杜喜春，何祥博，趙銀萍，張九東，郭成圓

(1.西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安 710065；2.陜西省佛坪國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，陜西 佛坪 723400)

陜西佛坪國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)是秦嶺野生大熊貓分布的中心地區(qū)之一，種群密度居全國之首[1].秦嶺地區(qū)分布的竹類植物有7 屬22 種，是大熊貓的主要食物來源[2].已有研究人員對(duì)陜西秦嶺和四川等地的大熊貓主食竹從分類[3-7]、分布規(guī)律[8-9]、種子萌發(fā)和植物生長[10-12]，以及種群動(dòng)態(tài)與森林演替[9,13-15]等方面進(jìn)行了深入研究.秦嶺大熊貓夏季常在高海拔的秦嶺箭竹（Fargesia qinlingensis）林下活動(dòng)；一年中其余約75 %的時(shí)間，包括春、秋和冬季，多是在低海拔區(qū)域的巴山木竹（Bashania fargesii）林下活動(dòng)[16-17].冬季自然環(huán)境條件更為嚴(yán)酷，巴山木竹林作為大熊貓的主要棲息地和食物來源，對(duì)于其野外生存具有重要意義，加強(qiáng)對(duì)巴山木竹的研究可以為保護(hù)大熊貓?zhí)峁├碚撝?

研究人員已經(jīng)從生長特性[8,16]、營養(yǎng)特征[8,17-21]、遺傳多樣性[22]、種群生態(tài)學(xué)[18,23]、生物量[1,23-25]、分布規(guī)律[5,8]、竹林結(jié)構(gòu)[19-20]等方面對(duì)巴山木竹進(jìn)行了研究，為大熊貓的保護(hù)工作提供了重要依據(jù).秦嶺大熊貓的主食竹種，包括巴山木竹，均屬于種群內(nèi)同期一次性開花的生殖類型，先有竹子零星開花，繼而同地域內(nèi)的竹稈全部開花枯死[26-27]，這可能會(huì)對(duì)大熊貓的生存環(huán)境和食物來源造成影響.然而，對(duì)巴山木竹的生殖生物學(xué)，包括開花的分子機(jī)制和植物內(nèi)源激素變化等方面問題的研究并不多見.

竹類植物開花周期長，長達(dá)數(shù)十年甚至上百年，因此竹類植物的自然開花現(xiàn)象不太常見，但是竹子開花過程中和開花后普遍具有營養(yǎng)生長衰退，甚至大規(guī)模死亡的現(xiàn)象.竹子開花狀態(tài)不同，內(nèi)源激素含量會(huì)發(fā)生一定的變化[26-29].雖然自然界的竹類植物開花難以遇到，但通過對(duì)竹類開花進(jìn)程的人為調(diào)控，可促使一些竹種的試管苗開花，目前已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)20 多個(gè)竹種的離體繁殖，同時(shí)通過調(diào)控培養(yǎng)基配方中植物激素和生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的組成和配比，多種竹類植物在試管中完成開花[30]，表明植物激素在竹類植物開花過程中的作用不可忽視.研究人員對(duì)秦嶺大熊貓的主食竹種，包括秦嶺箭竹[26-27,31-33]、巴山木竹和龍頭竹[26-27]的開花現(xiàn)象進(jìn)行了初步研究，但是巴山木竹開花過程中的植物內(nèi)源激素的變化規(guī)律還不清楚.在這方面開展研究不僅可以完善竹類植物開花理論，而且對(duì)于大熊貓的保護(hù)工作也具有重要的意義.

1 材料和方法

本研究選取處在3 個(gè)不同生長發(fā)育階段（營養(yǎng)生長階段、開花前期階段、開花階段）的巴山木竹種群作為研究對(duì)象，運(yùn)用酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定巴山木竹不同發(fā)育時(shí)期葉片中的植物內(nèi)源激素含量，運(yùn)用TYS-B 型葉綠素測定儀測定葉綠素相對(duì)含量和氮相對(duì)含量（SPAD 值）.

