通過設(shè)計(jì)新型rAAV 衣殼來獲得其新的特性。衣殼改造的方法主要包括：自然發(fā)現(xiàn)、合理設(shè)計(jì)、定向改造和計(jì)算機(jī)生物信息學(xué)。

2.1.1.1 自然發(fā)現(xiàn) 如前所述，AAV 最初是作為一種細(xì)胞培養(yǎng)污染物被發(fā)現(xiàn)的，AAV2 是應(yīng)用最為廣泛的血清型。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，最具臨床前景的載體血清型是從自然界中分離出來的［6］。該觀點(diǎn)主要體現(xiàn)在從人的肝臟組織中分離出來的AAV9 上，AAV9是F 血清型分支，具有繞過血腦屏障（blood brain barrier，BBB）轉(zhuǎn)導(dǎo)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的能力。如最近備受關(guān)注的人類衍生的F 衣殼分支是從CD34+人類外周血造血干細(xì)胞中分離出來的，顯示出無核酸酶基因編輯的能力［7］。

2.1.1.2 合理設(shè)計(jì) 改造載體衣殼的主要途徑是合理設(shè)計(jì)，這種策略始于多肽（與細(xì)胞特異性受體結(jié)合的多肽序列）序列的簡(jiǎn)單拼接［8］。其他方法是將多肽序列融合至VP2 的氨基末端［9］，如單鏈可變片段［10］和設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)序列［11］，對(duì)細(xì)胞表面進(jìn)行標(biāo)記類似于抗體識(shí)別。此外，普遍認(rèn)為3 倍突起在衣殼的靶向性和免疫原性方面起重要作用，因此，3 倍突起的暴露位置是多肽插入（增強(qiáng)受體結(jié)合）的理想位置。該方法不僅可重新定向衣殼，而且具有抑制免疫反應(yīng)的能力。雖然對(duì)衣殼結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理的改造可改善其靶向性，但也會(huì)對(duì)衣殼的穩(wěn)定性等其他特性產(chǎn)生負(fù)面影響。而點(diǎn)擊化學(xué)的引入可對(duì)病毒粒子組裝后的衣殼進(jìn)行修飾，通過點(diǎn)擊化學(xué)氨基酸的方法可使寡核苷酸位點(diǎn)特異性地偶聯(lián)到AAV 衣殼表面，從而有效地保護(hù)AAV 顆粒不受中和抗體的吞噬［12］。

2.1.1.3 定向改造 合理設(shè)計(jì)方法的局限性是對(duì)AAV 細(xì)胞表面結(jié)合、內(nèi)化、轉(zhuǎn)運(yùn)、脫殼和基因表達(dá)的認(rèn)識(shí)不足。新方法即定向改造更有優(yōu)勢(shì)。定向改造的基礎(chǔ)在于對(duì)自然進(jìn)化的模擬，衣殼在自然選擇壓力下產(chǎn)生具有特定生物學(xué)特性的遺傳變異（如組織特異性、免疫逃逸和轉(zhuǎn)基因表達(dá)）［6］。衣殼文庫(kù)的定向進(jìn)化不需要事先了解改造過程中所涉及的分子機(jī)制［13］。如通過3 倍突起處嵌入多肽序列文庫(kù)進(jìn)行反復(fù)的體外篩選，獲得了具有顯著重定向取向的衣殼［14］。許多研究也利用該方法從已存在的主要血清型序列中隨機(jī)產(chǎn)生了嵌合衣殼（衣殼重組）［16］。值得注意的是最近開發(fā)的rAAV 載體，其可優(yōu)先靶向HIV-1 感染的H9 T 細(xì)胞系［16］。其中較顯著的定向改造方法是基于Cre 重組的改造［14］。該方法采用在3 倍突起的位置插入隨機(jī)多肽片段，依靠Cre 重組酶來修復(fù)設(shè)計(jì)到載體基因組中的反向聚腺苷酸序列。利用該方法進(jìn)化出的衣殼突變體能夠繞過血腦屏障高效轉(zhuǎn)導(dǎo)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)［17］。

