郭紅艷，譚新建，田 豐，鐘秋平＊

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，江西 分宜 336600；2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091)

開花是種子植物生殖生長的重要環(huán)節(jié)，不僅與物種的繁衍緊密相關(guān)，還影響到以果實(shí)為收獲對象的經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量[1]。種子植物開花分為三個階段：成花啟動、花器官發(fā)育、開花。成花啟動是開花的第一步，也是決定植物開花時間的關(guān)鍵階段[2-3]。目前，國內(nèi)外對植物成花啟動機(jī)制的研究主要集中在擬南芥（Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.）、水稻（Oryza sativaL.）等1 年生草本植物中，對木本植物的研究較少[4]。1 年生草本植物的成花啟動過程是營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變過程；而在多年生木本植物中，成花啟動包括2 部分，第一部分是生命周期中營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變過程，即生命周期中第1 次成花，幼年期向成熟期的轉(zhuǎn)變；第二部分是進(jìn)入成熟期后，年生長周期中的成花啟動。由此可見，在木本植物和草本植物中，成花啟動機(jī)制存在差異，但目前關(guān)于木本植物成花啟動的研究較少。

油茶（Camellia oleiferaAbel.）是我國重要的多年生木本油料樹種，主要分布在湖南、江西、廣西等南方地區(qū)，低產(chǎn)是限制油茶產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的重要原因[5-6]。油茶10—12 月開花，花期多雨、霜凍、低溫是導(dǎo)致油茶花多果少、產(chǎn)量低的原因之一。當(dāng)年生春梢是油茶最主要的開花結(jié)果枝，開花時間早的品種花芽分化早，開花時間晚的品種花芽分化晚，花芽分化開始的時間與開花時間密切相關(guān)；而花芽開始分化標(biāo)志著形態(tài)學(xué)上植物啟動成花，這表明油茶成花啟動與開花時間密切相關(guān)[7]。油茶春梢基本完成生長后開始花芽分化，花芽分化分為前分化期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房與花藥形成期、雌雄蕊成熟期[8-9]。目前，對萼片形成之后的成花過程研究比較清楚，但在這之前的成花啟動過程尚不清楚，僅將其統(tǒng)稱為前分化期或生理分化期。那么，油茶什么時候啟動成花，春梢的生長發(fā)育與成花啟動有何關(guān)系是一個值得關(guān)注和探討的問題。

鑒于此，本研究以樹齡12 年生的長林53 號油茶（Camellia oleifera ‘changlin53’）為試驗(yàn)材料，對油茶春梢生長過程中芽的形態(tài)變化進(jìn)行研究，以明確油茶成花的部位、成花啟動的時間，探明油茶成花啟動與春梢生長的關(guān)系，以期為成年油茶年生長周期中成花啟動機(jī)制研究提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，為同類型木本植物成花啟動研究提供參考。

1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于江西省新余市分宜縣中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心（27°49′26″ N，114°39′46″ E），屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，低山丘陵地貌，坡度5°，海拔87.96～92.26 m，土壤為酸性紅壤，屬于我國油茶的主要產(chǎn)區(qū)。試驗(yàn)林為2009 年采用2 年生芽苗砧無性系嫁接苗造林的成林，樹齡12 a，株行距4 m × 3 m。

2 研究方法

2.1 油茶葉芽萌動時間調(diào)查

在長林53 號油茶試驗(yàn)品種內(nèi)選取長勢、冠幅一致的單株9 株，每3 株作為1 個生物學(xué)重復(fù)，共計(jì)3 個生物學(xué)重復(fù)。選取生長于枝條頂端往下的第2 個葉片的葉芽進(jìn)行標(biāo)記，每株標(biāo)記10 個芽。自2019 年2 月12 日起，每隔7 d 拍照觀察生長狀態(tài)。

