羅紫蝶，郭少娟，曾 晨，張元元，王睿虹，楊立新

中國環(huán)境科學(xué)研究院，環(huán)境基準與風(fēng)險評估國家重點實驗室，北京 100012

鎘是環(huán)境中具有極強毒性的重金屬污染物之一，屬于人體非必需的微量金屬，被廣泛用于金屬冶煉、塑料制造、涂料及電池等行業(yè)[1-2]. 聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署把鎘列為重點環(huán)境污染物[3]. 鎘通常以離子形式廣泛存在于生產(chǎn)和生活環(huán)境中. 工業(yè)生產(chǎn)是鎘人為排放的主要來源，電子拆解地PM10中污染物的致癌風(fēng)險大部分由鎘引起[4]. 我國土壤鎘污染較嚴重[5-6]，長江流域及東南沿海地區(qū)的水稻田鎘含量平均值為0.52 mg/kg[7]，超過GB 15618—2018《農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標準(試行)》標準限值(0.30 mg/kg). 鎘不易被降解，會隨廢水、廢氣不斷釋放到環(huán)境中，導(dǎo)致環(huán)境負擔(dān)不斷增加，并可進入食物鏈.

鎘一般通過呼吸、皮膚吸收和飲食進入生物體并產(chǎn)生累積[8]，從而對生物體產(chǎn)生毒性效應(yīng). 長期暴露于鎘可導(dǎo)致肝毒性[9]、腎毒性[10]、骨骼毒性[11]及癌癥[12]. 研究表明，孕期接觸鎘不但影響胎盤的發(fā)育和功能，還會通過胎盤進入胎兒體內(nèi)，干擾胎兒的正常發(fā)育[13]，影響語言和認知能力[14]. 低劑量的鎘導(dǎo)致小鼠腸道微生物群改變，加速肝臟脂質(zhì)代謝，造成終生代謝異常[15]. 長期鎘溶液暴露將激活玉米螟幼蟲金屬硫蛋白基因Mtn的表達，抑制抗氧化基因Cat和GPx的表達；同時顯著提高幼蟲的脂質(zhì)過氧化水平，降低幼蟲的發(fā)育速度和成活率[16]. 鎘暴露導(dǎo)致黑腹果蠅幼蟲體長縮短、體重減少，抑制baz和tj等與發(fā)育相關(guān)基因的表達，這些影響會傳遞給未暴露的后代[17].

斑馬魚胚胎具有體外發(fā)育、發(fā)育速度快和胚胎透明等優(yōu)點[18]，廣泛用于研究污染物對生物體的發(fā)育毒性[19]. 斑馬魚胚胎對鎘的敏感性較強，暴露于3.00 mg/L鎘96 h導(dǎo)致斑馬魚胚胎孵化延遲、小頭、心率降低、體節(jié)缺失，且對外界刺激不敏感等[20]. 鎘暴露抑制斑馬魚胚胎atp2b1a、pth1、stc1等與Ca2+調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，影響胚胎的耳石發(fā)育，導(dǎo)致游泳活動受損[21]. 鎘暴露影響斑馬魚胚胎中后腦發(fā)育，抑制ngn1、zash1a、zash1b和NeuroD的表達，影響神經(jīng)元分化，最終產(chǎn)生神經(jīng)毒性[22]. 暴露于35.60 μmol/L鎘會抑制nanos、piwi、dazl等生殖調(diào)控基因的表達，影響早期生殖細胞的數(shù)量和遷移，造成生殖毒性[23-24].

鎘具有胚胎發(fā)育毒性，然而鎘產(chǎn)生發(fā)育毒性的關(guān)鍵因素尚不明晰. 因此，該研究在前期試驗[25]基礎(chǔ)上，用5個不同鎘濃度暴露的斑馬魚胚胎分析鎘暴露的濃度-效應(yīng)關(guān)系. 選取與氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)錄翻譯和早期神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的prdx1、gstp1.2、atf3、jdp2b、hsp70l、hsp90aa1.1、eif4a1b和fabp7a基因，結(jié)合原位雜交和定量PCR方法，探究暴露于7.50 mg/L鎘對上述基因在斑馬魚胚胎組織和器官表達的影響，揭示鎘影響早期胚胎發(fā)育過程的分子事件，以期為闡明鎘產(chǎn)生胚胎發(fā)育毒性的機制提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 斑馬魚

