□ 郜鑫洋 陳樹興

（河南科技大學，河南 洛陽 471000）

秀麗隱桿線蟲是一種常見的模式生物，壽命為14～21天。擁有1萬個堿基，1.78萬個不同基因，959個體細胞和300個神經(jīng)元，因為它們結(jié)構(gòu)簡單、世代周期短并且易于繁殖，是生物科學研究中應用最普遍的模式生物［1-3］。而雙歧桿菌是一種普遍存在于人和動物體內(nèi)的益生菌，它們能夠產(chǎn)生具有多種生物功能的胞外多糖，并且已經(jīng)能夠被提取、分離和純化，并進行其各種特性的研究。由于秀麗隱桿線蟲是十分常用的模式生物被廣泛應用于遺傳學、毒理學乃至植物寄生線蟲等方面（秀麗隱桿線蟲擁有許多和植物寄生線蟲相似的特征），所以研究其較簡便且能長期保存的方法，具有現(xiàn)實意義。同時，雙歧桿菌胞外多糖已被證明擁有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等功能。如果能夠證明雙歧桿菌胞外多糖能夠提高生物的低溫抗性，那么對開發(fā)新的冷凍保護液很有幫助，對雙歧桿菌及產(chǎn)物的研究也具有重要意義。

一、實驗與方法

（一）材料

供試線蟲品系為本實驗室保藏的N2野生型秀麗隱桿線蟲，購買自省內(nèi)實驗室。其保存條件為：-80℃超低溫冰箱中冷凍保存。

雙歧桿菌：供試雙歧桿菌為RH型動物雙歧桿菌，來自百歲老人的腸道，由本實驗室人員分離、培養(yǎng)并保存。保藏方式為：-20℃低溫冰箱冷凍保存。

大腸桿菌：供試大腸桿菌為OP50尿嘧啶突變型，為本實驗室保藏菌種。保存方式為：-20℃低溫冷凍保存。

LB培養(yǎng)基：1g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、0.5gNaCl（固體培養(yǎng)基需要加入1.7g瓊脂粉），加水定容至100ml，溶解后高壓滅菌（115℃，15min），冷卻后放入4℃冰箱中備用。

NGM培養(yǎng)基：取0.3gNaCl、1.7g瓊脂、0.25g蛋白胨、2.5mlPBS緩沖液，加水定容至100ml后高壓滅菌（115℃，15min），待培養(yǎng)液降溫至60℃后再加入膽固醇乙醇溶液O.1mL（5mg/mL）、MgS04 0.1mL（1mol/L）、CaCl2 0.1mL（1mol/L）。然后迅速搖勻并倒平板制得NGM固體培養(yǎng)基，4℃冰箱冷藏備用。

脫脂乳培養(yǎng)基：脫脂乳粉120g、1000mL蒸餾水充氮氣，105℃滅菌10min。

雙歧桿菌酶解液：中性蛋白酶、胰蛋白酶質(zhì)量比為1∶2混合酶2g，加入蒸餾水1000ml（注意：酶解液要現(xiàn)配現(xiàn)用）。

秀麗隱桿線蟲裂解液：NaOH0.6g、10%NaCl溶液100μl、無菌水49.9ml。

冷凍保護液：M9緩沖液、甘油體積比為7∶3，之后根據(jù)需要加入雙歧桿菌多糖溶液。加入后混勻。注意，此保護液現(xiàn)配現(xiàn)用。

（二）方法

1.秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)

大腸桿菌OP50的培養(yǎng)：取1g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、0.5g氯化鈉、1.7g瓊脂粉，加水定容至100ml配制成LB固體培養(yǎng)基，高壓滅菌后倒平板，待平板凝固后，使用接種取大腸桿菌OP50菌種液進行劃線培養(yǎng)（注意：每劃一次線，都有將接種環(huán)在酒精燈火焰上灼燒，待冷卻后再劃，重復3次），劃線后，將培養(yǎng)皿放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

大腸桿菌OP50懸液的制備：配制LB液體培養(yǎng)基：取1g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、0.5g氯化鈉加水定容至100ml后高壓滅菌，冷卻后取出劃線培養(yǎng)基在超凈工作臺中使用接種環(huán)挑取單個菌落放入LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24h。之后，將菌液放入4℃冰箱中冷藏備用。

秀麗隱桿線蟲蟲體的培養(yǎng)：取凍存的秀麗隱桿線蟲樣本，在37℃水浴中解凍復蘇后接種到涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，注意擴大培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)方法是：每天取數(shù)只雌雄同體產(chǎn)卵期秀麗隱桿線蟲，用顯微鉤針轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿上進行培養(yǎng)。培養(yǎng)數(shù)代后進行同步化處理，為接下來的冷凍保存實驗做準備。