2.2 春梢生長變化規(guī)律

選取試驗(yàn)植株東南西北4 個方向的中上部各1 個枝條，做好標(biāo)記，共選取30 個枝條，2019年4 月2 日開始測量春梢的長度和粗度；同時，在每株東南西北4 個方向的中上部各采集2 根新稍，分別收集新葉、新莖，放于錫箔紙袋中，置于液氮中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于?80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。? d 進(jìn)行1 次測量、采樣。

2.3 葉綠素含量測定

將采集的樣品置于液氮中研磨至粉末狀。稱取40 mg 研磨后的樣品，置于15 mL 離心管中，加入250 μL 純丙酮，5 min 后加入8 750 μL 80%的丙酮溶液，震蕩搖勻，于黑暗中靜置12 h，待樣品完全變白后，再加入1 mL 80%的丙酮溶液，震蕩搖勻，黑暗中靜置2 h，離心（5 000 g，20 ℃，5 min），吸取上清液。采用紫外分光光度計(jì)，在470、646、663 nm 處測量溶液吸光值。葉綠素含量計(jì)算公式如下：

葉綠素A（Chla）濃度（mg·L?1）=A663×12.21?A646× 2.81；

葉綠素B（Chlb）濃度（mg·L?1）=A646×20.13?A663× 5.03；

類胡蘿卜素（Car）濃度（mg·L?1）= (A470×1 000?Chla × 3.27?Chlb × 104)/229；

葉綠素含量（mg·g?1）=葉綠素濃度 ×V/W。

式中：A663表示663 nm 處吸光值；A646表示646 nm 處吸光值；A470表示470 nm 處吸光值；V表示樣品體積（L）；W表示樣品質(zhì)量（g）。

2.4 花芽分化形態(tài)特征

與2.2 節(jié)采樣時間一致，選取每株東南西北4 個方向的中上部各5 個枝條，采集每根枝條的頂芽和前2 個側(cè)芽，一部分置于FAA 固定液中保存，一部分置于Motic SMZ-171 體視顯微鏡下解剖拍照后置于固定液中保存?zhèn)溆谩⒐潭ㄓ贔AA 中的花芽取出，用PBS 緩沖液清洗2 次，經(jīng)70%（ 1 次）、 85%（ 1 次）、 95%（ 2 次）、100%（2 次）的乙醇脫水，采用CO2臨界點(diǎn)干燥儀（日立HCP-2）臨界點(diǎn)干燥6 h 后，使用離子濺射鍍膜儀（日立E1010）噴金，樣品處理完后置于干燥箱中備用。采用S-4 800 超高分辨率掃描電子顯微鏡觀察，拍照。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用office 2019、Statgraphics、Photoshop等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖片處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 春梢萌動時間調(diào)查研究

油茶春梢由上一年形成的葉芽發(fā)育生長而成，油茶花芽發(fā)生于當(dāng)年生春梢的頂端和葉腋，春梢的生長與花芽的分化、發(fā)育密切相關(guān)。本研究自2019 年2 月12 日開始調(diào)查并拍照記錄長林53 號油茶葉芽生長狀態(tài)，圖1 表明：2 月12 日至3 月12 日，葉芽呈休眠狀態(tài)，3 月19 日葉芽開始明顯的伸長，苞片緊密包裹住葉芽頂端，頂端呈錐形；3 月26 日，葉芽分化出的第1 片葉片呈卷曲狀突破頂端的萼片，自此葉芽分化成春梢，進(jìn)入春梢的生長階段。

