徐紅斌, 張申平, 杜茹蕓, 周 靜, 翁史昱

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院,國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(乳及乳制品檢測(cè)與監(jiān)控技術(shù)),上海 200233)

近年來(lái),人們對(duì)保健食品的需求與日俱增,尤其是減肥和壯陽(yáng)類產(chǎn)品格外受到人們的青睞,然而該類產(chǎn)品檢出非法添加藥物的情況屢見(jiàn)不鮮。不法商家為了達(dá)到產(chǎn)品宣稱的保健功效,在產(chǎn)品中超量、超范圍添加處方藥及其類似物或者衍生物,給消費(fèi)者的身體健康造成了隱患。為嚴(yán)厲打擊非法添加行為、保護(hù)消費(fèi)者身體健康,需要開(kāi)發(fā)快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法用于減肥及壯陽(yáng)類非法添加藥物的檢測(cè)。

目前常用的非法添加檢驗(yàn)方法主要有薄層色譜法[1-3]、液相色譜法[4-6]、常規(guī)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-9],這些方法大都存在選擇性差、干擾多、定性不準(zhǔn)確等缺點(diǎn)。作為質(zhì)譜分析器的突破性技術(shù),Orbitrap通過(guò)靜電場(chǎng)軌道阱的方式提供高分辨率及精確離子質(zhì)量數(shù),最高分辨率可達(dá)240 000 FWHM (full width at half maxima)以上。目前已有報(bào)道使用超高效液相色譜-Orbitrap高分辨質(zhì)譜對(duì)保健食品中非法添加藥物進(jìn)行檢測(cè)。譚會(huì)潔等[10]報(bào)道了保健食品中15種減肥類化合物的超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜篩查方法,建立了篩查數(shù)據(jù)庫(kù),采用Hypersil gold C18色譜柱分離,正負(fù)離子模式同時(shí)掃描,回收率達(dá)到79.7%～95.4%,但未就數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用時(shí)各項(xiàng)參數(shù)的意義進(jìn)行說(shuō)明。黃澤瑋等[11]建立了基于超高效液相色譜-Orbitrap-Elite高分辨質(zhì)譜的快速篩查及確證減肥及壯陽(yáng)類保健食品和中成藥中54種非法添加物的方法,采用Hypersil gold C18色譜柱在28 min內(nèi)完成54種目標(biāo)化合物的分離,全掃描/數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)掃描(Full MS/dd-MS2)模式完成高精度一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息采集,但在建立數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)僅涉及正離子模式。洪燈等[12]針對(duì)不法商家用非法添加藥物的類似物來(lái)規(guī)避法定方法檢測(cè)的現(xiàn)象,開(kāi)展了超高效液相色譜-Orbitrap高分辨質(zhì)譜法篩查保健食品中西布曲明及其衍生物的檢測(cè)方法,定量限為25 μg/kg,加標(biāo)回收率為93.5%～103.5%,但標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍僅為0.5～20 μg/L,對(duì)于高濃度的檢出值需要多次稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度中值附近進(jìn)行測(cè)定,容易引入不確定度因子。我國(guó)現(xiàn)行的保健食品中非法添加藥物的檢測(cè)方法有BJS 201710《保健食品中75種非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè)》和BJS 201805《食品中那非類物質(zhì)的測(cè)定》,覆蓋了絕大部分可能的非法添加藥物,但隨著藥物研發(fā)的推進(jìn),非法添加藥物的衍生物及類似物日益增多,也應(yīng)將其納入檢測(cè)范圍。

本文將Orbitrap高分辨質(zhì)譜用于減肥及壯陽(yáng)類保健食品中32種非法添加藥物的快速篩查及確證,在對(duì)比正負(fù)離子模式下各化合物響應(yīng)強(qiáng)度的基礎(chǔ)上建立了高分辨質(zhì)譜信息庫(kù),總結(jié)了數(shù)據(jù)庫(kù)建立及篩查數(shù)據(jù)分析的要點(diǎn),對(duì)提取溶劑、色譜柱溫度等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了詳細(xì)探究,盡可能給出了較寬的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍。通過(guò)Full MS/dd-MS2模式,在17 min內(nèi)完成了目標(biāo)物的分離和碎片離子質(zhì)量數(shù)的采集,并通過(guò)TraceFinder軟件完成數(shù)據(jù)分析。本方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的特點(diǎn),有助于打擊保健食品的非法添加行為。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo Q Exactive PLUS超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)包括vanquish VF-P10-A液相色譜系統(tǒng)及Orbitrap高分辨質(zhì)譜;Xcalibur 4.3軟件用于質(zhì)譜儀器控制及數(shù)據(jù)采集;TraceFinder 5.0軟件用于數(shù)據(jù)分析;電子天平(感量0.1 mg,MS204S,德國(guó)Mettler Toledo公司);離心機(jī)(Centrifuge 5804);渦旋振蕩器(Reax Control,德國(guó)Heidolph);超純水器(美國(guó)Millipore)。