野生AB型斑馬魚購于中國國家斑馬魚研究中心，培養(yǎng)于中國環(huán)境科學(xué)研究院循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京佰安智能科技有限公司). 培養(yǎng)條件：溫度為(28.5±0.5) ℃；pH為7.0±0.5；光暗循環(huán)為14 h/10 h；早晚喂食豐年蝦兩次. 產(chǎn)卵前一天，將雄魚和雌魚以2∶1的比例置于產(chǎn)卵盒中收集受精卵. 胚胎用ISO15088標準配制的水溶液(294.00 mg/L CaCl2·2H2O, 123.30 mg/L MgSO4·7H2O, 63.30 mg/L NaHCO3, 5.50 mg/L KCl)培養(yǎng). 斑馬魚胚胎發(fā)育階段按照斑馬魚胚胎發(fā)育分期[26]進行區(qū)分.

1.2 儀器與試劑

儀器包括體視顯微鏡(日本尼康公司，SMZ 745型)、熒光顯微鏡(德國徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，M165 FC型)、常規(guī)PCR儀(美國BIO-RAD)、熒光定量PCR儀(美國Thermo，7300 Plus型). 試劑包括CdCl2(西亞試劑)、限制性內(nèi)切酶CeuⅠ/SacⅠ/SacⅡ及T7/SP6轉(zhuǎn)錄酶(美國Sigma)、DNA聚合酶和定量PCR試劑盒(美國Promega)、TRLzol(美國Ambion)、DIG-RNA及anti-DIG-AP、硝基藍四氯唑(NBT)、4-氯-3-酰磷酸溴(BCIP，瑞士Roche).

1.3 鎘暴露對斑馬魚胚胎的影響研究

1.3.1 基因克隆

用NCBI引物設(shè)計方法獲取擴增prdx1、gstp1.2、atf3、jdp2b、hsp70l、hsp90aa1.1、eif4a1b、fabp7a基因的引物. 引物由北京金唯智測序公司制備. 將上述基因擴增、回收DNA，克隆到T-載體上(參照Promega的標準方法). 挑選并培養(yǎng)陽性細菌，提取質(zhì)粒，測序驗證目的基因.

1.3.2 胚胎暴露

按照OECD236標準方法，設(shè)置5個濃度，計算鎘的半致死濃度(LC50). 根據(jù)LC50數(shù)據(jù)，設(shè)置暴露組CdCl2濃度為7.50 mg/L，該濃度能產(chǎn)生可觀察的發(fā)育異常，同時導(dǎo)致胚胎死亡率低于5%. 胚胎于生物培養(yǎng)箱28.5 ℃下培育2～4 h后，挑選發(fā)育正常的胚胎進行暴露試驗，暴露時間為4～48 hpf (hours post fertilization, 受精后小時).

1.3.3 原位雜交

按照實驗室建立的方法[27]進行原位雜交試驗，即用限制性內(nèi)切酶酶切回收目的基因，用SP6/T7轉(zhuǎn)錄酶合成插入地高辛標記的RNA探針，溶解于50 μL雜交液，并保存于—20 ℃?zhèn)溆?

收集48 hpf的對照和鎘暴露斑馬魚胚胎(16～25個)，去除絨毛膜，BT-fix溶液固定24 h，經(jīng)甲醇脫水后，保存于甲醇溶液，—20 ℃保存?zhèn)溆? 固定胚胎經(jīng)清洗，蛋白酶K處理后，加入制備的探針，65 ℃雜交16 h. 梯度濃度SSC緩沖液清洗，加入anti-DIG-AP后4 ℃培育16 h. 用1×PBST清洗后，使用BCIP/NBT溶液染色. 體視顯微鏡拍攝染色照片.

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.3.4 定量PCR

收集48 hpf的對照和鎘暴露的斑馬魚(每組60個)，TRLzol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，每組3個生物學(xué)重復(fù)，進行定量PCR，反應(yīng)條件：95 ℃維持2 min；95 ℃維持30 s、55 ℃維持30 s、72 ℃維持1 min，循環(huán)30次；72 ℃維持5 min，4 ℃維持30 s.引物序列如表1所示.

