黑斑蛙歪頭病病原米爾伊麗莎白菌的分離、鑒定及特性分析

李川北，阮陳松杰，吳明波，徐洪森，蘇應(yīng)兵

(1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025；2.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，武漢 430023)

黑斑蛙()屬兩棲綱無(wú)尾目蛙科側(cè)褶蛙屬，又稱黑斑側(cè)褶蛙，在我國(guó)廣泛分布于除海南、云南、西藏、青海和臺(tái)灣以外的各地區(qū)。黑斑蛙肉具有低脂肪、低膽固醇、高蛋白的優(yōu)點(diǎn)，有較高的食用和藥用價(jià)值，是我國(guó)近年來(lái)養(yǎng)殖蛙類中的主要品種之一。其養(yǎng)殖具有投入少、產(chǎn)出高、周期短、效益高等特點(diǎn)，近年來(lái)我國(guó)黑斑蛙養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展十分迅猛。然而，隨著黑斑蛙人工養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，養(yǎng)殖環(huán)境出現(xiàn)惡化，加之不成熟的養(yǎng)殖技術(shù)，黑斑蛙的病害也逐年增多，給養(yǎng)殖戶造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前，已有致病性洛菲不動(dòng)桿菌()、嗜水氣單胞菌()、氣單胞菌、肺炎克雷伯菌()、米爾伊麗莎白菌()、腦膜炎膿毒黃桿菌()和腦膜敗血伊麗莎白菌()等感染黑斑蛙后導(dǎo)致其嚴(yán)重死亡的報(bào)道。

蛙歪頭病，因蛙發(fā)病時(shí)頸部歪斜而得名，該病傳染性強(qiáng)，死亡率高，目前尚無(wú)穩(wěn)定有效的治療方法，是蛙養(yǎng)殖過(guò)程中常見(jiàn)的疾病之一。2019年7月，湖北石首市大垸農(nóng)場(chǎng)養(yǎng)殖黑斑蛙大面積死亡，病蛙出現(xiàn)典型的頭部變歪、單側(cè)或者雙側(cè)眼球渾濁發(fā)白和腹水癥狀，發(fā)病溫度為25～28 ℃，發(fā)病率達(dá)80%，死亡率高達(dá)90%。對(duì)病蛙腦、肝、脾和腎臟進(jìn)行病原菌分離，并通過(guò)病原菌的形態(tài)特征、生理生化特性、16S rRNA基因測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，確定該病原菌的種屬地位；然后通過(guò)人工感染試驗(yàn)和組織病理學(xué)分析確定該病原菌的致病性；最后通過(guò)藥物敏感試驗(yàn)分析該病原菌的藥物敏感性，以期為該病的臨床防治用藥提供科學(xué)指導(dǎo)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蛙

患病黑斑蛙取自湖北省石首大垸農(nóng)場(chǎng)，采集患有歪頭、單側(cè)或者雙側(cè)眼球渾濁發(fā)白和腹水癥狀的黑斑蛙，共20只，平均體重為(48.0±1.0)g；健康黑斑蛙購(gòu)自荊州市棗林鋪黑斑蛙養(yǎng)殖基地，平均體重為(50.0±1.0)g，共140只，暫養(yǎng)于長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)科學(xué)院用于后續(xù)攻毒試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑

LB固體和液體培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博有限公司，革蘭氏染色液和蘇木精伊紅染色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，API 20E試劑盒購(gòu)自法國(guó)梅里埃生化公司，甲醛、二甲苯、無(wú)水乙醇和固體石蠟等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司，Taq酶、dNTPs、細(xì)菌基因組提取試劑盒均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，PCR擴(kuò)增引物合成和擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序均由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司完成。

1.1.3 主要儀器

光學(xué)顯微鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯，PCR儀器購(gòu)自SensoQuest，生物組織石蠟包埋機(jī)購(gòu)自湖北安立信醫(yī)療實(shí)業(yè)有限公司，石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)徠卡。

