廖春麗，袁 源，李紹沖，王泓云，梁家琪，趙 靜，楊 云，李冰冰

(1.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036；2.河南城建學(xué)院 河南省健康食品工程技術(shù)研究中心，河南 平頂山 467036；3.河南城建學(xué)院 河南省水體污染防治與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 平頂山 467036)

昆蟲體內(nèi)的腸道微生物構(gòu)成了昆蟲腸道的微生態(tài)體系，它們在昆蟲腸道內(nèi)定殖,完成生長、代謝、增殖等全部生命活動(dòng)。昆蟲腸道定居著大量的微生物，其與宿主在長期協(xié)同進(jìn)化過程中形成了緊密的互利共生關(guān)系[1-2]，影響著昆蟲的生長和發(fā)育，參與昆蟲的消化、營養(yǎng)吸收和繁殖，而且腸道細(xì)菌對信息素的產(chǎn)生、維生素的合成、殺蟲劑的降解以及病菌的防御也有重要作用。鑒于昆蟲腸道微生物的重要功能，相關(guān)研究已越來越受國內(nèi)外學(xué)者重視。

大蠟螟(Galleria mellonella)是昆蟲病原線蟲重要寄主之一，人們常利用大蠟螟幼蟲對昆蟲病原線蟲進(jìn)行分離、誘集和對昆蟲致病力進(jìn)行測定[3]?？刹捎么笙灻T捕法分離韭菜土壤樣品中的線蟲，從異小桿屬昆蟲病原線蟲腸道內(nèi)分離到具有較高殺蟲活性的腸桿菌株NK，通過其形態(tài)、生理和生化特征，并結(jié)合16S rDNA序列分析等手段將其鑒定為新屬-腸桿菌屬(Enterobacter)[4]。

近年來，已有一些關(guān)于Bt殺蟲蛋白對昆蟲腸道細(xì)菌影響的研究報(bào)道。Broderick等[5-6]從舞毒蛾Lymantria dispar中腸中發(fā)現(xiàn)Bt殺蟲活性的發(fā)揮必須依賴于腸桿菌Enterobactersp.NAB3，并且還發(fā)現(xiàn)Bt活性與中腸微生物的關(guān)系因昆蟲種類而異。張浩等[7]發(fā)現(xiàn)腸道菌在Bt殺蟲過程中對棉鈴蟲起到保護(hù)作用。李振等[8]發(fā)現(xiàn)經(jīng)Bt殺蟲蛋白處理后二化螟幼蟲中腸細(xì)菌群落的豐富度出現(xiàn)變化，推測可能與二化螟取食Bt殺蟲蛋白有關(guān)。鑒于目前新屬-NK菌株(日溝維腸桿菌)殺蟲蛋白對大蠟螟腸道細(xì)菌群落的影響狀況仍未清楚，因此研究取食NK菌株殺蟲蛋白后大蠟螟幼蟲腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)的變化，對于明確大蠟螟腸道細(xì)菌與NK菌株殺蟲蛋白之間的關(guān)系具有重要的意義。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于核酸序列分析的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用到昆蟲的腸道微生物學(xué)研究中。細(xì)菌核糖體16S rDNA 基因可變區(qū)是此類生物物種的特征核酸序列，可用來進(jìn)行細(xì)菌的分類鑒定。本文采用高通量測序技術(shù)手段對未飼喂蛋白和飼喂不同時(shí)間蛋白的大蠟螟幼蟲中腸細(xì)菌的16S rDNA 基因 V3-V4 區(qū)的PCR產(chǎn)物采集4個(gè)樣本，檢測其群落多樣性及群落結(jié)構(gòu)的變化，探討腸道細(xì)菌與昆蟲病原線蟲共生菌NK殺蟲蛋白之間的關(guān)系，進(jìn)而為闡明昆蟲病原線蟲共生菌NK殺蟲機(jī)制提供一定的借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 共生菌NK殺蟲蛋白

從昆蟲病原線蟲共生菌NK胞內(nèi)提取純化殺蟲蛋白(-80 ℃冷凍保存)。

1.1.2 供試?yán)ハx

大蠟螟3齡幼蟲(Galleria mellonella larvae)，于網(wǎng)上選購。將3齡的大蠟螟幼蟲，每個(gè)平板分裝15條，用含有0.2 mg/g濃度殺蟲蛋白的飼料進(jìn)行投喂，飼喂3個(gè)不同時(shí)間段(36 h、48 h和60 h)作為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，編號(hào)分別為BG1、BG2、BG3，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行，同時(shí)用不含殺蟲蛋白的飼料喂養(yǎng)大蠟螟幼蟲作為空白對照組,編號(hào)為BG0。培養(yǎng)溫度25～30 ℃，濕度75%，避光。