研究地點(diǎn)為陜西秦嶺南坡中段的佛坪國家級(jí)自然保護(hù)區(qū).根據(jù)巴山木竹生長發(fā)育狀況將其分為3 個(gè)階段，分別位于3 個(gè)不同的小流域，分別設(shè)為A、B 和C 3 個(gè)組.A 組為第1 組，是營養(yǎng)生長階段，長勢旺盛短期內(nèi)沒有開花跡象，作為對(duì)照組，該組位于保護(hù)區(qū)核心區(qū)的大古坪保護(hù)站管轄區(qū)內(nèi).B組是第2 組，為開花前期階段，也就是開花預(yù)警組，位于保護(hù)區(qū)核心區(qū)的岳壩保護(hù)站管轄區(qū)內(nèi)，該組竹子即將開花，2015 年9 月至今每年都在該區(qū)域的巴山木竹種群中發(fā)現(xiàn)零星開花的竹桿，該處竹林帶位于河岸兩側(cè)，總長度大約2 km，除了極少量開花的竹子以外，其他竹子長勢良好，暫時(shí)看不到開花的跡象.C 組是第3 組，為開花階段，位于保護(hù)區(qū)的外圍區(qū)域，該區(qū)域不屬于保護(hù)區(qū)的管轄范圍，與保護(hù)區(qū)相毗鄰.分別在上述3 種不同生長發(fā)育階段的3 個(gè)小流域內(nèi)選取生境相似的10 個(gè)典型竹叢進(jìn)行調(diào)查取樣.

在每個(gè)樣方內(nèi)隨機(jī)選取10 個(gè)1 年生竹桿，運(yùn)用葉綠素測定儀測量葉片的SPAD 值，同時(shí)采集上面無病蟲害的完整健康嫩葉，編號(hào)后立即放入液氮罐中進(jìn)行保鮮，帶回實(shí)驗(yàn)室后，用100%甲醇固定，置于?20 ℃以下低溫冰箱中保存?zhèn)溆?

生長素（IAA）、細(xì)胞分裂素（CTK）、脫落酸（ABA）和赤霉素（GA）的提取和純化的方法參考文獻(xiàn)[34].取5 g 竹葉，剪碎，加入60 mL 預(yù)冷（小于0 ℃）的80%甲醇溶液，勻漿5 min，勻漿液在4 ℃下震蕩24 h，過濾，殘?jiān)儆?0 mL 80%甲醇溶液震蕩1 h.反復(fù)2 次，將混合濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上干燥減壓至原體積一半，再加入10 mL 石油醚，提取部分色素，將下層甲醇液取出，繼續(xù)減壓去除甲醇，獲得含有IAA、ABA、GA 和CTK 的水溶液，經(jīng)過進(jìn)一步萃取和純化，最后分別采用IAA、CTK、GA 和ABA 的酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒進(jìn)行測定.

數(shù)據(jù)處理與分析：采用 Excel 2007 與SPSS 17.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性檢驗(yàn) (LSD法)，運(yùn)用 Excel 2007 制作相關(guān)表格.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同開花階段巴山木竹葉中植物內(nèi)源激素質(zhì)量比的變化表1 顯示，3 組IAA 數(shù)據(jù)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯著性P<0.05.其中A 組中的IAA 平均質(zhì)量比為4.69 ng/g，B 組中的IAA 平均質(zhì)量比5.61 ng/g，C 組葉中的IAA 平均質(zhì)量比7.39 ng/g.IAA 隨著發(fā)育時(shí)期的推進(jìn)逐步升高，其中B 組比A 組高19.62%；C 組比A 組高48.13%，比B 組高31.73%.

表1 不同開花階段巴山木竹葉中植物內(nèi)源激素質(zhì)量比的比較Tab.1 Comparison of plant endogenous hormone contents in the leaves of Bashania fargesii at different flowering stages

3 組GA 數(shù)據(jù)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯著性P<0.05.其中A 組GA 平均質(zhì)量比7.84 ng/g，B 組葉中的GA 平均質(zhì)量比4.81 ng/g，C 組葉中的GA 平均質(zhì)量比10.29 ng/g.GA 在整個(gè)階段先降低，最后又升高.C 組最高，B 組質(zhì)量比最低.其中B 組比A 組低38.65%；C 比A 組高50.94%，比B 組高113.93%.