同步化處理（又稱同期化培養(yǎng)）：使用M9緩沖液沖洗培養(yǎng)基上的線蟲，沖洗完畢后，轉(zhuǎn)移到錐形瓶中靜置20min，之后加入裂解液，震蕩裂解15min后，分裝入4ml離心管。2517g離心1min后，沉淀用4ml緩沖液懸浮后離心，沉淀再加入無菌水懸浮后離心重復3次，之后在沉淀中加入1ml無菌水，放入NGM培養(yǎng)基中22℃培養(yǎng)7d。注意，第二次培養(yǎng)時涂布的菌液要少一些，以便于獲得dauer期幼蟲。［4］因為dauer期幼蟲擁有更強的抗逆性。

2.RH雙歧桿菌胞外多糖EPS的制備分離和純化［5］

產(chǎn)糖發(fā)酵：菌種在脫脂乳培養(yǎng)基中活化3代，取對數(shù)末期培養(yǎng)液接種至新鮮無菌脫脂乳培養(yǎng)基，接種量為107CFU／mL，于37℃厭氧發(fā)酵60 h得到發(fā)酵液。

酶解：將雙歧桿菌發(fā)酵液用4層醫(yī)用紗布過濾，除去酸沉酪蛋白塊。過濾液100℃加熱5min，8000 r／min離心10 min后取上清液。冷卻后，將上清液pH調(diào)節(jié)至7.5，之后加入2g/ml酶解液酶解120min。

分離，提取與純化：將酶解液在沸水浴中滅酶5min，待酶解液冷卻后8000 r／min離心10min；上清液中加入3倍體積無水乙醇，4℃沉淀過夜，沉淀用少量蒸餾水復溶，8 000～12000D透析袋4℃透析48h，真空冷凍干燥后獲得EPS粗品，粗品需避光干燥保存。

將分離、提取獲得的EPS粗品配制成5mg/ml糖液。45 μm水系濾膜過濾后進行Sepharose CL.6B凝膠柱層析，上樣量為4ml用0.05mol／lNaCl恒速洗脫，洗脫速率為0.8mL／min，每管8mL部分收集，并使用硫酸-苯酚測定A480mm法［7］逐管檢測多糖含量，按多糖含量檢測值收集峰值管，8000～12000D透析袋透析并冷凍干燥，獲得成品。

3.線蟲冷凍實驗

秀麗隱桿線蟲的保藏實驗共設三個因子：（1）冷凍保藏時間2個水平；（2）雙歧桿菌多糖用量3個水平；（3）冷凍保藏溫度2個水平，完全實驗共構(gòu)成2×3×2=12個水平（表1），每個處理重復3次。處理時取約500頭秀麗隱桿線蟲置于4ml的Eppendorf離心管中，加入含有不同濃度雙歧桿菌的保藏液。封口膠密封后置于-20℃和-80℃的低溫冰箱中保存60d或120d。水浴解凍后取100μl鏡檢線蟲存活情況，剩下的接種于NGM培養(yǎng)基上于22℃下培養(yǎng)7d。死亡判定：向線蟲液中滴入一滴5%氯化鈉溶液并鏡檢，如果顯微鏡下蟲體僵直不動，則視為死亡。

表1 冷凍保藏實驗的分組設置

（三）統(tǒng)計分析

使用SPSS26統(tǒng)計軟件對線蟲死亡率進行方差分析。各因子差異采用正交變換分解平方和。對線蟲死亡率數(shù)據(jù)進行多因素方差分析。采用Duncan’S 多重極差檢驗法對24個處理間差異進行簡單的多重比較。

二、結(jié)果與分析

（一）雙歧桿菌多糖用量對秀麗隱桿線蟲存活率影響

實驗結(jié)果表明，雙歧桿菌多糖用量對秀麗隱桿線蟲存活率有顯著的影響。不添加雙歧桿菌多糖的保護液保藏的秀麗隱桿線蟲的平均存活率為2.31%；雙歧桿菌多糖用量為20g/l時平均存活率為14.31%；而雙歧桿菌多糖用量為40g/l時，平均存活率達到了23.40%。

（二）冷凍保藏時間對秀麗隱桿線蟲存活率的影響

保藏時間會對秀麗隱桿線蟲的存活率有顯著的影響。線蟲存活率會隨著保藏時間延長而降低。保藏60d和120d的平均存活率分別為14.78%和12.73%。最高存活率分別為43.22%和40.90%。

