施 琦，李娟玲，余文剛，陶 均

（1.海南大學(xué) 園藝學(xué)院，?？?570228; 2.海南大學(xué) 林學(xué)院，?？?5702282;3.海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，?？?570228）

鷓 鴣 茶 [Mallotus oblongifolius(Miq.) Muell.Arg]是一種常綠野生灌木，俗稱山苦茶、五月茶、毛茶等[1]，在海南有著悠久的飲用歷史和深厚的文化底蘊，具有清熱抗炎、利膽、助消化、開胃和解油膩等功效，曾一度被譽為茶制品中的“靈芝草”[2]。茶葉里的香氣是衡量其品牌質(zhì)量的主要指標(biāo)[3]，香氣主要來源于各種有機揮發(fā)性化合物，主要有3類，即萜烯類、苯丙酸類/苯環(huán)類和其他脂肪酸衍生物[4]。揮發(fā)性物質(zhì)代謝組學(xué)能夠全面系統(tǒng)地分析香味里相關(guān)代謝物的種類和含量，越來越多地應(yīng)用于園藝植物研究。SAVOID等[5]發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，單萜類的物質(zhì)，如芳樟醇、橙花醇和松油醇，在白葡萄果實成熟的最后階段顯著增加。覃少昌等[6]利用代謝組學(xué)鑒定了鷓鴣茶揮發(fā)性成分的種類，但影響鷓鴣茶香味的物質(zhì)尚未明確。筆者所在的研究團隊長期進行鷓鴣茶種植資源的收集、鑒定和培育研究，發(fā)現(xiàn)了2種鷓鴣茶（鮮葉為紅色和綠色）具有不同的香味，但不知其差異的原因和機制 。 本研究利用 GC-MS（gas chromatographymass spectrometry）法對紅、綠鷓鴣茶鮮葉間的揮發(fā)性物質(zhì)進行代謝組學(xué)分析，使用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），尋找二者之間的差異代謝物，解析兩種鷓鴣茶香味差異的原因，為進一步利用揮發(fā)性物質(zhì)，開發(fā)功能性鷓鴣茶品種打下基礎(chǔ)，促進鷓鴣茶產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料紅、綠鷓鴣茶鮮葉（圖1）采自海南大學(xué)園藝學(xué)院實驗基地，采集時間為2020?11?06，采集完后用液氮速凍，并存放于?80 ℃冰箱。

1.2 樣品的制備從?80 ℃ 冰箱取出鷓鴣茶鮮葉樣品進行液氮研磨，旋渦混勻，稱取每個樣本2 g，置于頂空瓶中。分別添加飽和NaCl溶液和10 μL內(nèi)標(biāo)溶液(芳樟醇同位素，(+/-)-linalool-D3)。

1.3 GC 條件色譜柱：DB-wax（30 cm × 0.25 mm ×0.25 μm）；載氣為氦氣（99.999%），柱平均流速1.0 mL·min?1；進入采樣口的平均溫度 250 ℃，程序升溫 40 ℃ 以后保持 5 min，再以 5 ℃·min?1繼續(xù)上升至 220 ℃，然后 20 ℃·min?1繼續(xù)上升至 250 ℃，并保持 2.5 min。MS 條件：接口溫度 260 ℃；離子源溫度 230 ℃；4 級桿溫度 150 ℃；電離方式 EI+，電子能量 70 ev；掃描質(zhì)量范圍 20～400 amu.

1.4 數(shù)據(jù)處理對原始數(shù)據(jù)進行帕萊托（par） 換算處理，得出數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SIMCA-AP軟件進行主成分分析，再依據(jù)OPLS-DA模型變量投影數(shù)值VIP＞1且單變量分析P＜0.5進行差異性代謝產(chǎn)物篩選。

2 結(jié)果與分析

2.2 揮發(fā)物質(zhì)含量的比較分析統(tǒng)計結(jié)果表明，OPLS-DA模型建立的R2和Q2值均大于0.5，表明該模型可用于分析差異化揮發(fā)性物質(zhì)，具有較高的可靠性。在OPLS-DA模型結(jié)果中通過篩選