1.2 方法

1.2.1 腸道的解剖與保存

選取實(shí)驗(yàn)組和對照組大蠟螟幼蟲120條。在無菌操作條件下解剖出中腸，將中腸放入2 mL離心管中，每管放入40條幼蟲的中腸，每個(gè)處理3管。離心管中提前放入0.7% 的生理鹽水500 μL，單管編號(hào)，放入-80 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 DNA的提取和 PCR擴(kuò)增

使用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(OMEGA，美國)試劑盒，參照說明書提取大蠟螟幼蟲腸道總基因組，并用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提質(zhì)量，檢測合格后的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR接頭引物如表1所示，引物為Miseq測序平臺(tái)中細(xì)菌16S rDNA，V3-V4區(qū)通用引物。

表1 PCR擴(kuò)增時(shí)引物序列

PCR反應(yīng)的擴(kuò)增程序包含兩輪。第一輪擴(kuò)增：首先在94 ℃、 94 ℃、45 ℃、65 ℃溫度下，依次進(jìn)行 3 min、 30 s、20 s、30 s，共5個(gè)循環(huán)；然后在94 ℃、55℃、 72 ℃溫度下，依次進(jìn)行20 s、20 s、30 s，共20個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃條件持續(xù)延伸5 min。第二輪擴(kuò)增(引入Illumina橋式PCR兼容引物)：首先在94 ℃、94 ℃、55 ℃、72 ℃ 溫度下，依次進(jìn)行3 min、20 s、20 s、30 s，共5個(gè)循環(huán)，然后在72 ℃持續(xù)延伸5 min；最后將得到的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，對其進(jìn)行質(zhì)量檢測。濃度和特異性合格后送上海生工生物有限公司進(jìn)行高通量測序。上樣順序依次為BG0、BG1、BG2和BG3。

1.2.3 大蠟螟幼蟲中腸微生物基因組高通量測序及數(shù)據(jù)分析

采用Illumina Miseq 測序平臺(tái)對1個(gè)對照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣品的16S rDNA V3-V4區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙端測序。利用RDP、Silva、NCBI 16S數(shù)據(jù)庫對大蠟螟中腸細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行物種注釋，群落分類?；贠UT的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，利用Mothur軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，包括反映樣品中群落豐富度的Chao1指數(shù)和觀測物種數(shù)(number of observed species)以及反映樣品中物種多樣性的Shannon 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蠟螟腸道DNA的提取和PCR擴(kuò)增

大蠟螟腸道DNA提取結(jié)果如圖1所示，圖1中4個(gè)不同處理組中1條帶存在輕微的降解與斷裂，不影響PCR擴(kuò)增的結(jié)果，其他2、3、4條帶明亮清晰，表明DNA含量豐富，符合PCR擴(kuò)增所需的濃度要求。大蠟螟腸道DNA16S rDNA V3-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物見圖2，經(jīng)電泳檢測均在600 bp左右出現(xiàn)明顯的條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符，且特異性良好，故直接用于高通量測序。

注：1、2、3、4分別代表BG0、BG1、BG2和BG3。

注：1、2、3、4分別代表BG0、BG1、BG2和BG3。

2.2 序列拼接組裝信息

大蠟螟幼蟲腸道細(xì)菌16S rDNA高通量測序基本信息見表2。

表2 大蠟螟幼蟲腸道細(xì)菌16S rDNA高通量測序基本信息

由表2可知：大蠟螟幼蟲中腸腸道細(xì)菌 4個(gè)樣本(BG0、BG1、BG2和BG3)16S rRNA高通量測序共產(chǎn)生原始序列分別為71 722、67 559、65 549、63 200條；質(zhì)控拼接后得到優(yōu)質(zhì)序列分別為70 350、67 559、64 370、61 725條；基于97%的相似水平，大蠟螟幼蟲腸道細(xì)菌OTU聚類分析分別獲得1 872、1 445、1 262和1 591個(gè)OTUs?；贠TUs的分類結(jié)果，大蠟螟幼蟲腸道樣本中細(xì)菌分屬于14、15、9、11個(gè)門，27、27、20、22個(gè)綱，41、33、31、39個(gè)目，58、58、45、56個(gè)科，71、80、57、84個(gè)屬。