圖1 油茶春梢萌動調(diào)查Fig. 1 Investigation on new shoot growth ofCamellia oleifera

3.2 成花啟動過程中春梢生長規(guī)律研究

長林53 號油茶春梢生長過程中，萼片在4 月23 日完全退化，葉片數(shù)量在4 月16 日全部分化形成，葉片顏色變化為黃綠色-綠色-墨綠色，莖顏色變化為褐色-綠色-褐色。本研究自4 月2 日開始調(diào)查油茶春梢生長規(guī)律（圖2）。4 月2 日，春梢形成，可見3 片葉片，僅1 片葉片展開，其它葉片成合抱狀生長于枝條頂端，葉片黃綠色，4 片白色的萼片生長于春梢中下部，新莖呈深褐色，密布白色的絨毛。4 月9 日，春梢進(jìn)一步增粗增長，形成7 片葉片，葉片黃綠色，萼片開始退化，2 片萼片生長于春梢下部，新莖呈淺褐色，密布白色的絨毛。4 月16 日，春梢進(jìn)一步增粗增長，形成8 片葉片，下部葉片呈淺綠色，上部葉片呈黃綠色，萼片進(jìn)一步退化，1 片萼片生長于春梢下部，新莖呈綠色，密布白色的絨毛。4 月23 日，春梢進(jìn)一步增粗增長，葉片數(shù)量沒有變化，葉片顏色均為淺綠色，萼片完全退化，新莖呈綠色，少量絨毛。4 月30 日春梢和新莖均呈綠色。5 月7 日至14 日葉片呈深綠色，新莖底部呈褐色。5 月21 日葉片顏色進(jìn)一步加深，新莖全部呈褐色。5 月28 日葉片顏色進(jìn)一步加深，6 月4 日葉片呈墨綠色，新莖顏色無明顯變化。

注：a：頂葉；a/b：新葉；c：新莖；d：萼片；e：新莖粗度測量位置；f：頂芽；g：新莖長度。Notes: a: apical leaf, a/b new leaves, c: new shoot, d: sepal,e: position of new shoot thickness measurement, f: apical bud,g: length of new shoot.

長林53 號油茶春梢生長分為三個階段：快速生長階段（4 月2 日至16 日）、平緩生長階段（4 月23 日至5 月21 日）、生長完成（5 月28 日以后）。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征（圖2）和圖3 可以看出：4 月2 日至16 日為春梢長度和粗度的快速生長階段，該階段萼片退化，完成葉片的分化，莖快速的伸長和增粗、顏色由褐色變?yōu)榫G色；4 月23 日至5 月21 日為油茶春梢的平緩生長階段，該階段葉片數(shù)量不再產(chǎn)生變化，葉片顏色由黃綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，莖由綠色變?yōu)楹稚? 月21 日以后春梢基本停止了伸長和增粗生長，但此后葉片顏色會進(jìn)一步加深，在6 月4 日葉片顏色變成墨綠色。

圖3 春梢生長過程中的長度與粗度Fig. 3 Length and diameter of new shoots during growth

油茶春梢生長過程中新葉和新莖的顏色是春梢生長發(fā)育的重要指標(biāo)，從圖4a 看出：葉綠素A 是新葉中主要的葉綠素成分，4 月2 日至9 日是新葉中葉綠素A 的快速增長期，4 月16 日至5 月14 日為穩(wěn)定期，5 月21 日至6 月4 日葉綠素A 開始了第2 次增長，這與圖2 中葉片顏色變化的規(guī)律一致；葉綠素B 的快速增長期在4 月2 日至9 日，4 月16 日至5 月7 日呈降低趨勢，隨后趨于平穩(wěn)，5 月28 日后稍微增加；類胡蘿卜素在4 月2 日至9 日快速增長后趨于平穩(wěn)，5 月28 日后稍微增加。由此可知，在春梢的生長發(fā)育過程中，葉片中葉綠素A 呈快速增長-平穩(wěn)-增長的變化模式，葉綠素B 呈快速增長-降低-增長的模式，類胡蘿卜素呈增長-平穩(wěn)-增長的模式。從圖4b 看出：油茶春梢生長發(fā)育過程中，新莖中葉綠素A、類胡蘿卜素在經(jīng)過短暫的升高之后呈降低趨勢；葉綠素B 呈降低趨勢,在5 月21 日之后，未檢測到葉綠素B。由圖2～4 可以看出：油茶春梢生長過程中新葉、新莖中葉綠素A 含量變化與春梢的生長變化表現(xiàn)出相似的規(guī)律，說明新葉、新莖中葉綠素A 含量可以作為評價油茶春梢生長的一項(xiàng)指標(biāo)。