3 組CTK 數(shù)據(jù)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯著性P<0.05.其中A 組中的CTK 平均質(zhì)量比291.23 ng/g，B 組CTK 平均質(zhì)量比213.51 ng/g，C組葉內(nèi)CTK 平均質(zhì)量比348.03 ng/g.CTK 在整個(gè)階段先降低，后又升高，開花階段最高.其中B 組比A 組低26.69%；C 組比A 組高26.60%，比B 組高63.00%.

A 組葉中ABA 平均質(zhì)量比375.40 ng/g，B 組平均質(zhì)量比382.33 ng/g，C 組平均質(zhì)量比563.24 ng/g.A 組和B 組之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.ABA 在開花前變化不大，開花以后質(zhì)量比才顯著升高，C 組比A組高49.13%，比B 組高47.32%.

2.2 不同開花階段巴山木竹葉中植物葉綠素和氮含量的變化3 組葉綠素和氮含量的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）.B 組葉綠素的SPAD 值為30.631，A 組為33.148，C 組為31.593，表明從營養(yǎng)階段到開花前期，葉綠素相對(duì)含量會(huì)降低大約10%左右，進(jìn)入開花期后，葉綠素相對(duì)含量又會(huì)升高.氮含量SPAD 值的變化趨勢與葉綠素相對(duì)含量的變化趨勢大致相同，B 組的SPAD 值為2.7，A 組為2.864，C 組為2.773，表明從營養(yǎng)階段到開花前期先降低，進(jìn)入開花期后又有小幅升高.

表2 不同開花階段巴山木竹葉中植物葉綠素和氮相對(duì)含量的SPAD 值比較Tab.2 Comparison of SPAD values of chlorophyll and nitrogen contents in the leaves of Bashania fargesii at different flowering stages

3 討論

開花是植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)換的標(biāo)志性生理發(fā)育過程，這個(gè)過程與植物的內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)是分不開的.赤霉素(GA)途徑是許多植物開花的重要途徑，GA 與這些種類植物的開花調(diào)節(jié)密切相關(guān)[35].近年來，研究者對(duì)IAA、CTK 和 ABA 等植物激素在植物開花過程中的作用和分子機(jī)理也進(jìn)行了大量報(bào)道[36].

GA 不僅參與調(diào)控植物開花時(shí)間，而且也參與多種生長發(fā)育過程，可以促進(jìn)莖的伸長.GA 途徑是許多植物開花調(diào)控的重要途徑.它可以替代長日性植物的光照條件及要求低溫的2 年生植物的低溫作用[35]，并通過調(diào)控開花時(shí)間整合基因(SOC1)[37]以及花分生組織的特征基因LEAFY (LFY)[38-39]的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)其生理效應(yīng).不同發(fā)育階段的巴山木竹竹叢在佛坪自然保護(hù)區(qū)內(nèi)分布的區(qū)域大致相同，所面對(duì)的四季更替、日照長短和溫度等環(huán)境因素也相同，因此大致可以排除光周期途徑、春化途徑和溫度途徑等重要的植物開花途徑.巴山木竹的花期在3 月下旬至4 到5 月，面臨的是長日照環(huán)境，且開花前GA 質(zhì)量比先降低，可以推斷GA 途徑與巴山木竹的開花無關(guān)，但其開花前GA 質(zhì)量比顯著降低可作為巴山木竹開花的預(yù)警指標(biāo).早竹Phyllostachys praecox衰老是由GA3、ABA、IAA 的比值決定的，且以GA3/ABA 為主，比值高抑制衰老，反之促進(jìn)衰老[40].巴山木竹開花前GA 質(zhì)量比顯著降低，ABA質(zhì)量比升高，GA3/ABA 降低，與旱竹的表現(xiàn)一致.胡桃楸等闊葉植物的GA 有抑制成花的作用，在結(jié)實(shí)之后GA 質(zhì)量比又大幅上升[41-42].巴山木竹與胡桃楸的表現(xiàn)也一致，開花前GA 質(zhì)量比降低，在果實(shí)發(fā)育階段GA 質(zhì)量比也大幅升高.