2.3 大蠟螟腸道細(xì)菌的種類組成及其豐度

大蠟螟幼蟲腸道樣本在高通量測序的16S rDNA序列4個(gè)處理組注釋：在門、綱、目和科分類階元水平上的微生物群落組成如表3所示。在門分類階元上，厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)細(xì)菌為絕對優(yōu)勢菌。在綱分類階元上，芽孢桿菌綱(Bacilli)和γ-變形桿菌綱(Gammaproteobacteria)細(xì)菌為絕對優(yōu)勢菌。在目分類階元上，乳桿菌目(Lactobacillales)和腸桿菌目(Enterobacteriales)細(xì)菌為絕對優(yōu)勢菌。在科分類階元上腸球菌科(Enterococcaceae)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細(xì)菌為絕對優(yōu)勢菌。當(dāng)然還有一些未注釋成功的。

表3 大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)在門、綱、目和科分類階元上相對豐度(%)靠前的細(xì)菌

運(yùn)用Blast軟件對本次樣本的物種分類進(jìn)行分析，在4個(gè)樣本屬的水平上共注釋到48個(gè)菌屬，如圖3所示。相對豐度靠前的細(xì)菌見表4。從圖3和表4可知：厚壁菌門中的腸球菌屬(Enterococcus)為優(yōu)勢菌，在4個(gè)處理組中所占比重分別為94.85%、48.02%、55.99%、48.94%；變形菌門中的腸桿菌屬(Enterobacter)為優(yōu)勢菌，在4個(gè)處理組中所占比重分別為1.00%、40.39%、19.54%、36.22%，其次變形桿菌屬、假單胞菌屬和鞘脂單胞菌屬等也占一定比重。

昆蟲病原線蟲共生菌NK胞內(nèi)殺蟲蛋白的侵入不僅影響了屬的類別，而且改變了不同菌屬間的數(shù)量。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組腸球菌屬的數(shù)量明顯降低，而實(shí)驗(yàn)組腸桿菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬的數(shù)量則明顯上升。由圖3和表4可知，昆蟲病原線蟲共生菌NK胞內(nèi)殺蟲蛋白對大蠟螟中腸微生物的腸球菌屬、腸桿菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬的數(shù)量影響最大。

基于OTU的樣本聚類樹圖見圖4。根據(jù)圖4樣本間的距離可以看出，樹枝的長度代表樣本間的距離，越相似的樣本會(huì)越靠近，反之越遠(yuǎn)。實(shí)驗(yàn)組與對照組的樣本群落相似度相差甚遠(yuǎn)，而3個(gè)處理組的樣本群落相似性則較為接近，尤其是48 h和60 h處理組相似性最為接近，說明用昆蟲病原線蟲共生菌胞內(nèi)殺蟲蛋白飼喂大蠟螟會(huì)改變大蠟螟中腸微生物群落之間的相似性，并且飼喂時(shí)間越長，對照組和實(shí)驗(yàn)組大蠟螟中腸微生物群落之間的相似性相差越大。

圖3 不同處理二化螟幼蟲中腸細(xì)菌物種注釋結(jié)果柱狀圖

表4 大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)在屬分類階元上相對豐度(%)靠前的細(xì)菌

圖4 基于OTU的樣本聚類樹圖

2.4 大蠟螟腸道細(xì)菌Alpha分析

Alpha多樣性指數(shù)評估可以反映樣本內(nèi)菌群的多樣性。選取觀測物種數(shù)、Chao1、Shannon、Simpson和Coverage 5個(gè)常用指數(shù)來分析大蠟螟腸道菌群的多樣性，見表5。觀測物種數(shù)和 Chao1(物種總數(shù)指數(shù)) 指數(shù)值越大，表示樣品中群落豐富度越高；Shannon 指數(shù)越高，Simpson指數(shù)越小，說明樣品中的物種多樣性越高；Coverage表明樣品序列的覆蓋率，其值越大覆蓋越完全。由表5可知，大蠟螟腸道中細(xì)菌種類均具有較高的豐富度和一定的多樣性，并且樣品序列的覆蓋率也很高。

表5 大蠟螟幼蟲腸道細(xì)菌多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

圖5 大蠟螟幼蟲腸道細(xì)菌OTUs的Rank-abundance曲線

和對照組相比，實(shí)驗(yàn)組中隨著飼喂殺蟲蛋白時(shí)間越長，其Chao1指數(shù)越小，表明昆蟲病原線蟲殺蟲蛋白的侵入降低大蠟螟中腸微生物的物種總數(shù)；其Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，表明昆蟲病原線蟲殺蟲蛋白的侵入增加大蠟螟中腸微生物的群落多樣性。但在BG3(60 h)樣本，物種總數(shù)又稍微升高，推測在60 h大蠟螟已經(jīng)死亡，微生物大量繁殖的結(jié)果；Shannon指數(shù)稍微降低，Simpson指數(shù)稍微變大，推測在60 h大蠟螟已經(jīng)死亡，起分解作用的微生物增加，降低群落多樣性。