圖4 春梢生長過程中新葉（a）與新莖（b）葉綠素含量Fig. 4 Chlorophyll concentration of new leaves (a) and stems (b) during the new shoots growth

3.3 油茶成花啟動部位及時間

油茶花發(fā)育與春梢的生長同時進(jìn)行，花發(fā)生于混合芽的第一輪苞片內(nèi)側(cè)（圖5）。對油茶春梢生長過程中的花芽進(jìn)行解剖，在春梢剛剛形成時（4 月2 日），外側(cè)無法看見花芽（圖5a），剝?nèi)ネ鈧?cè)第1 片苞片，發(fā)現(xiàn)花芽原基已經(jīng)形成，生長于剝開第一輪苞片的混合芽上（圖5b）或者第一輪苞片內(nèi)側(cè)（圖5c），第1 片萼片已經(jīng)開始分化。為進(jìn)一步確認(rèn)花芽的發(fā)生部位， 4 月16 日后再次剝?nèi)セ旌涎浚▓D5d）的外側(cè)第1 片萼片，可見已經(jīng)完成形態(tài)分化的第1 片萼片（圖5e），去除花芽的萼片可以看到內(nèi)側(cè)花芽的萼片正在分化（圖5f）。5 月14 日可見混合芽外側(cè)第1 片萼片明顯向外凸起（圖5g），剝?nèi)サ? 片萼片后可見混合芽的兩側(cè)形成了2 個花芽，中間為葉芽（圖5h），花芽和葉芽萼片均為綠色。6 月4 日可見花芽突破混合芽外側(cè)萼片生長出來（圖5i），花芽萼片為紅褐色，葉芽萼片為綠色。此外，可以看出混合芽分化的早期，葉芽的生長勢優(yōu)于花芽，但隨著混合芽以及花芽的生長發(fā)育，花芽的生長勢逐漸優(yōu)于葉芽。

注：b、c 是a 中的混合芽去除最外側(cè)苞片；e 是d 中的混合芽去除最外側(cè)苞片，f 是e 中的花芽去除一片萼片；h 是g 中的混合芽去除最外側(cè)苞片。a、d、g、i 中的插圖是取樣時枝條的圖片。b、c 中的插圖是白色箭頭所指的部位的放大圖。mb：混合芽；lb：葉芽；fb：花芽。Notes: The flower bud in b and c was the mix bud in a with the outermost bract removed. The mix bud in e was the mix bud in d with the outermost bract removed, and the flower bud in f was the flower bud in e with one sepal removed. The mix bud in h was the mix bud in g with the two outermosts bract removed. Inserts in panels a, d, g and i are the pictures of the new shoots at sampling time. Inserts in panels b and c were enlargements of the areas indicated by the white arrows. mb: mix bud, lb: leaf bud, fb: flower bud.

3.4 花芽分化形態(tài)特征

長林53 號油茶花芽分化分為三個時期：萼片分化期、花瓣分化期、雌雄蕊分化期。在油茶花芽萼片分化期（圖6a～c），首先芽原基形成并向上凸起（圖6a），花芽原基的側(cè)邊形成萼片（圖6b），在萼片分化的過程中萼片外側(cè)開始出現(xiàn)絨毛（圖6c），萼片分化完成后，花芽原基頂部呈半球形（圖6d），花芽分化進(jìn)入花瓣分化期（圖6d～j），花芽原基先分化出1 片花瓣（圖6d），隨后依次分化出第2、3、4、5、6、7 片花瓣（圖6e～j），在花瓣分化的過程中，花芽原基逐漸呈扁平狀變大并向內(nèi)凹陷。接著，進(jìn)入雌雄蕊分化期（圖6k～o），雄蕊原基早于雌蕊原基向外凸起形成（圖6k），在雄蕊原基分化出第1 圈雄蕊的同時，雌蕊開始形成（圖6l），然后雄蕊原基開始分化出第2、3、4圈雄蕊，雌蕊進(jìn)行形態(tài)的分化（圖6m～n）至形態(tài)分化完成（圖6o～p）。