1.2 病原菌分離純化

無(wú)菌條件下從病蛙腦、肝、脾和腎等部位，用無(wú)菌接種環(huán)取樣后劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，次日挑取平板上優(yōu)勢(shì)菌落，LB固體培養(yǎng)基純化培養(yǎng)24 h，取單菌落培養(yǎng)后4 ℃保存?zhèn)溆?。從腦、肝、脾和腎四種組織中均分離到菌落形態(tài)相同的優(yōu)勢(shì)菌，選取腦組織中分離菌株為研究對(duì)象，暫命名為BSH3。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)分析

將BSH3菌株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌菌落形態(tài)特征與顏色，測(cè)量菌落直徑大小。挑選單菌落用革蘭氏染色液進(jìn)行革蘭氏染色后，顯微鏡觀察細(xì)菌染色特征。

1.3.2 生理生化特性分析

菌株BSH3的生理生化指標(biāo)使用API 20E試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，操作方法詳見(jiàn)該試劑盒說(shuō)明書(shū)，通過(guò)APIweb鑒定軟件判讀試驗(yàn)結(jié)果，并參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)中細(xì)菌生理生化指標(biāo)進(jìn)行確認(rèn)。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定

將菌株從LB培養(yǎng)基上用蒸餾水洗脫下來(lái)，8 000離心10 min收集菌體。按細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提細(xì)菌基因組DNA，提取的總DNA即作為PCR擴(kuò)增模板。用細(xì)菌通用性引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行16S rRNA基因PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至武漢擎科生物科技有限公司測(cè)序，通過(guò)GenBank中的BLAST程序進(jìn)行序列同源性分析。下載GenBank中相關(guān)細(xì)菌16S rRNA 基因序列，通過(guò)Clustal X軟件進(jìn)行多重比對(duì)，用MEGA 6.0 軟件中鄰接法(neighbor joining，NJ)構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 組織病理學(xué)觀察

取自然發(fā)病黑斑蛙的腦、肝、脾和腎組織(0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm)，置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h后，進(jìn)行常規(guī)石蠟切片和HE染色，Olympus顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.5 人工感染試驗(yàn)

健康黑斑蛙試驗(yàn)前在50 cm×40 cm×30 cm的塑料筐中暫養(yǎng)2周，每框20只，共7框。框中加入曝氣水使其淹過(guò)黑斑蛙背部，并放入一塊泡沫板。暫養(yǎng)和試驗(yàn)期間水溫保持在25～28 ℃，定期換水。暫養(yǎng)前進(jìn)行抽樣檢測(cè)，確定試驗(yàn)用蛙不攜帶病原菌。

將分離純化的菌株BSH3接種于LB液體培養(yǎng)基28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后，8 000離心10 min沉淀菌體，去上清后用無(wú)菌PBS稀釋成濃度為1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10CFU/mL的菌液。將黑斑蛙隨機(jī)分為6個(gè)感染組和1個(gè)陰性對(duì)照組，每組20只。采用大腿注射法進(jìn)行人工感染，試驗(yàn)組每只注射0.2 mL不同濃度菌懸液，對(duì)照組注射等體積的PBS。連續(xù)觀察8 d，每日早上9點(diǎn)和下午5點(diǎn)記錄試驗(yàn)蛙的臨床癥狀及死亡情況，并將剛死亡蛙的腦組織再次進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定。采用寇氏法計(jì)算菌株BSH3的半致死濃度(LC)。

1.6 藥物敏感試驗(yàn)

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)菌株BSH3藥物敏感性。首先將BSH3菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后，8 000離心10 min沉淀菌體，用無(wú)菌PBS稀釋菌體至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞舛?，?0 μL菌懸液均勻涂布于LB固體平板上，待菌液被吸收后，向培養(yǎng)基貼不同抗生素藥敏紙片，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，并參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)判斷標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判定結(jié)果。按相同方法每種藥敏紙片重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 患病黑斑蛙臨床癥狀

患病蛙的頭部出現(xiàn)向一側(cè)嚴(yán)重傾斜的癥狀(圖1a)，有些病蛙不僅具有歪頭癥狀同時(shí)也出現(xiàn)了單側(cè)或者雙側(cè)眼球渾濁發(fā)白的癥狀(圖1b、c)，另外部分病蛙出現(xiàn)腹部膨脹的癥狀(圖1d)，解剖發(fā)現(xiàn)蛙腹內(nèi)有大量淺黃色腹水，肝臟充血腫大呈黃紅相間的花斑肝(圖e)，病蛙腸道內(nèi)無(wú)食物，充滿透明狀液體(圖f)。