大黃素(emodin,純度>98.0%)、他達(dá)拉非甲基氯化物(chlorpretadalafil,純度>98.0%)以及其余30種非法添加藥物對(duì)照品溶液(100 mg/L,甲醇)購(gòu)自上海普譽(yù)科貿(mào)有限公司。HPLC級(jí)甲醇(純度>99.9%)購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,HPLC級(jí)乙醇(純度>99.9%)購(gòu)自默克股份兩合公司,甲酸(分析純)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

48份保健食品(片劑、硬膠囊、粉劑、口服液、酒類)來(lái)自上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院監(jiān)督抽樣。樣品種類包括靈芝孢子粉、氨基酸口服液、保健酒類、西洋參含片及膠囊,基質(zhì)成分較為復(fù)雜,主要成分為天然成分、羧甲基纖維素鈉、淀粉、蔗糖、葡萄糖。陰性樣品均屬于監(jiān)督抽檢項(xiàng)目中按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法未檢出的樣品,隨機(jī)挑選未檢出的片劑、粉劑、硬膠囊(內(nèi)容物)樣品混合均勻,作為陰性固體樣品基質(zhì);挑選未檢出的口服液、酒類樣品混合均勻,作為陰性液體樣品基質(zhì)。

1.2 對(duì)照品溶液的配制

稱取適量大黃素和他達(dá)拉非甲基氯化物對(duì)照品,分別用乙醇和50%(v/v,下同)甲醇水溶液配制成1 000 mg/L的儲(chǔ)備液,再分別用甲醇稀釋至100 mg/L;分別取32種對(duì)照品溶液,以甲醇稀釋為5 mg/L的混合對(duì)照品溶液Ⅰ,再以甲醇稀釋為500 μg/L的混合對(duì)照溶液Ⅱ。上述溶液均保存在-20 ℃冰箱,臨用前取出恢復(fù)至室溫。

取混合對(duì)照品溶液Ⅱ,以陰性基質(zhì)提取液逐級(jí)稀釋為1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 μg/L的系列對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 供試品溶液的制備

片劑研細(xì)后備用,硬膠囊取內(nèi)容物粉末備用,粉劑、口服液、酒類可直接稱取。精密稱定0.5 g樣品置于15 mL具塞離心管中,加入10 mL 50%甲醇水溶液,振蕩混合均勻,25 ℃下恒溫超聲提取15 min,超聲功率53 kHz,于5 000 r/min離心2 min,上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜,濾液即為供試品溶液。對(duì)于濃度超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線上限的待測(cè)液,需用50%甲醇水溶液適當(dāng)稀釋后再次測(cè)定。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜

色譜柱為Thermo Hypersil gold vanquish (100 mm×2.1 mm,1.9 μm),柱溫:25 ℃,流速:0.3 mL/min,流動(dòng)相A:0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B:0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脫程序:0～2 min,10%B;2～8 min,10%B～90%B;8～10 min,90%B;10～11 min,90%B～10%B;11～14 min,10%B。進(jìn)樣量:5 μL。

1.4.2質(zhì)譜

離子源:可加熱電噴霧離子源(HESI);離子源溫度:325 ℃;噴霧電壓:3.50 kV(正離子模式),2.8 kV(負(fù)離子模式);透鏡電壓:50.0 V;鞘氣流速:40 arb;輔助氣流速:10 arb;輔助氣溫度:350 ℃;掃描模式:Full MS/dd-MS2;采集范圍:m/z100.0～1 000.0;一級(jí)質(zhì)譜分辨率為70 000 FWHM;自動(dòng)增益控制目標(biāo)離子數(shù)(AGC target):1×106;C-trap最大注入時(shí)間:200 ms;二級(jí)質(zhì)譜分辨率17 500 FWHM;AGC target:2×105;C-trap最大注入時(shí)間:60 ms;歸一化碰撞能(NCE):20%/40%/60%;動(dòng)態(tài)排除:8.0 s。各個(gè)化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 32種化合物的UHPLC-HRMS分析參數(shù)Table 1 UHPLC-HRMS parameters for the 32 compounds