注：萼片分化期（a～c），花瓣分化期（d～j），雌雄蕊分化期（l～o），形態(tài)分化基本完成（p）。fbp：花芽原基；s：萼片；p：花瓣；sp：雄蕊原基；pp：雌蕊原基；st：雄蕊：pi：雌蕊。下同。Notes: Sepal differentiation stage (a-c), petal differentiation stage(d-j), gynoecium and stamens differentiation stage (l-o),morphological differentiation was almost complete (p). fbp: flower bud primordium; s: sepal; p: petal; sp: stamen primordium; pp: pistil primordium; st: stamen; pi: pistil. The same below.

同時，筆者還研究了花芽分化過程中葉芽與花芽的區(qū)別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，花芽的萼片分化期也是葉芽的萼片分化期，此時花芽原基和葉芽原基形態(tài)上沒有明顯的區(qū)別（圖7a），花芽分化進(jìn)入花瓣分化期后，葉芽逐漸停止分化并進(jìn)入休眠階段（圖7b），花芽原基繼續(xù)分化出多個花瓣（圖7c），這表明花瓣是花芽區(qū)別于葉芽的特異性器官。

注：a 為萼片分化期，b、c 分別為花瓣分化完成時的葉芽和花芽；fbp：花芽原基；lbp：葉芽原基。Notes: The flower bud primordium and leaf bud primordium in a were at the stage of sepal differentiation, The leaf bud primordium and flower bud primordium in b and c respectively were at the stage of petal differentiation. fbp: flower bud primordium; lbp: leaf bud primordium;

4 討論

開花是高等植物的生長發(fā)育事件，不僅涉及到物種遺傳信息的傳遞、種群的繁衍、種群數(shù)量的控制、物種的多樣性，還涉及到農(nóng)藝作物的產(chǎn)量與經(jīng)濟(jì)效益[10-11]。植物開花由內(nèi)部遺傳因素和外部環(huán)境因素共同決定，在感知外界環(huán)境信號改變的同時協(xié)調(diào)自身的發(fā)育狀態(tài)，選擇最合適的時期開花，最大程度地保證物種的延續(xù)[4]。對植物開花調(diào)控過程的描述并沒有明確的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，周琴等[3]認(rèn)為，高等植物的開花包括成花誘導(dǎo)、花發(fā)育和開花三個階段；在《植物細(xì)胞分化與器官發(fā)生》中，作者認(rèn)為植物開花的第一步是開花啟動，開花啟動包括成花誘導(dǎo)和成花信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，開花啟動后進(jìn)入花器官屬性決定和發(fā)生階段[12]。在擬南芥、水稻等1 年生草本植物中，營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變標(biāo)志著成花的開始，因此，成花轉(zhuǎn)變通常被用來表示成花的起始。在芒果（Mangifera indicaL.）、蘋果（Malus domesticaMill.）、甜櫻桃（Rubus idaeus(L.)Moench.）、麻風(fēng)樹（Jatropha curcasL.）等多年生木本植物中，成花的起始包括生命周期中的成花起始和年生長周期中的成花起始，通常用成花啟動來表示年生長周期中成花的開始[13-15]。在茶樹研究中，筆者認(rèn)為開花分為成花誘導(dǎo)、成花轉(zhuǎn)變、花器官分化，茶樹的花芽分化分為初分化期、萼片形成期、花瓣形成期、雌蕊和雄蕊形成期[9]；在胡玉玲等[16-17]對油茶花發(fā)育的研究中認(rèn)為，植物成花包括成花誘導(dǎo)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、花芽原基形成、花器官分化5 個階段，并將前2 個階段劃分為生理分化期，認(rèn)為在該階段植物莖尖分生組織形態(tài)上沒有明顯的變化，但是內(nèi)部的基因表達(dá)和生理指標(biāo)卻發(fā)生了顯著的變化。由以上研究可知，既然成花誘導(dǎo)和成花信號轉(zhuǎn)導(dǎo)階段都沒有明顯的形態(tài)學(xué)變化，那么如何從形態(tài)學(xué)上確認(rèn)這一事件已經(jīng)發(fā)生？在本研究中，作者將成花誘導(dǎo)、成花信號轉(zhuǎn)導(dǎo)階段統(tǒng)稱為成花啟動階段，花芽原基形成作為成花啟動的形態(tài)學(xué)標(biāo)志。