圖1 患病黑斑蛙病變特征

2.2 細(xì)菌形態(tài)特征

BSH3菌株在LB平板上28 ℃培養(yǎng)24 h后，可形成灰白色、圓形至橢圓形不等、中央微凸起、表面光滑、邊緣整齊，直徑在1～2 mm的小菌落(圖2a)。革蘭氏染色為革蘭氏陰性短桿菌，長(zhǎng)1.0～2.0 μm，寬0.5～0.8 μm(圖2b)。

圖2 BSH3株形態(tài)學(xué)觀察

2.3 16S rRNA基因序列分析

通過(guò)PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序獲得BSH3菌株的16S rRNA基因片段長(zhǎng)度約為1 500 bp。將菌株基因序列在NCBI上進(jìn)行BLAST在線對(duì)比，結(jié)果顯示，菌株BSH3與米爾伊麗莎白菌16S rRNA基因序列(登錄號(hào)：KY930330.1)的同源性達(dá)99.93%。下載GenBank中相關(guān)細(xì)菌16S rRNA基因序列，通過(guò)Clustal X軟件進(jìn)行多重比對(duì)，用MEGA 6.0軟件中鄰接法(neighbor joining，NJ)構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。結(jié)果顯示，菌株BSH3與米爾伊麗莎白菌處于一個(gè)進(jìn)化分支上。

圖3 基于16S rRNA基因構(gòu)建的菌株BSH3系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 細(xì)菌生化鑒定

生理生化結(jié)果顯示菌株BSH3能夠利用脲素、Kohn明膠、山梨醇、麥芽糖、乳糖、葡萄糖和甘露醇，不能利用鄰硝基苯-半乳糖苷、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、檸檬酸鈉、硫代硫酸鈉、色氨酸、丙酮酸鹽、肌醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖和木糖(表1)。

表1 病原菌BSH3的生理生化特性

2.5 組織病理學(xué)

患病黑斑蛙肝臟組織出現(xiàn)大量褐色色素沉積，發(fā)生空泡變性和纖維素樣變性(圖4a)；腎小管和腎小囊出現(xiàn)玻璃樣變形，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和出血現(xiàn)象(圖4b)；脾臟組織中發(fā)生空泡變性和玻璃樣變形，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4c)；腦基質(zhì)水腫，膠質(zhì)細(xì)胞增多，神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞周圍空隙變大，基質(zhì)中存在空泡，伴有出血現(xiàn)象(圖4d)。

圖4 患病黑斑蛙組織病理學(xué)觀察

2.6 人工回歸感染試驗(yàn)

菌株BSH3人工感染黑斑蛙后，蛙體出現(xiàn)不攝食，歪頭、白內(nèi)障、失去定向運(yùn)動(dòng)能力等神經(jīng)性損傷癥狀。菌株濃度為1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10CFU/mL時(shí)，黑斑蛙的累計(jì)死亡率分別為100%、95%、85%、65%和25%。而注射濃度為1.0×10CFU/mL或PBS時(shí)，黑斑蛙在試驗(yàn)期間沒(méi)有出現(xiàn)死亡。對(duì)病死蛙腦、肝、脾和腎等組織進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，經(jīng)鑒定為米爾伊麗莎白菌()，與自然患病蛙細(xì)菌分離鑒定結(jié)果一致，表明米爾伊麗莎白菌是造成此次黑斑蛙歪頭病的病原菌。采用寇氏法計(jì)算該菌株對(duì)黑斑蛙的半數(shù)致死量(LC)為6.3×10CFU/mL(表2)。

表2 不同濃度分離菌株BSH3感染黑斑蛙死亡結(jié)果

2.7 藥敏試驗(yàn)