12個條件實驗結(jié)果表明，對保藏時間影響最大的因素是雙歧桿菌多糖的用量，其次是保藏時間。保藏溫度為-80℃且保藏時間為120d的情況下，存活率均大于40%，并且與其他組差異顯著，接種到NGM培養(yǎng)基上可以看到大量線蟲。因此建議采用處理編號為12（-80℃，多糖用量40g/l，保存120d；雖然存活率最高但是保存時間短）。如圖1～3所示。

圖1 冷凍時間對存活率的影響

圖2 雙歧桿菌多糖用量對存活率的影響

圖3 12個處理的實驗結(jié)果

三、結(jié)語

前人研究了在不同溫度下向多種溶液（水、PBS緩沖液、M9緩沖液等，本實驗使用的是M9緩沖液）中加入如DMSO、甘油（本實驗使用）等物質(zhì)來保藏秀麗隱桿線蟲的效果，但是很少有人設想雙歧桿菌胞外多糖也可能具有類似的功能。本實驗結(jié)果表明，RH雙歧桿菌胞外多糖確實具有類似的功能，而且對秀麗隱桿線蟲保藏具有決定性作用。當冷凍保藏溫度為-80℃，雙歧桿菌多糖用量為40g/l時，就能有效保藏秀麗隱桿線蟲120d。

四、回首歷史，展望未來

1949年，Polae等人發(fā)現(xiàn)了甘油具有保護細胞的作用。1988年，Sulston和他的研究團隊發(fā)現(xiàn)放置于10%甘油溶液中的秀麗隱桿線蟲蟲體可以在低溫下保存25年以上。我國李有全［8-10］等人在秀麗隱桿線蟲冷凍保存方面的研究也取得了很大的突破。周紅也在前人的研究成果的基礎上通過實驗進一步討論并分析了影響線蟲冷凍保存的決定性因素。而在2016年，武文浩［4］建立了秀麗隱桿線蟲的冷凍保藏方法，并確立了最佳的冷凍條件。但是以上研究仍然存在各自的局限性。

細胞在低溫下能保存更長時間是因為在低溫下細胞的生化反應速度會減慢，因此代謝速度降低。而代謝速度的降低又可以減少垃圾物質(zhì)的排放，然后減少細胞的凋亡和死亡，減輕器官的缺血再灌注損傷等。而且酶在低溫下的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易失活。但是低溫對細胞和生物體可能造成的損害是多方面的。主要表現(xiàn)在冰晶損傷、溶液滲透損傷、過冷休克、結(jié)構(gòu)水的破壞、電解質(zhì)失衡，甚至會導致細胞DNA的破壞［11-13］，于是需要設法減輕低溫帶來的負面影響。

冷凍保護劑的出現(xiàn)與發(fā)展使得如何減輕低溫對細胞損害這個問題有了很大的突破，冷凍保護液能夠最大限度地減輕低溫對細胞的損傷。目前常用的冷凍保護劑有甘油、甲醇、DMSO（二甲基亞砜）等，但是這些物質(zhì)可能會對細胞和生物體帶來其他負面影響，甚至具有毒性（DMSO），因此需要改良。

雙歧桿菌（Bifidobacterium）屬是一種革蘭氏陽性的、不運動的、細胞呈桿狀的、一段有時呈分叉狀的嚴格厭氧菌屬，它們廣泛存在于人體的消化道等部位，是非常有用的益生菌。它們在人體內(nèi)有合成維生素，抑制有害菌等功能，也能產(chǎn)生乙酸、丙酸、乳酸等有機物促進腸道蠕動，并凈化腸道環(huán)境。雙歧桿菌還可以產(chǎn)生胞外多糖，EPS有中性和酸性兩種，EPS能夠抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)動物的腸道菌群和免疫，甚至還可以清除毒素［14-15］。但是，目前對EPS 的研究仍然停留在EPS的生產(chǎn)、提取與純化［16］，以及EPS的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)［17］和EPS活性產(chǎn)品的研制等方面［18-20］。盡管甘敏［21］在李勝杰［22-25］等人提供的一些理論基礎上通過實驗對EPS的益生作用及其機理進行了一些探究，但是雙歧桿菌EPS的功能以及其作用機制仍需要進一步的探索。

展望未來，本課題確認了RH雙歧桿菌胞外多糖確實具有延長秀麗隱桿線蟲冷凍保藏時間的能力，未來可以對雙歧桿菌胞外多糖延長生物冷凍保藏能力的原因以及作用機制做更深入的研究，進一步了解雙歧桿菌多糖的功能及其機理。