油茶屬于多年生常綠樹種，秋冬開花，當(dāng)年生春梢為主要的結(jié)果枝[18-20]。春梢一般在3 月下旬萌發(fā)，其生長受水肥條件、激素水平的影響，春梢的生長與花芽分化、果實(shí)產(chǎn)量高度相關(guān)[21-25]。在春梢生長展葉的同時，春梢的頂部和葉腋形成頂芽和腋芽，頂芽和腋芽在4 月份春梢停止生長時也基本停止生長，花芽分化在春梢基本結(jié)束生長后開始[5]。油茶花芽分化通常分為前分化期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房與花藥形成期、雌雄蕊成熟期6 個時期，因品種的差異油茶花芽分化開始的時間從5 月上旬至6 月初不等[6-7]，花芽分化時間也受水肥條件的影響[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，油茶在春梢生長與展葉的同時，花芽原基在頂芽或腋芽中形成并進(jìn)入萼片分化階段，油茶的頂芽和葉芽均為混合芽，花芽原基形成于混合芽基部。因此，認(rèn)為在這一階段之前油茶的成花誘導(dǎo)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)就已經(jīng)開始了，油茶花芽原基的形成與春梢的萌動同時發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，油茶春梢生長的3 個階段（快速生長階段、平緩生長階段、生長完成）分別與萼片分化期、花瓣分化期、雌雄蕊分化期依次對應(yīng)，而不是春梢生長基本完成后開始花芽分化。這與其它研究者關(guān)于花芽分化的研究結(jié)果不一致，但筆者發(fā)現(xiàn)春梢基本生長完成時，油茶進(jìn)入花瓣分化初期，即花特異性器官出現(xiàn)。因此，本研究認(rèn)為袁德義等[8]、王湘南等[9]研究中的前分化期、萼片形成期均為油茶的萼片形成期，且萼片形成期的起始時間還應(yīng)向前推至春梢生長階段。萼片分化階段的花芽原基從形態(tài)上與葉芽原基沒有明顯的差異，花瓣的出現(xiàn)是油茶花芽分化中花芽區(qū)別于葉芽的特異性器官，本研究將其出現(xiàn)的時間確定為油茶完成成花啟動的時間。既然在春梢生長的同時花芽原基形成，那么成花誘導(dǎo)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的時間必然早于這個時間，這也表明油茶的成花誘導(dǎo)和春梢萌動的誘導(dǎo)為同一誘導(dǎo)過程，同時也暗示著成年油茶春梢的萌動即啟動成花。

5 結(jié)論

成年油茶花芽原基形成于春梢頂芽或腋芽基部，春梢萌動即成花啟動，春梢生長發(fā)育與花芽分化同時進(jìn)行?；ò晔怯筒杌ㄑ糠只瘏^(qū)別于葉芽分化的特異性器官，花瓣出現(xiàn)的時間為形態(tài)學(xué)上油茶完成成花啟動的時間。油茶春梢生長的快速生長階段、平緩生長階段、生長完成階段分別與萼片分化期、花瓣分化期、雌雄蕊分化期依次對應(yīng)。