菌株BSH3對(duì)23種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果表明分離菌株對(duì)米諾環(huán)素、氟苯尼考、利福平和萬(wàn)古霉素敏感，對(duì)氧哌嗪青霉素、羧芐西林、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、恩洛沙星和萘啶酸中度敏感，對(duì)青霉素G、阿莫西林、氨芐青霉素、頭孢氨芐、頭孢他啶、頭孢克洛、氨曲南、吡哌酸、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、丁胺卡那、新霉素和多粘菌素B等多種藥物耐藥。

表3 菌株BSH3的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 歪頭病病原及主要癥狀

歪頭病是蛙類養(yǎng)殖過(guò)程中危害較大的疾病之一，通常還伴有白內(nèi)障、腹水等并發(fā)癥。不同患病個(gè)體表現(xiàn)出來(lái)的具體癥狀也有所不同，急性患病個(gè)體只表現(xiàn)出歪頭癥狀，不表現(xiàn)白內(nèi)障和腹水等癥狀；而在慢性患病個(gè)體中，歪頭、白內(nèi)障和腹水三種癥狀均可表現(xiàn)出來(lái)。導(dǎo)致病蛙出現(xiàn)急性和慢性感染的主要原因是細(xì)菌感染的部位不同，在急性歪頭病蛙中只能從腦部分離到大量病菌，而在出現(xiàn)三種癥狀的慢性病蛙可以同時(shí)從眼、腦、肝、腎和腹水等部位分離到相同致病菌。本實(shí)驗(yàn)中，患病黑斑蛙臨床特征主要表現(xiàn)為食欲減退，歪頭，白內(nèi)障和腹水等，這與Hu等報(bào)道的米爾伊麗莎白菌引起黑斑蛙歪頭病的結(jié)果一致。其中，歪頭和白內(nèi)障具有代表性，可以作為臨床上診斷該病的重要依據(jù)。

在魚(yú)類和蛙養(yǎng)殖過(guò)程中均有白內(nèi)障病的報(bào)道，但引起兩者出現(xiàn)白內(nèi)障的病原存在差異。引起魚(yú)類眼球表面出現(xiàn)白內(nèi)障的病原為寄生蟲(chóng)，如復(fù)口吸蟲(chóng)()的尾蚴和囊蚴等可以引起魚(yú)類白內(nèi)障病。目前，已報(bào)道的棘胸蛙()、青蛙()、黑斑蛙()、棘腹蛙()、牛蛙()、虎紋蛙()、刺蛙()等蛙類白內(nèi)障(歪頭)則均是由細(xì)菌引起。其中，主要是由伊麗莎白菌屬(spp.)的腦膜敗血伊麗莎白菌()所引起。

3.2 米爾伊麗莎白菌的致病性

米爾伊麗莎白菌為革蘭氏陰性桿菌，隸屬于黃桿菌科()伊麗莎白菌屬，廣泛分布于淡水和土壤中。2003年該菌首次從和平空間站冷凝水中被分離到。此后，研究發(fā)現(xiàn)該菌可引起人類腹膜炎、肺炎、腦膜炎、蜂窩組織炎、敗血癥和眼部感染等癥狀。米爾伊麗莎白菌可感染多種無(wú)尾類動(dòng)物，在黑斑蛙、刺蛙、豹蛙()、樹(shù)蛙()和微蹼鈴蟾()等中均有發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)歪頭、白內(nèi)障和腹水等癥狀，并導(dǎo)致大量患病死亡。本研究中，人工回歸感染試驗(yàn)表明米爾伊麗莎白菌BSH3的半數(shù)致死量為6.3 × 10CFU/mL，具有較強(qiáng)的致病性。然而，Huang等研究中，米爾伊麗莎白菌的致死率相對(duì)偏低，說(shuō)明不同分離株的致病力存在差異。