IAA 主要在葉片內(nèi)部形成，調(diào)控多種植物的發(fā)育與生理進(jìn)程，包括胚胎發(fā)育、側(cè)根形成、維管發(fā)育、頂端優(yōu)勢等[43]，可誘導(dǎo)擬南芥的響應(yīng)因子MONOPTEROS(MP)的表達(dá)，MP 直接激活花分生組織特性基因LEAFY(LFY)的表達(dá)，從而促進(jìn)營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)換[44].高濃度IAA 促進(jìn)胡桃楸等長日植物的花芽分化[42]，巴山木竹開花前面臨長日照環(huán)境，且在開花前IAA 質(zhì)量比大幅升高，與胡桃楸的表現(xiàn)同樣一致，也可作為巴山木竹開花的預(yù)警指標(biāo).

ABA 最主要的生理作用是促進(jìn)植物器官的脫落和衰老以及對(duì)植物生長起著抑制作用.巴山木竹植株葉片中ABA 先保持不變，開花時(shí)才升高，開花植株其質(zhì)量比顯著高于未開花植株，竹葉逐漸枯黃掉落，整株竹子衰敗死亡，因此推斷竹子開花過程中葉片中的ABA 濃度大幅度升高，是加速竹林衰老死亡的原因之一.

CTK 參與植物生長發(fā)育的多個(gè)方面，能夠促進(jìn)植物細(xì)胞分裂和增大，誘導(dǎo)和調(diào)控芽的分化，在調(diào)控分裂周期和維持分生組織動(dòng)態(tài)平衡方面起著重要作用.高含量的CTK 和較大的CTK/GA 值有利于花芽分化；外源 CTK 處理可以上調(diào)擬南芥SOC1基因的表達(dá)，促進(jìn)其在SD 條件下開花[45].CTK 還有防止葉片衰老的作用[46-47]，這主要是由于細(xì)胞分裂素能夠延緩葉綠素和蛋白質(zhì)的降解速度.巴山木竹的CTK 質(zhì)量比在開花前有所降低，有可能和其葉綠素和氮含量降低，葉均質(zhì)量大幅減少有關(guān)，并導(dǎo)致光合效率和同化能力降低.

通過對(duì)模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）的研究，揭示了多條植物開花的調(diào)控途徑[48]，其中年齡途徑是許多植物的關(guān)鍵開花途徑.miR156 與miR172 是年齡途徑過程中的關(guān)鍵物質(zhì)[49]，miR156的積累與幼葉性狀相關(guān)，miR172 與成體葉片性狀相關(guān)，這兩個(gè)miRNA 共同起調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致植物從幼體到成體階段的轉(zhuǎn)變[50]，這種現(xiàn)象在擬南芥、水稻、芥菜等植物材料中普遍存在.CTK 可下調(diào)miR172的表達(dá)水平[51]，在巴山木竹的開花前期，CTK 質(zhì)量比顯著降低，miR172 濃度就有可能增加，從而進(jìn)一步激活年齡途徑而引起開花，因此可以推斷巴山木竹的開花過程有可能與年齡途徑有關(guān).竹類植物屬禾本科，生殖特性類似小麥 (Triticum aestivum)，表現(xiàn)為同期一次性開花，生殖完成后群體同時(shí)死亡，而且需要經(jīng)歷長達(dá)數(shù)十年甚至百余年之久的營養(yǎng)生長期，這種開花特性的表現(xiàn)也指向年齡途徑.主食竹類大面積開花死亡后，會(huì)影響到大熊貓的食物來源和棲息地質(zhì)量，因此研究竹類植物開花對(duì)于大熊貓的保護(hù)工作具有重要意義.