表1 定量PCR引物序列Table 1 Gene quantitative PCR primer sequences

用IBM SPSS 20軟件進行統(tǒng)計分析，計算鎘的LC50及95%置信區(qū)間. 選擇在斑馬魚胚胎中表達量穩(wěn)定的GAPDH基因作為內(nèi)參基因，用2—△△Ct相對定量計算方法定量分析基因表達差異. 通過GraphPad Prism 8軟件，采用One-way ANOVA對目的基因的表達差異進行分析(P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著).

2 結(jié)果與討論

2.1 鎘暴露對斑馬魚胚胎的半致死濃度

通過暴露試驗，計算得到鎘暴露對斑馬魚胚胎120 hpf的半致死濃度，并通過體視顯微鏡觀察到斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng). 根據(jù)3次重復(fù)試驗結(jié)果，繪制鎘的濃度-效應(yīng)關(guān)系曲線〔見圖1(a)〕，當胚胎死亡率達到50%時，對應(yīng)的鎘濃度為15.20 mg/L. 暴露于20.00 mg/L鎘4～48 hpf的斑馬魚胚胎存在頭部和眼睛變小、體長縮短、軀干彎曲、卵黃囊異常以及心臟發(fā)育異常等畸形形態(tài)〔見圖1(b)(c)〕.

圖1 鎘暴露對斑馬魚胚胎的影響Fig.1 Effects of cadmium on zebrafish embryos

2.2 鎘暴露影響基因在斑馬魚胚胎組織中的表達

選擇暴露于7.50 mg/L鎘的胚胎分析暴露48 hpf后，基因在斑馬魚胚胎組織和器官中的表達情況，發(fā)現(xiàn)鎘主要誘導(dǎo)基因在神經(jīng)組織、視網(wǎng)膜、晶狀體，嗅球、側(cè)線、心臟以及皮膚等組織和器官中異常表達 .對照組胚胎prdx1基因主要在下丘腦表達〔見圖2和圖3(a)〕，鎘暴露導(dǎo)致prdx1基因在嗅球、側(cè)線器官和上皮細胞的異常表達〔見圖2和圖3(a′)〕. 相較于對照，鎘導(dǎo)致gstp1.2基因在下頜和側(cè)線及血細胞中表達異?！惨妶D2和圖3(b)(b′)〕. 鎘誘導(dǎo)atf3基因在中后腦間隔、心包區(qū)域和嗅球異常表達，在胸鰭原基和尾鰭原基中表達量上升〔見圖2和圖3(c)(c′)〕.jdp2b基因在鎘暴露胚胎的上皮細胞、胸鰭原基、心包區(qū)域、側(cè)線和尾鰭原基處表達異?！惨妶D2和圖3(d)(d′)〕.鎘誘導(dǎo)hsp70l基因在嗅球和體節(jié)肌肉異常表達，同時在眼睛晶狀體和脊索中表達量上升〔見圖2和圖3(e)(e′)〕.在鎘暴露的胚胎中，hsp90aa1.1基因在胚胎的嗅球、眼睛晶狀體和下頜肌肉表達異常，同時在中后腦間隔、胸鰭肌肉和體節(jié)肌肉中表達上升〔見圖2和圖3(f)(f′)〕.鎘導(dǎo)致eif4a1b在頂蓋、視網(wǎng)膜、晶狀體、下頜、胸鰭原基和體節(jié)肌肉中異常表達〔見圖2和圖3(g)(g′)〕.鎘誘導(dǎo)fabp7a基因在端腦、中后腦、延髓以及眼睛表達量上升，在脊髓和脊索出現(xiàn)異常表達〔見圖2和圖3(h)(h′)〕.