Rank-abundance 曲線可以同時(shí)展現(xiàn)4個(gè)樣品中所含物種的豐富程度和均勻程度，見圖5。由圖5可知：大蠟螟腸道中的細(xì)菌組成豐富，因?yàn)槲锓N的豐富程度由曲線的橫軸長度來反映，4個(gè)樣本曲線寬，說明它們的物種組成豐富；但大蠟螟腸道中的細(xì)菌均勻度不高，因?yàn)槲锓N的均勻度由曲線形狀來反映，4個(gè)樣本曲線不平坦，說明它們的均勻度不高，即存在一些豐度占比較高的細(xì)菌種類。

3 結(jié)論與討論

以往關(guān)于腸道微生物的研究主要采用離體平板培養(yǎng)和克隆文庫法，且集中于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析方面[9]。近年來，高通量測序技術(shù)為全面掌握腸道菌群結(jié)構(gòu)提供了強(qiáng)有力的分析手段。通過Illumina Miseq測序技術(shù)檢測細(xì)菌16S rDNA序列，可系統(tǒng)分析大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)細(xì)菌的種類多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成。

根據(jù)Alpha多樣性指數(shù)評估樣本內(nèi)菌群的多樣性，與對照組相比經(jīng)昆蟲病原線蟲共生菌NK胞內(nèi)蛋白飼喂的實(shí)驗(yàn)組，大蠟螟中腸細(xì)菌的物種總數(shù)減少，但實(shí)驗(yàn)組大蠟螟中腸微生物的群落多樣性增加，與對照組的優(yōu)勢菌群腸球菌屬等相比，實(shí)驗(yàn)組的優(yōu)勢菌群則為腸球菌屬、腸桿菌屬和變形桿菌屬等。基于OTU的樣本聚類樹圖和Rank-abundance 曲線可知：對照組和實(shí)驗(yàn)組，大蠟螟中腸微生物群落之間的相似性相差較大；大蠟螟腸道中的細(xì)菌組成豐富，但均勻度不高，即存在一些豐度占比較高的細(xì)菌種類。

與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組腸球菌屬所占比重明顯下降，說明腸球菌屬在大蠟螟幼蟲受到NK殺蟲蛋白的影響后導(dǎo)致該菌比重降低。通過用抗生素和不用抗生素處理的無菌昆蟲驗(yàn)證了煙草天蛾 Manduca sexta 和小菜蛾的腸道內(nèi)的腸球菌能部分降低 Cry1Ac 的殺蟲活性[10]。舞毒蛾幼蟲腸道內(nèi)共生的腸球菌也能降低蘇云金芽孢桿菌的殺蟲活性[11]。由此推測NK殺蟲蛋白能抑制腸球菌生存，同時(shí)腸球菌也能抑制NK殺蟲蛋白活性，腸球菌屬作為大蠟螟中腸微生物的絕對優(yōu)勢菌群(比重占94.85%)對昆蟲生理可能起到有益的作用，只有通過降低腸球菌比重，NK殺蟲蛋白才能最終發(fā)揮殺蟲功能，從而影響大蠟螟幼蟲的生理活動(dòng)。

與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組腸桿菌屬比重明顯增加，說明大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)可能通過腸桿菌屬比重的增加，來適應(yīng)NK 殺蟲蛋白的處理，也有可能這類菌更能耐受有NK殺蟲蛋白的腸道環(huán)境。同時(shí)腸桿菌屬中包含大量的沙門氏菌、志賀氏菌等條件致病菌，這些腸桿菌屬中的一些細(xì)菌對大蠟螟可能起著有害的作用，它們和NK殺蟲蛋白共同影響大蠟螟幼蟲的生理活動(dòng)。

與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組新增了不動(dòng)桿菌屬、克呂沃爾氏菌屬這兩種新的菌屬。不動(dòng)桿菌屬是導(dǎo)致腸道感染的重要病原菌之一[12]，克呂沃爾氏菌屬是典型的條件致病菌屬，可見這兩種菌屬也會(huì)對大蠟螟幼蟲造成危害，它們也和NK殺蟲蛋白共同影響大蠟螟幼蟲的生理活動(dòng)。

大蠟螟腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的變化可能與昆蟲病原線蟲共生菌NK胞內(nèi)殺蟲蛋白的介入有關(guān)，從而為闡明它的殺蟲機(jī)制提供一定的借鑒和參考。但是大蠟螟中腸優(yōu)勢細(xì)菌群落變化是助推還是抑制殺蟲蛋白引起大蠟螟幼蟲的死亡？還需要進(jìn)一步的探索。