2.1 GC-MS 原始數(shù)據(jù)的分析和處理紅、綠鷓鴣茶鮮葉揮發(fā)性物質(zhì)總離子圖見圖1。紅、綠鷓鴣茶鮮葉中共檢測出156種揮發(fā)性物質(zhì)（表1, 2），其中綠葉鷓鴣茶檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)總數(shù)（123種）比紅葉鷓鴣茶（108種）多。2種材料中共同檢測到揮發(fā)性物質(zhì)有76種，從2份材料所檢出揮發(fā)性物質(zhì)來看，萜類所占的比例最大，其中倍半萜占26.2%，單萜衍生物（單萜醇、單萜醛）占6.4%，說明鷓鴣茶揮發(fā)性物質(zhì)以萜類為主。VIP值＞1且差異顯著性P＜0.05來進行篩選紅、綠鷓鴣茶鮮葉間的差異代謝物（表3）。從檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)總含量來看，綠色鷓鴣茶鮮葉高，為802.53 μg·g?1；紅色鷓鴣茶鮮葉較低，為 465.84 μg·g?1。鷓鴣茶綠色鮮葉中醛類、醇類和萜類含量都高于鷓鴣茶紅色鮮葉。其中α-愈創(chuàng)木烯、α-布藜烯、丙醛、環(huán)苜蓿烯、蓽澄茄烯只存在于綠色鷓鴣茶鮮葉中。石竹烯、α-依蘭油烯、α-紫羅酮則只存在于紅色鷓鴣茶鮮葉中。另外，紅色鷓鴣茶鮮葉萜類化合物有5種，相對含量占72.4%；烯烴有1種，占12.1%；醛1種，占1.4%；酮1種，占6.4%；醇2種，占19.6%。其中揮發(fā)性成分中含量最高的化合物為石竹烯（35.5%），其次為律草烯（9.06%）。而綠色鷓鴣茶鮮葉萜類化合物有7種，相對含量占69.3%；烯烴有1種，占3.8%；醛2種，占22.6%；醇2種，占4.1%。其中含量最高的化合物為α-愈創(chuàng)木烯（32.6%）、其次為 α-布藜烯（13.1%）。綠色鷓鴣茶鮮葉未檢測到酮類揮發(fā)性物質(zhì)。

表1 紅、綠鷓鴣茶鮮葉的揮發(fā)性物質(zhì)含量

表3 紅、綠色鷓鴣茶鮮葉的代謝物差異

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

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表2 紅、綠鷓鴣茶鮮葉的揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量分析 種

3 討 論

植物中的揮發(fā)性物質(zhì)可參與植物防御和輔助授粉；人工提取的含有揮發(fā)性物質(zhì)的精油，其怡人的芳香具有鎮(zhèn)靜、安神等功效，廣泛應(yīng)用于臨床、食品、美容等行業(yè)[7,8]。揮發(fā)性化合物質(zhì)由多種復(fù)雜的有機化合物質(zhì)共同組成，其代謝途徑涉及異戊二烯途徑、莽草酸途徑、脂肪酸裂解途徑等多個復(fù)雜的通路。本研究結(jié)果表明，在鷓鴣茶葉揮發(fā)性物質(zhì)中，萜類物質(zhì)占比最大（表1，3）。大部分萜類物質(zhì)具有抗腫瘤、緩解糖尿病、抑炎等多種醫(yī)療保健功效[9]，如石竹烯具有丁香花香味，有平喘、祛痰、抑炎作用[6]；律草烯有平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰、治療氣管炎的功效[10]，以上2種物質(zhì)在紅色鷓鴣茶中的含量都顯著高于綠色鷓鴣茶（表3），暗示紅色鷓鴣茶可能具有一定的保健作用。

在萜類物質(zhì)中，橙花叔醇是芳香性倍半萜精油的主要成分，賦予水果及鮮花香味（花香、木花香、水果百合香等），可用于制備玫瑰型、丁香型等花香，廣泛應(yīng)用于化妝品、洗滌等領(lǐng)域[11?12]；α-法呢烯也是決定香味的重要物質(zhì)；香葉醇具有玫瑰花香；芳樟醇賦予植物鈴蘭香、木香等。芳樟醇、橙花叔醇和香葉醇互為同分異物體，在體內(nèi)可相互轉(zhuǎn)化[13?14]，因此，這些物質(zhì)的含量差異可能是植物香味變化的主要因素。陳泉賓等[15]在3種烏龍茶（閩南烏龍茶、清香型烏龍茶和閩北烏龍茶）香氣研究中發(fā)現(xiàn), 橙花叔醇在香氣成分中所占比例最高, 為香氣中最主要的物質(zhì)。但不同香型烏龍茶的主要香氣成分及含量所占比例是不同的。例如, 肉桂香型中香氣成分中所占比例從高到低依次為：橙花叔醇、吲哚、芳樟醇及其氧化物等; 玉蘭香型中香氣成分依次為法尼醇、植醇、吲哚；清香型中香氣成分以橙花叔醇、芳樟醇為主[16]。紅葉鷓鴣茶葉的橙花叔醇含量明顯高于綠葉鷓鴣茶（表3），表明紅色鷓鴣茶香味濃厚的原因可能是由于橙花叔醇含量較高所導(dǎo)致的。

本研究通過比較紅、綠鷓鴣茶葉揮發(fā)性物質(zhì)的差異，發(fā)現(xiàn)兩者之間香味差異的原因可能是萜類物質(zhì)橙花叔醇含量不同造成的。但是，本研究只是從揮發(fā)性代謝物的角度分析了紅綠兩種鷓鴣茶的差異，并未對造成這些差異的遺傳基礎(chǔ)做分析，也未深入解析這些差異性物質(zhì)在香味決定中占據(jù)的比例，后面將會對這些方面進行深入研究。在紅色鷓鴣茶葉中，萜類物質(zhì)，如石竹烯和律草烯等含量較高的特點預(yù)示其更具有開發(fā)利用價值。該研究為功能性鷓鴣茶品種的開發(fā)和鷓鴣茶產(chǎn)品的研制提供了依據(jù)和基礎(chǔ)。