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

1.4.3定性篩查條件

目標(biāo)峰面積閾值設(shè)置為50 000,以排除部分雜峰的影響,減少篩查時(shí)間,信噪比閾值設(shè)置為10,精確質(zhì)量數(shù)偏差設(shè)置為5×10-6;保留時(shí)間的判定模式設(shè)置為confirm,保留時(shí)間窗口寬度為30 s;碎片離子判定模式設(shè)置為confirm,最小匹配度為1個(gè)碎片離子,碎片離子強(qiáng)度閾值為5 000,碎片離子質(zhì)量數(shù)偏差為1×10-5;同位素篩查可作為目標(biāo)峰的補(bǔ)充篩查信息,啟用時(shí)判定模式為confirm,匹配度閾值為90%,質(zhì)量數(shù)偏差為1×10-5,強(qiáng)度偏差為20%。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察

參考相關(guān)文獻(xiàn)[10,12],分別考察了甲醇、乙腈、50%甲醇水溶液、50%乙腈水溶液對(duì)基質(zhì)加標(biāo)樣品中32種化合物的超聲提取效果。結(jié)果表明,以50%甲醇水溶液進(jìn)行提取,32種化合物在固體基質(zhì)和液體基質(zhì)中的回收率均高于其他3種提取溶劑,其中那非乙酰酸在3個(gè)水平(0.2、0.6、1.0 mg/kg)下的加標(biāo)回收率平均值分別由42.8%、52.1%、66.7%提高到70.2%、88.3%、92.4%,苯佐卡因的加標(biāo)回收率平均值由34.1%、39.4%、48.4%提高到78.6%、91.2%、109.3%,氯卡色林的加標(biāo)回收率平均值由36.3%、49.5%、64.6%提高到76.1%、88.5%、94.4%。將超聲處理時(shí)間由15 min延長(zhǎng)至20 min,提取效果沒(méi)有明顯增加?？紤]到節(jié)省樣品前處理時(shí)間,本實(shí)驗(yàn)選擇50%甲醇水溶液作為提取溶劑,超聲提取15 min。

為選擇合適的流動(dòng)相,本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水、10 mmol/L乙酸銨乙腈-0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果。結(jié)果表明,0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水流動(dòng)相體系中,去乙基伐地那非、去甲基西地那非、羥基伐地那非均在7.27 min出峰,未能完全分開(kāi);10 mmol/L乙酸銨乙腈-0.1%甲酸水體系中,去甲他達(dá)拉非、羥基硫代豪莫西地那非的響應(yīng)值降低1個(gè)數(shù)量級(jí),苯佐卡因的響應(yīng)值降低2個(gè)數(shù)量級(jí)。相比而言,0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水體系可獲得最佳的色譜峰形和分離效果,不同化合物在合適的正負(fù)離子模式下均能獲得較高的響應(yīng)值。

柱溫對(duì)分離效果也有一定的影響,分別考察了25、30、35 ℃下的分離情況,發(fā)現(xiàn)提高柱溫至35 ℃時(shí),去甲基硫代西地那非在其保留時(shí)間附近存在干擾峰,影響峰積分,同時(shí)各化合物保留時(shí)間減小,如達(dá)泊西汀的保留時(shí)間由6.67 min前移至6.61 min,保留時(shí)間整體偏移較小,在30 s的保留時(shí)間判定窗口中仍可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)峰的判定。另外部分化合物出現(xiàn)了多次保留的情況,如鹽酸N,N-雙去甲基西布曲明在6.30 min和6.59 min出現(xiàn)了兩次保留,烏地那非在5.80 min和6.16 min出現(xiàn)了兩次保留。相比而言,25 ℃柱溫下,各化合物峰形對(duì)稱,去甲基硫代西地那非與基質(zhì)中的干擾物質(zhì)可完全分離,有利于峰積分。因此確定最佳柱溫為25 ℃。

