劉 震

(南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023)

蛋白質(zhì)糖基化與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),臨床上使用的大多數(shù)腫瘤標(biāo)志物是糖基化蛋白質(zhì)。在組學(xué)層次上進(jìn)行位點(diǎn)特異性糖型的分析對發(fā)現(xiàn)新型疾病標(biāo)志物、提高基于蛋白質(zhì)糖基化的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究水平等具有重要作用。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在糖蛋白的分離分析研究中得到了廣泛的應(yīng)用?；谝合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)的完整糖肽鑒定已成為研究蛋白質(zhì)上位點(diǎn)特異性糖鏈修飾的主要手段,其主要優(yōu)勢在于分析過程中可以同時(shí)揭示蛋白位點(diǎn)與糖鏈修飾的信息,從而在組學(xué)層次實(shí)現(xiàn)規(guī)模化的蛋白糖基化分析。但是，與其他翻譯后修飾相比,糖基化具有組成復(fù)雜、相對分子質(zhì)量分布范圍廣的特點(diǎn),因此完整糖肽的數(shù)據(jù)庫檢索空間較大。同時(shí)完整糖肽的質(zhì)譜譜圖較為復(fù)雜。在碰撞誘導(dǎo)碎裂的完整糖肽質(zhì)譜譜圖中,糖鏈產(chǎn)生的碎片離子強(qiáng)度較高,而肽段骨架碎裂不完全,產(chǎn)生的碎片離子強(qiáng)度較低,給完整糖肽的譜圖解析帶來了困難。因此,發(fā)展具有高靈敏度與可信度的質(zhì)譜譜圖鑒定方法是深度解析蛋白糖基化修飾的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

針對上述問題,近日,中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的葉明亮課題組開發(fā)了一款非糖庫依賴的N-糖肽譜圖鑒定軟件Glyco-Decipher用于位點(diǎn)特異性糖型的深度解析[1]。該方法首先匹配N-連接糖鏈的五糖核心結(jié)構(gòu)，確定肽段的相對分子質(zhì)量,通過理論去糖峰實(shí)現(xiàn)肽段骨架的初步鑒定。之后利用肽段骨架的碎裂規(guī)律,基于碎裂特征的模式識別,發(fā)展了譜圖拓展策略進(jìn)一步提高完整糖肽的鑒定靈敏度。該方法不僅顯著提高了完整糖肽譜圖的解析效率,而且實(shí)現(xiàn)了肽段骨架碎裂不完全的完整糖肽的鑒定,在理論去糖峰方法的基礎(chǔ)上將完整糖肽的鑒定數(shù)目提升了31%,提高了揭示糖基化修飾微觀不均一性的能力。與糖肽譜圖解析的其他方法相比，完整糖肽的譜圖解析率提升了34%～179%。該方法在譜圖解析過程中不依賴于已有的糖鏈數(shù)據(jù)庫信息，大大減小了完整糖肽的檢索空間。同時(shí)可以全面系統(tǒng)地揭示樣品中糖鏈修飾的相對分子質(zhì)量分布,發(fā)現(xiàn)未收錄在數(shù)據(jù)庫的新型糖鏈。發(fā)展的單糖步進(jìn)策略利用連續(xù)碎裂的糖鏈離子,確定未知糖鏈的組成及其上所帶有的化學(xué)修飾或生物修飾。在鑒定可信度方面,綜合考慮糖鏈的相對分子質(zhì)量以及碎片離子信息,在譜圖層次將完整糖肽的鑒定假陽性率控制在1%以內(nèi)。此外,基于一級譜的流出曲線信息,實(shí)現(xiàn)糖肽的無標(biāo)記定量,可在樣品層次或具體蛋白位點(diǎn)層次方面考察糖鏈修飾的豐度分布,為后續(xù)的生物學(xué)研究提供了有力工具。

該方法的優(yōu)越性主要體現(xiàn)在5個(gè)方面:(1)通過N-糖鏈的五糖核心特征結(jié)構(gòu)確定肽段骨架的相對分子質(zhì)量,采取非糖庫依賴的肽段優(yōu)先鑒定策略,大大減小了完整糖肽的檢索空間;(2)利用肽段骨架的碎裂特征規(guī)律,發(fā)展了譜圖拓展策略,實(shí)現(xiàn)了低豐度或肽段碎裂不完全糖肽的鑒定;(3)非糖庫依賴譜圖解析實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)庫之外未知糖鏈(如帶修飾糖鏈)的發(fā)現(xiàn)與鑒定;(4)鑒定過程中該方法能夠系統(tǒng)全面地考慮肽段與糖鏈的碎片離子,保證了完整糖肽的鑒定可信度;(5)位點(diǎn)特異性糖型的深度解析提高了糖基化修飾的位點(diǎn)占有率等定量分析考察的準(zhǔn)確度。

上述工作通過利用肽段骨架碎裂規(guī)律的非糖庫依賴檢索策略,在N-糖肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理方面獲得了目前最高的譜圖解析效率,實(shí)現(xiàn)了深度準(zhǔn)確的位點(diǎn)特異性糖型分析,為糖生物學(xué)功能研究提供了新工具。