圖2 對照組和鎘暴露組斑馬魚胚胎基因表達情況Fig.2 The gene expression organs of zebrafish embryos in control and exposed to cadmium

圖3 鎘暴露組斑馬魚胚胎基因頭部異常表達現(xiàn)象Fig.3 The changes in gene expression at anterior part of zebrafish embryos

2.3 鎘暴露對胚胎基因相對表達量的影響

與對照組相比，鎘暴露導(dǎo)致prdx1、gstp1.2、atf3、jdp2b、hsp70l、eif4a1b和fabp7a基因相對表達量顯著上調(diào)，分別上調(diào)2.31、3.58、2.08、3.42、5.27、1.42和2.06倍(見圖4).hsp70l基因主要參與應(yīng)激反應(yīng)和對金屬離子的反應(yīng)[28]，gstp1.2和prdx1基因主要參與抗氧化過程[29]，atf3和jdp2b基因具有DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性[30]，eif4a1b基因具有翻譯起始因子活性[30]，fabp7a基因在早期神經(jīng)發(fā)育過程中起重要作用[31]. 這些基因相對表達量的顯著上調(diào)表明，鎘影響斑馬魚胚胎的氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)錄翻譯和早期神經(jīng)發(fā)育等過程.

圖4 鎘暴露對斑馬魚胚胎基因相對表達量的影響Fig.4 The relative expression levels of genes induced by cadmium on zebrafish embryos

2.4 鎘暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

通過研究鎘對8個基因在斑馬魚胚胎組織和器官表達的影響，發(fā)現(xiàn)鎘不但誘導(dǎo)基因在神經(jīng)組織、視網(wǎng)膜、晶狀體，嗅球、側(cè)線、心臟以及皮膚等組織和器官中異常表達，而且影響基因在相應(yīng)組織和器官中的表達水平，表明鎘影響斑馬魚胚胎的多個組織和器官的發(fā)育.

研究表明，鎘主要通過芬頓反應(yīng)置換金屬離子，產(chǎn)生多余的ROS，進而造成氧化應(yīng)激[32]，并通過干擾體內(nèi)鈣離子運輸，影響蛋白質(zhì)正常生理功能等[33]產(chǎn)生毒性效應(yīng). 筆者研究的8個基因中，有5個基因在鎘暴露后的斑馬魚胚胎中于嗅球處異位表達，并且定量PCR結(jié)果顯示，其中4個基因在鎘暴露后表達量顯著升高. 這5個基因包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因atf3[34]，氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因atf3[35]、gstp1.2[29]、prdx1[36-37]、hsp70l[38]、hsp90aa1.1[39]，免 疫 調(diào) 控 相 關(guān) 基 因atf3[40]、prdx1[41]及血管形成相關(guān)基因prdx1[42].atf3基因?qū)儆诹涟彼崂溵D(zhuǎn)錄因子家族，哺乳動物中ATF3在受到毒性傷害的組織、癲癇發(fā)作后的大腦等細胞應(yīng)激部位中表達顯著[43].gstp1.2基因在多種細胞過程中發(fā)揮重要作用，包括親電子化合物的催化和脫氧、氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)、細胞信號傳導(dǎo)和致癌作用[44]，主要參與代謝、解毒并保護細胞免受DNA損傷和癌變[45-46].prdx1基因也是重要的抗氧化基因，其維護基因穩(wěn)定性及防止突變[36]，并且參與細胞生長、增殖、免疫響應(yīng)及細胞凋亡等過程[37，41].hsp70l介導(dǎo)多種生物過程，參與斑馬魚的熱適應(yīng)、長期存活[47]和低溫應(yīng)激過程[48]. 研究發(fā)現(xiàn)，低溫刺激顯著增加雞心臟和免疫器官Hsp70 mRNA的表達[49]，具有保護脾臟和盲腸受到氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥損傷的作用[50].hsp90aa1.1基因?qū)儆跓嵝菘说鞍准易?，參與早期肌肉發(fā)育和多種蛋白質(zhì)的折疊、激活和組裝[51]，以及對金屬離子的反應(yīng)[52]. 研究[53]發(fā)現(xiàn)，鎘暴露激活prdx1和hsp70等與氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達，造成斑馬魚嗅覺損傷，導(dǎo)致斑馬魚捕食及抗捕食者的行為缺陷. 鎘暴露會破壞嗅覺上皮基底細胞層，降低大腦區(qū)域中的膜流動性進而影響嗅覺[54].