2.1.1.4 計(jì)算機(jī)生物信息學(xué) 使用計(jì)算機(jī)工具大大提高了載體的設(shè)計(jì)方法，該方法不需要完全理解AAV 衣殼的生物學(xué)特性。近年來，運(yùn)用計(jì)算機(jī)生物信息學(xué)改造新型衣殼的方法受到廣泛關(guān)注。利用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)了載體Anc80L65，在小鼠肝臟、骨骼肌、視網(wǎng)膜和耳蝸中具有很好的轉(zhuǎn)導(dǎo)療效［18］。最新的研究表明，人工合成的AAV2.7m8 載體感染外耳毛細(xì)胞的效率高于Anc80L65［19］。

2.1.2 rAAV 載體構(gòu)建的設(shè)計(jì)

典型的rAAV 載體的設(shè)計(jì)通常均攜帶1 個(gè)基因表達(dá)盒，其中包括1 個(gè)啟動(dòng)子、1 個(gè)轉(zhuǎn)基因和1個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。一旦載體被傳遞到靶細(xì)胞核，這些成分就相互作用表達(dá)具有治療水平的基因產(chǎn)物?；虮磉_(dá)盒的設(shè)計(jì)應(yīng)滿足治療基因的要求（如轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平，包裝容量）。在設(shè)計(jì)rAAV 載體時(shí)，應(yīng)考慮衣殼與基因組之間的協(xié)同作用，最終需設(shè)計(jì)出一種衣殼和載體基因組的最優(yōu)組合，以達(dá)到成功治療人類疾病的目的。

2.1.2.1 調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和特異性 rAAV 基因治療平臺(tái)通常利用1 個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的高表達(dá)，其中包括巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）啟動(dòng)子和CB7 啟動(dòng)子［20］，以及其他一些可增強(qiáng)基因表達(dá)的調(diào)控元件，如內(nèi)含子［21］和土撥鼠肝炎轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（woodchuck hepatitis post-transcriptional regulation element，WPRE）［22］。在人類細(xì)胞中，為了產(chǎn)生穩(wěn)定的蛋白表達(dá)，密碼子優(yōu)化技術(shù)被廣泛應(yīng)用于rAAV 基因治療，旨在提高rAAV 基因的表達(dá)水平［23-24］。在翻譯水平上，Kozak 序列可進(jìn)一步增加蛋白表達(dá)［23］。但蛋白質(zhì)或RNA 分子的過表達(dá)可能對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的毒性，如由強(qiáng)U6 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的shRNA 與內(nèi)源性microRNA（miRNA）的過表達(dá)導(dǎo)致小鼠死亡，可通過使用較弱的H1 啟動(dòng)子來改善［25］。另外，基于PolⅡ啟動(dòng)子的人工micro-RNAs（amiRs）表達(dá)新平臺(tái)為平衡蛋白的表達(dá)提供了一種更為通用的解決策略［26-27］。表達(dá)特異性是基因治療的另一個(gè)重要方面。在異常組織或細(xì)胞中的基因表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性或引發(fā)不必要的免疫反應(yīng)。從rAAV 載體基因組設(shè)計(jì)的角度來看，更好地限制基因表達(dá)的方法包括使用組織或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子［28］，以及在3′未翻譯區(qū)域（UTR）整合miRNA結(jié)合位點(diǎn)，以達(dá)到調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的目的［29］。

2.1.2.2 對(duì)較大轉(zhuǎn)基因所采取的策略 與其他病毒載體相比，AAV 載體的局限性是其包裝容量較?。? 000 bp 包括ITRs）。目前已研究出幾種策略可轉(zhuǎn)導(dǎo)較大的治療基因。研究表明，采用AAV 雙載體的方法（rAAV、反式剪接以及雜合［30-31］）可將AAV 的包裝容量增加至10 000 bp，triple AAV 載體的設(shè)計(jì)可轉(zhuǎn)導(dǎo)14 000 bp 的DNA［32］。且已通過實(shí)驗(yàn)證明，雙AAV 載體系統(tǒng)向哺乳動(dòng)物內(nèi)茸毛細(xì)胞（inner hair cell，IHC）傳遞otoferlipn 大型轉(zhuǎn)基因，可部分恢復(fù)聽覺功能［22］。利用反式剪接和雜交的triple AAV 載體，在視網(wǎng)膜中表達(dá)了全長(zhǎng)CDH23 和ALMS1［33］。雜交AAV 載體已成功用于移植大型治療基因，包括ABCA4［34］、RPE65［35］、ABCA4［36］和dysferlin［37］，利用該策略相較于其他方法有更好的臨床應(yīng)用機(jī)會(huì)。除此之外，還有研究采用設(shè)計(jì)1 個(gè)縮短版的基因，來編碼1 個(gè)被截短但有功能的蛋白質(zhì)的策略。人類抗?fàn)I養(yǎng)不良蛋白（duchenne muscular dystrophy，DMD）基因的整個(gè)編碼序列為11 500 bp，遠(yuǎn)超過了rAAV 的包裝極限。對(duì)DMD 蛋白的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其可產(chǎn)生幾種更小的形式，再用rAAV進(jìn)行包裝［38］。開發(fā)適合rAAV 傳遞的微基因可能需要深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，具有基因特異性。針對(duì)DMD 的微基因療法仍在進(jìn)行廣泛的臨床評(píng)估［38］。