綜上,最終確定了1.4節(jié)的色譜條件,加標(biāo)量為1.0 mg/kg的陰性樣品提取液(供試品溶液質(zhì)量濃度50 μg/L)中各目標(biāo)化合物的提取離子色譜圖見(jiàn)圖1。在現(xiàn)有色譜條件下,氫氯噻嗪、羥基伐地那非、去乙基紅地那非保留時(shí)間在3～6 min內(nèi)的峰形并不是非常理想,這是因?yàn)楣┰嚻啡芤旱娜軇?50%甲醇水)與流動(dòng)相(0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水)不一致而產(chǎn)生了輕微的溶劑效應(yīng),但其余29種化合物峰形良好、基線干凈。為了探究該現(xiàn)象是否會(huì)影響低濃度下這3種化合物的定性定量檢測(cè),調(diào)整供試品溶液的濃度為10 μg/L(基質(zhì)加標(biāo)水平0.2 mg/kg),測(cè)試結(jié)果表明這3種化合物的響應(yīng)很強(qiáng),峰面積在3×106～6×106之間,且在保留時(shí)間附近的基線非常干凈,說(shuō)明輕微的溶劑效應(yīng)并不影響低濃度下這3種化合物定性和定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

固體基質(zhì)包括靈芝孢子粉、西洋參含片及硬膠囊,主要成分是天然成分、羧甲基纖維素鈉、淀粉、蔗糖,液體基質(zhì)包括氨基酸口服液及酒類,主要成分為糖類、氨基酸,這些成分會(huì)干擾目標(biāo)化合物的分離和檢測(cè)[13-15]。以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率的比值考察基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME),ME值小于0.80或者大于1.10,存在強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng),反之基質(zhì)效應(yīng)較弱。結(jié)果表明32種化合物在固體基質(zhì)中的ME值為0.61～0.95,其中硫代豪莫西地那非、去甲基硫代西地那非、他達(dá)拉非甲基氯化物的ME值較低,分別為0.61、0.70、0.63;在液體基質(zhì)中的ME值為0.73～1.09,其中羥基紅地那非、硫代豪莫西地那非的ME值為0.73、0.75;可見(jiàn)部分化合物在兩種基質(zhì)中存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng),因此分別使用固體陰性基質(zhì)和液體陰性基質(zhì)提取液配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,降低基質(zhì)效應(yīng)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性范圍和檢出限

分別將兩種基質(zhì)提取液配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在最優(yōu)條件下進(jìn)樣,每個(gè)濃度平行測(cè)定3次,以平均峰面積(y)對(duì)其質(zhì)量濃度(x,μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到相關(guān)系數(shù)(r2)。所有的化合物在合適的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r2均大于0.99。在空白基質(zhì)樣品中進(jìn)行低濃度加標(biāo)試驗(yàn),計(jì)算信噪比,當(dāng)供試品溶液的質(zhì)量濃度為1 μg/L時(shí)(氯噻酮、去甲基硫代西地那非供試品溶液質(zhì)量濃度為2 μg/L),有23種化合物的信噪比顯示為“INF”,其余9種化合物的信噪比在50～240之間。若以3倍信噪比(S/N=3)對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算檢出限,則該值遠(yuǎn)低于現(xiàn)有值,不具備實(shí)際意義,因此本研究以1 μg/L計(jì)算檢出限,結(jié)果見(jiàn)表2。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍最低點(diǎn)為5 μg/L,最高濃度點(diǎn)根據(jù)化合物不同而分別為200、500 μg/L;液體樣品中32種化合物的檢出限為0.02 mg/kg,固體樣品中29種化合物的檢出限為0.02 mg/kg,氯噻酮、去甲基硫代西地那非和烏地那非的檢出限為0.04 mg/kg。以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點(diǎn)計(jì)算定量限為0.1 mg/kg。

表2 32種化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients (r2),and LODs of the 32 compounds

2.3.2重復(fù)性

各取6份固體基質(zhì)和液體基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn),加標(biāo)水平為0.2 mg/kg,每份樣品平行測(cè)定3次,取結(jié)果平均值計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),考察重復(fù)性。結(jié)果表明32種化合物峰面積的RSD為0.35%～3.1%,均小于5%,說(shuō)明該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.3.3精密度

取一份加標(biāo)樣品溶液在一日內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)(共6個(gè)時(shí)間點(diǎn),間隔4 h)測(cè)定,計(jì)算RSD值,記為日內(nèi)精密度;在不同日期(連續(xù)5 d內(nèi)的同一時(shí)間)測(cè)定,計(jì)算RSD值,記為日間精密度。32種化合物的日內(nèi)精密度均小于6.5%,日間精密度均小于10%,說(shuō)明測(cè)試方法精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性