atf3、jdp2b基因在斑馬魚胚胎的心包區(qū)域異常表達.jdp2b基因具有DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性. 哺乳動物中JDP2在抑制由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶引起的組蛋白乙酰化過程中具有重要作用，其可以通過形成同型二聚體或招募組蛋白去乙?；窩RE，并與TRE DNA元件結(jié)合形成異型二聚體來抑制轉(zhuǎn)錄[55]，也可以通過與CHOP10結(jié)合[56]或作為類固醇激素受體[57]激活轉(zhuǎn)錄. 轉(zhuǎn)基因小鼠研究[58]發(fā)現(xiàn)，JDP2過表達會引起小鼠心房擴張和輕微心室增厚，導(dǎo)致4周齡jdp2轉(zhuǎn)基因小鼠的死亡率明顯上升. 作為JDP2同系物的ATF3，其過表達也會引起小鼠心臟肥大和功能障礙. 鎘誘導(dǎo)atf3、jdp2b在胸鰭原基和尾鰭原基表達量上升，誘導(dǎo)jdp2b和gstp1.2基因在側(cè)線器官異常表達，說明鎘可能影響斑馬魚胸鰭、尾鰭和側(cè)線器官的發(fā)育. 斑馬魚的側(cè)線器官主要感受水流變化，由毛細胞和支持細胞組成，Wnt、FGF和Notch信號通路是斑馬魚側(cè)線發(fā)育的主要調(diào)控因子[59]. 筆者研究中jdp2b與gstp1.2基因在白細胞處出現(xiàn)異常表達，近期研究[60]發(fā)現(xiàn)，甲基汞處理的斑馬魚胚胎也存在白細胞異常表達的現(xiàn)象，并且該研究發(fā)現(xiàn)白細胞參與側(cè)線發(fā)育過程.jdp2b與gstp1.2基因在側(cè)線和白細胞中的異常表達與斑馬魚胚胎側(cè)線發(fā)育的關(guān)系需進一步研究.

鎘誘導(dǎo)eif4a1b、hsp90aa1.1基因在眼睛晶狀體異常表達. eIF4A是一種ATPase/RNA解旋酶，參與翻譯過程，在新生小鼠的晶狀體纖維細胞中高表達[61].研究[62]顯示，hsp90α基因參與魚類發(fā)育過程中晶狀體細胞的凋亡過程. 已有研究[63-64]證明，鎘通過阻斷神經(jīng)嵴的形成、抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)元的分化和破壞視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的軸突形成等過程影響斑馬魚胚胎眼睛的發(fā)育. 鎘誘導(dǎo)eif4a1b和hsp90aa1.1基因在晶狀體中的異常表達與斑馬魚晶狀體發(fā)育和視覺功能的關(guān)系需要進一步研究.fabp7a基因在斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[31]，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜中表達，Notch信號通過維持fabp7a基因的表達來調(diào)控神經(jīng)周圍神經(jīng)膠質(zhì)細胞的發(fā)育[65]. 此外，該基因也一定程度上參與了眼睛發(fā)育過程[66]. 鎘暴露導(dǎo)致其表達量顯著上調(diào)，鎘是否通過影響fabp7a基因在中樞神經(jīng)的表達進而影響神經(jīng)功能，需進一步研究.

3 結(jié)論

a) 20.00 mg/L鎘暴露導(dǎo)致斑馬魚胚胎出現(xiàn)小頭、小眼、軀干彎曲、心包水腫、卵黃囊異常以及死亡等異常，計算得到鎘暴露120 hpf后斑馬魚胚胎的LC50濃度為15.20 mg/L.

b) 7.50 mg/L鎘誘導(dǎo)prdx1、gstp1.2、atf3、jdp2b、hsp70l、eif4a1b和fabp7a基因的表達量顯著上升，說明鎘可能影響斑馬魚胚胎的氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)錄翻譯和早期神經(jīng)發(fā)育等過程.

c) 7.50 mg/L鎘誘導(dǎo)基因在神經(jīng)組織、視網(wǎng)膜、晶狀體、嗅球、側(cè)線、心臟以及皮膚等組織和器官異常表達，說明鎘可能通過影響基因的表達區(qū)域，干擾斑馬魚胚胎的多個組織和器官的發(fā)育，進而造成嗅覺、視覺和運動等功能缺陷.