2.1.2.3 延長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)所采取的策略 盡管rAAV是基因治療的理想載體，但其主要以非復(fù)制型游離基因組形式存在。因此，轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體基因組在有絲分裂細(xì)胞中逐漸丟失。近年來，一直在尋找復(fù)制細(xì)胞中保留轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法。延長(zhǎng)復(fù)制型細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)最直接的方法是促進(jìn)rAAV 基因組整合。rAAV 基因組被發(fā)現(xiàn)以低頻率整合［12］。這種罕見的整合事件通常導(dǎo)致部分基因組整合，因此不適用于基因治療。基因編輯可通過針對(duì)性地對(duì)基因組進(jìn)行整合來增強(qiáng)其持久性。一旦可編程核酸酶在靶基因組位點(diǎn)中引入DNA 斷裂，宿主細(xì)胞的同源性定向修復(fù)（homology-directed repair，HDR）功能即可利用rAAV 基因組作為供體模板，將治療性基因盒精確地插入宿主基因組中［39］。此外，無核酸酶的同源重組定向整合作為基因編輯的替代方法最近也受到廣泛關(guān)注［6，40］。通過這種方式，無需通過核酸酶引入DNA 斷裂即可實(shí)現(xiàn)序列的穩(wěn)定整合。另外，還有研究將支架／ 基質(zhì)附著區(qū)（S ／ MAR）序列插入到構(gòu)建體中，使游離形式的AAV 在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中復(fù)制，從而延長(zhǎng)載體存在的持久性［41］。

2.2 rAAV 載體的轉(zhuǎn)染與包裝 rAAV 載體設(shè)計(jì)成功后，需通過轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法采用雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染：將一種含有rAAV 載體及一種含有rep ／ cap 基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293、A549 或HeLa 細(xì)胞，再感染輔助病毒［42］。由于該方法會(huì)有輔助病毒的污染，目前通常采用3 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法：1 個(gè)含有包裝信號(hào)和目的基因的病毒載體質(zhì)粒、1 個(gè)含有腺病毒輔助基因形成的輔助質(zhì)粒及由結(jié)構(gòu)基因cap 和非結(jié)構(gòu)基因rep 組成的質(zhì)粒，將這3 個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)E1a、E1b 輔助病毒基因的包裝細(xì)胞系HEK293，就即可產(chǎn)生具有感染活性的rAAV。

在rAAV 的包裝過程中，多采用多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法，最常用的宿主細(xì)胞是HEK293 細(xì)胞［22，33，43］。細(xì)胞基因組內(nèi)不含E1a 和E1b 的HeLa 細(xì)胞及A549細(xì)胞是制備高穩(wěn)定和高生產(chǎn)率常用的細(xì)胞系，主要缺點(diǎn)是有輔助病毒污染。幼地鼠腎細(xì)胞（BHK）也可被用于生產(chǎn)rAAV 的宿主細(xì)胞，但由于該細(xì)胞是非人源性細(xì)胞的特性，限制了其應(yīng)用范圍，目前僅應(yīng)用于HSV 雜合病毒的生產(chǎn)［44］。草地貪夜蛾（SF9）細(xì)胞用于rAAV 的生產(chǎn)是近年的研究熱點(diǎn)［45］，目前最大的生產(chǎn)系統(tǒng)是利用SF9 作為宿主細(xì)胞的rAAV 生產(chǎn)系統(tǒng)。