按照1.2節(jié)和1.3節(jié)分別制備對(duì)照品溶液和樣品溶液,同一份對(duì)照品溶液和陽(yáng)性樣品溶液在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣,計(jì)算RSD值,考察穩(wěn)定性。標(biāo)準(zhǔn)溶液中32種化合物的峰面積RSD為0.42%～2.7%,均小于3%,表明32種化合物在測(cè)定時(shí)間8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。大黃素陽(yáng)性樣品溶液在8 h內(nèi)進(jìn)樣5次，大黃素峰面積的RSD為1.4%，說(shuō)明樣品提取液在測(cè)定時(shí)間內(nèi)非常穩(wěn)定。

2.3.5回收率

精密稱取兩種陰性基質(zhì),分別加入5 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液20、60、100 μL,按照1.3節(jié)的方法進(jìn)行樣品處理,對(duì)應(yīng)的加標(biāo)水平為0.2、0.6、1.0 mg/kg。平行測(cè)定6次,計(jì)算回收率平均值和RSD,結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明,固體基質(zhì)中除達(dá)泊西汀、羥基硫代豪莫西地那非、硫代豪莫西地那非、硫代西地那非、去甲基硫代西地那非的回收率較低外,其余27種化合物的回收率為50.5%～84.5%,RSD為1.2%～13%,液體基質(zhì)中32種化合物的回收率范圍為60.4%～109.3%,RSD為0.77%～8.2%。

表3 不同陰性基質(zhì)中3個(gè)添加水平下的32種化合物的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of the 32 compounds spiked in different blank samples at three levels (n=6)

總體而言,固體基質(zhì)加標(biāo)樣品中32種化合物在3個(gè)加標(biāo)濃度下的回收率略低于液體基質(zhì)加標(biāo)樣品,可能是因?yàn)楣腆w樣品在50%甲醇水提取液中存在不溶物,產(chǎn)生的吸附作用造成提取不徹底。這就導(dǎo)致即使采用了基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,部分化合物回收率依然較低的情況。如硫代豪莫西地那非在固體基質(zhì)中的回收率為23.4%～49.8%,低于液體基質(zhì)的回收率64.9%～88.5%,但其在兩種基質(zhì)中的檢出限均能達(dá)到0.02 mg/kg,即當(dāng)供試品溶液質(zhì)量濃度低至1 μg/L時(shí),連續(xù)3針進(jìn)樣都能保證準(zhǔn)確定性。另外藥物非法添加的濃度均較高[10,14-18],綜合考慮本方法的檢出限和回收率能滿足定性篩查的需要。

2.4 建立HRMS數(shù)據(jù)庫(kù)及篩查方法

分別以50%甲醇水溶液稀釋對(duì)照品溶液,得到2 mg/L或5 mg/L的32種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用單針進(jìn)樣的方式分別在正負(fù)離子模式下進(jìn)行Full MS/dd-MS2掃描,對(duì)比響應(yīng)強(qiáng)度,選擇合適的掃描模式、離子碎片精確質(zhì)量數(shù),在TraceFinder軟件中輸入至method development→compound database文件(.cdb)中。其中,高分辨一級(jí)質(zhì)譜圖用于化合物的篩查、鑒定和定量,二級(jí)質(zhì)譜圖用于化合物的確認(rèn)。

調(diào)用上述.cdb文件,建立screening master method用于快速篩查定性,篩查條件的設(shè)置同1.4.3節(jié)。調(diào)用上述.cdb文件,建立quan master method用于陽(yáng)性樣品定量。關(guān)聯(lián)較高濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的.raw文件(較高濃度以方便找到對(duì)應(yīng)的化合物峰位置),確定陽(yáng)性檢出化合物的峰積分時(shí)間窗口、峰平滑點(diǎn)數(shù),設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線類型為外標(biāo)法,指定標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)數(shù)和對(duì)應(yīng)的濃度值,上述操作可批量進(jìn)行。當(dāng)目標(biāo)峰、保留時(shí)間、碎片離子、同位素豐度比的篩查條件都通過(guò)時(shí),TraceFinder軟件的分析結(jié)果顯示flag為綠燈,則可認(rèn)為該化合物呈陽(yáng)性。