實(shí)驗(yàn)對(duì)患病蛙腦、肝、脾和腎臟進(jìn)行組織病理觀察，發(fā)現(xiàn)米爾伊麗莎白菌感染黑斑蛙后可引起蛙這些組織損傷。尤其是蛙腦基質(zhì)輕度水腫，膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多，膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞周圍空隙增大，基質(zhì)中有空泡。這與伊麗莎白菌引起蛙類腦部病理觀察結(jié)果是一致的。當(dāng)蛙體質(zhì)下降并受到病原侵害時(shí)，病原躲過(guò)了蛙體的免疫防御，在蛙體內(nèi)定植并不斷繁殖，沿著某種路徑侵入大腦，造成大腦的各類炎癥和機(jī)能障礙，出現(xiàn)了歪頭、旋游、定向能力失調(diào)的癥狀。另外，病蛙肝、脾和腎臟出現(xiàn)變性、壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病變。由此可見(jiàn)，患病的黑斑蛙病灶并不僅僅局限于腦部，其他內(nèi)臟器官也不同程度受到感染且更加嚴(yán)重，多器官壞死、衰竭最終加速了病蛙的死亡。本實(shí)驗(yàn)中從病蛙的腦、肝、脾、腎組織中均分離到致病菌株，暗示病原菌是導(dǎo)致蛙組織損傷的原因。胡瑞雪從患病蛙腦組織分離到一株米爾伊麗莎白菌FL160902，該菌可引起蛙肝、脾、腎、腦不同程度的損傷，其中以腦部病變最為明顯。此外，秦振陽(yáng)從湖南岳陽(yáng)發(fā)生歪頭病的黑斑蛙腦部、眼球、肝臟、卵巢等多處組織器官分離到一株米爾伊麗莎白菌分離株HNW1681，可以引起蛙心臟、肝臟、腦、眼等不同程度的病理變化。這些研究表明米爾伊麗莎白菌對(duì)黑斑蛙的感染是呈全身性的，并且引起蛙全身性組織損傷。

3.3 黑斑蛙歪頭病的防控建議

本實(shí)驗(yàn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，米爾伊麗莎白菌BSH3僅對(duì)米諾環(huán)素、氟苯尼考、利福平和萬(wàn)古霉素四種藥物敏感。然而，利福平和萬(wàn)古霉素這兩種藥在水產(chǎn)上是禁用藥，所以在黑斑蛙患歪頭病時(shí)應(yīng)禁止使用。米諾環(huán)素和氟苯尼考是農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的水產(chǎn)藥物，生產(chǎn)中可用鹽酸米諾環(huán)素粉劑100 g拌料1 000 kg，連用5～7 d或每kg體重拌飼投喂15～20 mg氟苯尼考粉，每天一次，連用3～5 d。但過(guò)度使用米諾環(huán)素易使水體污染和對(duì)水生生物產(chǎn)生毒性作用，因此生產(chǎn)中盡量不使用米諾環(huán)素治療黑斑蛙歪頭病。吳興鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)五味子、柯子、半枝蓮、五倍子，烏梅等植物性藥物在控制伊麗莎白菌感染時(shí)起到了良好的效果，加強(qiáng)植物性藥物的研發(fā)與使用可能是將來(lái)有效防治伊麗莎白菌病的重要途徑。此外，米爾伊麗莎白菌能夠侵害蛙的神經(jīng)器官，比如大腦，可以在細(xì)胞間基質(zhì)外生存，甚至少數(shù)細(xì)菌可以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在治療該病時(shí)，可以考慮使用一些更容易穿透血腦屏障的脂溶性藥物，如磺胺類藥物。周永燦等研究發(fā)現(xiàn)腦膜炎敗血伊麗莎白菌全菌疫苗能夠在一定程度上預(yù)防虎紋蛙白內(nèi)障疾病的發(fā)生，這為利用免疫學(xué)方法防控伊麗莎白菌病提供了理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支持。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中需要采用“以防為主，防治結(jié)合”的綜合防治方法。抗生素的長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和水體環(huán)境的污染。應(yīng)用疫苗開(kāi)展疾病的免疫防治不僅可以提高動(dòng)物自身的免疫水平、增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力，而且還符合綠色環(huán)保的要求，將是水生動(dòng)物疾病防治的主流發(fā)展方向。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特性分析與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，從患歪頭病黑斑蛙體內(nèi)分離到致病菌株米爾伊麗莎白菌，名命為BSH3。病理組織觀察米爾伊麗莎白菌可以引起黑斑蛙全身性組織病理?yè)p傷。通過(guò)藥物敏感試驗(yàn)，初步篩選出氟苯尼考可用于黑斑蛙歪頭病的防控。