2.3 rAAV 載體的純化 rAAV 的分離純化方法主要包括梯度離心和色譜技術(shù)。rAAV 的梯度離心純化較常用的是氯化銫（CsCl）密度梯度離心法［33］和碘克沙醇［22］。色譜技術(shù)包括親和色譜層析、離子交換色譜。親和色譜基于rAAV 衣殼與色譜基質(zhì)上耦合特異的生物配體或受體進(jìn)行可逆作用，將病毒顆粒與雜蛋白、DNA 分離，優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合容量大、分辨率高、回收率高，缺點(diǎn)是特異性強(qiáng)，不適用于每一種血清型rAAV［42］。為了解決此問題，相關(guān)研究人員利用DNA 重組技術(shù)對(duì)病毒衣殼蛋白進(jìn)行修飾，再利用親和層析進(jìn)行分離純化。親和色譜層析不能區(qū)分空心病毒顆粒和實(shí)心rAAV 載體，空心病毒在包裝單鏈DNA 后等電點(diǎn)降低，可通過高分辨率的離子交換方法與rAAV 載體分離［46］。

3 rAAV 載體在臨床基因治療中的應(yīng)用

自1983 年首次開發(fā)rAAV 載體以來，在基因治療方面已取得了很大進(jìn)展，主要體現(xiàn)在兩方面：rAAV載體種類（新型載體的發(fā)現(xiàn)和現(xiàn)有載體的改造）和臨床治療疾病種類擴(kuò)展（由遺傳性疾病到基因缺陷?。?。首先，AAV 的載體類型由單一的rAAV2 擴(kuò)展到rAAV1、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9等，并出現(xiàn)了一批有顯著治療效果的AAV 載體；其次，在臨床實(shí)驗(yàn)上，治療疾病的種類有很大發(fā)展，從最初的針對(duì)于單基因遺傳病［如肺囊性纖維化（cystic pulmonary fibrosis，CPF）和血友病B 等］，發(fā)展到眼部疾病、關(guān)節(jié)炎、腫瘤、肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、神經(jīng)性疾病以及血液性疾病等一系列基因缺陷病，見表3。

表3 AAV 載體基因治療藥物的臨床試驗(yàn)Tab.3 Clinical trials of adenoviral vectors as drugs for gene therapy

3.1 眼部方面的疾病 對(duì)于眼部疾病早先是利用腺病毒載體進(jìn)行治療，如PING 等［47］利用高容量的腺病毒載體治療年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）。近年來，由于rAAV 載體的優(yōu)勢(shì)，出現(xiàn)了多項(xiàng)以rAAV 為基因治療載體治療視網(wǎng)膜色素變性、萊伯氏先天性黑蒙以及缺血性視網(wǎng)膜疾病的臨床試驗(yàn)。其中，rAAV 介導(dǎo)的RPE65基因治療萊伯氏先天性黑蒙于2018 年1 月獲得FDA 批準(zhǔn)。這是美國(guó)第一個(gè)針對(duì)單一基因突變疾病的臨床基因治療藥物。在臨床研究上發(fā)現(xiàn)，由rAAV介導(dǎo)的基因治療藥物未引起嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，也未出現(xiàn)明顯的毒副作用，并對(duì)患者的視力恢復(fù)起到了一定的作用［48］。這些研究表明，rAAV 載體是基因治療中最有前景的基因轉(zhuǎn)移載體，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于rAAV 應(yīng)用于眼部治療的研究已在多方面開展，相信經(jīng)過進(jìn)一步的深入研究，利用rAAV 進(jìn)行眼部治療將會(huì)有更多的突破。

3.2 聽覺神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病 在聽覺神經(jīng)系統(tǒng)的基因治療研究中，較常用的AAV 載體包括AAV2、AAV1、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、Anc80L65［49-52］。雖然在人類內(nèi)耳基因治療中尚無臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，但臨床前動(dòng)物研究已表明，以rAAV 作為基因治療載體是有效的。如SUZUKI 等［52］的一項(xiàng)研究表明，利用Anc80L65 載體可提高毛細(xì)胞存活率，有效恢復(fù)耳蝸聽覺皮層神經(jīng)反應(yīng)和前庭刺激行為反應(yīng)。截至目前，僅有一項(xiàng)正在進(jìn)行的人類臨床實(shí)驗(yàn)旨在研究人類內(nèi)耳細(xì)胞中rAAV 的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率［53］（https：／ ／clinicaltrials.gov ／ ct2 ／ show ／ NCT03996824）。

rAAV 介導(dǎo)的基因藥物除了用于治療上述疾病外，還應(yīng)用于其他多種基因缺陷性疾病的治療，包括血液系統(tǒng)疾?。ㄑ巡。?、腫瘤、皮膚與肌肉系統(tǒng)疾?。I(yíng)養(yǎng)不良癥）、關(guān)節(jié)炎、糖尿病等。