本研究對(duì)TraceFinder軟件篩查條件設(shè)置相關(guān)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行了總結(jié),如下:保留時(shí)間是篩查分析中除了質(zhì)量精度之外最重要的參數(shù),其提供的是與質(zhì)譜正交維度的信息,尤其對(duì)痕量物質(zhì)的篩查至關(guān)重要。當(dāng)自建數(shù)據(jù)庫(kù)中的保留時(shí)間與樣品采集方法相匹配時(shí),建議將保留時(shí)間作為篩查條件。關(guān)于匹配模式的選擇,選擇identify時(shí),意味著保留時(shí)間是化合物確證的必要條件,若此條件不滿足要求,則不進(jìn)行后續(xù)碎片離子和同位素豐度比的篩查;若選擇confirm,意味著保留時(shí)間是化合物確證的一個(gè)可選條件,若此條件不滿足要求,還是需要進(jìn)行后續(xù)其他條件的匹配,比如碎片離子、同位素信息等。同位素信息在高分辨質(zhì)譜中非常重要,是對(duì)一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)的有效補(bǔ)充,建議啟用,但應(yīng)考慮到目標(biāo)物在復(fù)雜基質(zhì)中含量很低時(shí),同位素豐度比會(huì)更低,可能會(huì)影響同位素的匹配。另外在碎片離子的判定中,若在TraceFinder軟件的篩查結(jié)果中未看到化合物碎片離子的判定結(jié)果,但在數(shù)據(jù)瀏覽器中可提取到碎片離子信息,則可將篩查條件中碎片離子的強(qiáng)度閾值進(jìn)一步降低,查找相應(yīng)的碎片離子信息。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

將Xcalibur軟件采集的.raw原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入至TraceFinder軟件,調(diào)用screening master method進(jìn)行快速定性篩查,同步采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行32種化合物的定量分析。

在48份樣品中只有1份某公司生產(chǎn)的減肥茶檢出大黃素成分,檢出率2.08%，檢出含量平均值為0.37 mg/kg。查配料表發(fā)現(xiàn)該樣品含有決明子,而決明子富含大黃酚、大黃素、決明素[19],加之檢出濃度較低,可認(rèn)為大黃素為內(nèi)源性成分,并非非法添加。陽(yáng)性樣品中大黃素的提取離子色譜圖、一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖、二級(jí)質(zhì)譜圖及數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比圖見(jiàn)圖2、圖3。大黃素的[M-H]-離子實(shí)測(cè)保留時(shí)間和理論保留時(shí)間偏差為0 s,一級(jí)質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)實(shí)測(cè)值與理論值偏差為-1.08×10-6,兩個(gè)二級(jí)碎片離子質(zhì)量數(shù)偏差分別為5.11×10-6和0.9×10-6,上述結(jié)果均符合篩查方法中設(shè)置的控制條件,對(duì)應(yīng)的篩查結(jié)果標(biāo)記為綠燈,最終flag為綠燈,表明分析軟件判定該樣品中檢出了大黃素?；趂lag的標(biāo)記情況,使用該HRMS數(shù)據(jù)庫(kù)和篩查方法可進(jìn)行快速篩查,嚴(yán)格的篩查條件降低了假陰性和假陽(yáng)性的概率。

圖2 陽(yáng)性樣品中大黃素的提取離子色譜圖和全掃描質(zhì)譜圖Fig.2 Extracted ion chromatogram and full scan mass spectrum of emodin positive sample

圖3 大黃素陽(yáng)性樣品的二級(jí)質(zhì)譜圖及其TraceFinder數(shù)據(jù)庫(kù)譜圖Fig.3 MS2 spectra of emodin in positive sample and TraceFinder database

3 結(jié)論

本研究基于實(shí)際檢測(cè)工作需要建立了減肥和壯陽(yáng)類保健食品中非法添加藥物的快速篩查和確證方法,依靠TraceFinder軟件建立的高分辨數(shù)據(jù)庫(kù),完成了快速定性篩查和定量分析,總結(jié)了數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用過(guò)程中的要點(diǎn)。本方法樣品前處理簡(jiǎn)單,靈敏度高,篩查分析準(zhǔn)確,自動(dòng)化程度高,適用于同時(shí)篩查和測(cè)定減肥和壯陽(yáng)類保健食品中的非法添加藥物,具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,已應(yīng)用于日常檢測(cè)工作。后續(xù)研究中在增加可篩查非法添加藥物數(shù)量的同時(shí)應(yīng)兼顧峰形和響應(yīng)強(qiáng)度,同時(shí)繼續(xù)深入研究基質(zhì)效應(yīng)對(duì)非法添加藥物篩查的影響規(guī)律。