4 AAV 可能引起的不良反應(yīng)

AAV 在進(jìn)行動(dòng)物和人類臨床實(shí)驗(yàn)時(shí)，可能會(huì)引起不良反應(yīng)。首先是免疫反應(yīng)，當(dāng)rAAV 感染抗原呈遞細(xì)胞時(shí)，由于Toll 樣受體9（Toll like receptor 9，TLR9）的激活，可引起溫和的先天免疫反應(yīng)，TLR9識(shí)別核酸中未甲基化的CpG，從而激活經(jīng)典通路和非經(jīng)典NF-κB 通路，促使炎細(xì)胞因子和干擾素應(yīng)答基因的表達(dá)。這些基因的表達(dá)反過來會(huì)產(chǎn)生CTL反應(yīng)和穩(wěn)定的中和抗體效價(jià)［4］。為避免AAV 介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移所引起的免疫反應(yīng)，目前常用的方法有以下兩種：①用免疫抑制藥物，以避免CTL 反應(yīng)，這在人類因子Ⅸ試驗(yàn)中取獲得了成功［54］；②在設(shè)計(jì)rAAV 載體時(shí)，加入TLR9 抑制的DNA 序列，如將來自人類端粒的TTAGGG 的多拷貝整合至rAAV 基因組中，以逃避先天免疫反應(yīng)［1］。

第2 種不良反應(yīng)是可能會(huì)引起插入誘變和誘導(dǎo)癌癥。NGUYEN 等［55］利用AAV 基因療法治療狗的血友病A 時(shí)發(fā)現(xiàn)，AAV 攜帶的治療性基因片段（FⅧ）已整合至狗肝臟細(xì)胞的基因組，有些甚至整合在影響細(xì)胞生長(zhǎng)的基因附近，這些狗的某些肝臟細(xì)胞分裂得比其他細(xì)胞更快，并形成子細(xì)胞團(tuán)塊。因此，他們懷疑這些基因插入物激活了生長(zhǎng)相關(guān)基因，使得這些肝臟細(xì)胞更為快速地分裂。這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)了AAV 基因療法會(huì)將基因片段整合至宿主細(xì)胞染色體上，雖然整合頻率不高，但仍有潛在致癌性，可能誘發(fā)癌癥。

第3 種不良反應(yīng)是靜脈高劑量注射AAV 會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重毒性。HINDERER 等［56］研究發(fā)現(xiàn)，高劑量AAV 注射后，在恒河猴和仔豬中均引起了嚴(yán)重的毒性。3 只恒河猴出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)氨酶升高。2 只轉(zhuǎn)氨酶升高后消退，無臨床后遺癥，而有1 只發(fā)生急性肝衰竭和休克。

5 展 望

雖然rAAV 載體在人類基因治療過程中取得了一些成果，但rAAV 最終應(yīng)用于臨床治療尚有一些亟待解決的問題。首先，目前rAAV 載體存在兩個(gè)缺陷：載體容量小和輔助基因污染，針對(duì)這些問題，若能開發(fā)出大容量，且能用于擴(kuò)大生產(chǎn)和應(yīng)用于臨床的rAAV 載體，篩選出包裝rAAV 所需的所有輔助基因均由包裝的細(xì)胞來提供的細(xì)胞系，可避免輔助基因的污染；其次，隨著AAV 血清型的多樣性和新型AAV 載體的不斷開發(fā)，將帶來其安全性問題；最后，rAAV 的大規(guī)模生產(chǎn)、純化能否達(dá)到臨床治療所需的劑量也是將來載體應(yīng)用中需要考慮的問題。相信后續(xù)隨著rAAV 載體研究的不斷深入，作為基因治療最常用的載體之一，其應(yīng)用前景將更加廣闊。