湯德相，王笑研，王元兵，孫 濤，胡衛(wèi)紅，虞 泓**

(1.云南大學(xué) 生態(tài)學(xué)與環(huán)境學(xué)院 云南云百草實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650091；2.云南大學(xué) 中國(guó)（云南）?東南亞蟲草生物資源可持續(xù)利用國(guó)際聯(lián)合研究中心，云南 昆明 650091；3.云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091)

雙孢線蟲草（Ophiocordyceps bispora）為線蟲草屬（Ophiocordyceps）古老的物種，是亞洲新紀(jì)錄種[1].Stifler[2]首次在非洲坦桑尼亞發(fā)現(xiàn)雙孢線蟲草，寄主為納塔爾大白蟻（Macrotermes natalensis）.Sung 等[3]用多基因片段對(duì)雙孢線蟲草進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析，確定雙孢線蟲草隸屬于線蟲草科（Ophiocordycipitaceae），線蟲草屬.目前，雙孢線蟲草的研究主要見于生物防治、活性成分以及微生物多樣性等方面.雙孢線蟲草活性成分研究表明其含有豐富的核苷類、多糖及甘露醇等活性成分，雙孢線蟲草的菌絲體對(duì)果蠅具有延緩衰老的特性[1].

野外調(diào)查雙孢線蟲草發(fā)現(xiàn)該物種可以侵染白蟻（Macrotermessp.），致使巢穴中群居的白蟻大量死亡；在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)雙孢線蟲草無性型研究也發(fā)現(xiàn)，讓白蟻?zhàn)杂膳佬性诮佑须p孢線蟲草分生孢子的無菌土壤上，可使白蟻感染；本課題組在野外調(diào)查也發(fā)現(xiàn)同樣現(xiàn)象[1,4-6].通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)雙孢線蟲草具有豐富的真菌資源，不同生境下雙孢線蟲草的真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)具有差異[4]，該現(xiàn)象在其他蟲草中也有報(bào)道，如冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）、新古尼異蟲草（Metacordyceps neogunnii）和蟬花蟲草（Isaria cicadae）等[7-9].本課題組野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，雙孢線蟲草分布在針闊混交林下，沿海拔梯度呈現(xiàn)不同密集程度的聚集死亡.研究報(bào)道山地生態(tài)系統(tǒng)海拔梯度差異較大，在較短的地理距離內(nèi)可出現(xiàn)氣候和生物特征的顯著變化，環(huán)境梯度變化會(huì)影響微生物的群落結(jié)構(gòu)、組成以及多樣性[10].不同的光照強(qiáng)度（如背陰面和向陽面）會(huì)導(dǎo)致環(huán)境溫度具有差異，從而影響微生物的分布格局[11].研究已證明海拔梯度和光照強(qiáng)度是影響微生物群落的關(guān)鍵因子[12].因此，海拔梯度可能是影響雙孢線蟲草微生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性的重要因素.前人只對(duì)不同生境雙孢線蟲草微生物多樣性進(jìn)行了比較[4]，但對(duì)不同的海拔梯度以及其他環(huán)境因子，如光照強(qiáng)度對(duì)雙孢線蟲草真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響沒有進(jìn)行深入研究.本研究初步探討海拔梯度和光照強(qiáng)度對(duì)雙孢線蟲草真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分布格局的影響，該研究可為雙孢線蟲草微生物群落中真菌資源挖掘與利用提供參考，同時(shí)為蟲草真菌群落與環(huán)境相互作用提供研究思路.

1 材料和方法

1.1 樣品采集雙孢線蟲草樣本于2018 年7 月采自云南省玉溪市新平縣新化鄉(xiāng)（北緯24.12°，東經(jīng)101.85°）.蟲草樣本處于成熟階段，根據(jù)海拔梯度以及蟲草分布特點(diǎn)，山的背陰面設(shè)置OFA，OFB 和OFC 樣點(diǎn)，光禿的山頂設(shè)置OFD 樣點(diǎn)，山的向陽面設(shè)置OFE 樣點(diǎn).固定樣方10 m×10 m 內(nèi)隨機(jī)采集樣本，每個(gè)樣點(diǎn)采集5 份重復(fù)樣（圖1 和表1）.樣本用75%酒精進(jìn)行表面消毒2～3 min，30% 過氧化氫溶液浸泡3～5 min，再用無菌水沖洗3 次[13].將處理后的所有樣本裝入無菌離心管并放入液氮運(yùn)回，保存于?80 ℃?zhèn)溆?

圖1 雙孢線蟲草Fig.1 Ophiocordyceps bispora

表1 樣本采集具體信息Tab.1 Sepecific information of sampls collected

1.2 DNA 提取、擴(kuò)增及測(cè)序試劑盒 Micro Elute Genomic DNA Kit D3096 提取雙孢線蟲草總DNA，其操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的純度和濃度.用 ITS2 引物ITS4-2409R（5 ′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ′ ）和ITS3-2024F（5 ′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′）對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)過程如下：95℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延長(zhǎng)5 min.反應(yīng)產(chǎn)物于Illumina MiSeq 進(jìn)行上機(jī)測(cè)序.

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1 序列優(yōu)化 經(jīng)Illumina MiSeq 高通量測(cè)序得到的序列根據(jù)Barcode 和PCR 擴(kuò)增引物拆分出各樣本數(shù)據(jù)，截去Barcode 和PCR 擴(kuò)增引物得到reads，根據(jù)前端和后端序列之間的重疊關(guān)系，將成對(duì)的 reads 拼接成原始數(shù)據(jù)（Raw Tags），對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行截取、過濾和去除嵌合體序列后得到有效序列.

1.3.2 OTU 聚類及注釋 用 Uparse 軟件（v 7.0.1001，http://drive5.com/uparse/）按相似度≥ 97% 將有效序列聚類為 OTU（operational taxonomicunit），選取出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTU 代表序列，用Qiime 軟件（Version 1.9.1）中blast（http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html）與Unit（https://unite.ut.ee/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種分類注釋.已得到的序列數(shù)按54 780 bp 進(jìn)行均一化處理，真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析基于每組樣本數(shù)的平均值.Uparse 軟件（v 7.0.1001）計(jì)算 Chao1、Ace、香農(nóng)?威納指數(shù)和辛普森指數(shù).Excel 分析門、屬和種水平上的真菌群落結(jié)構(gòu).Pearson 軟件(v 3.7)分析真菌群落結(jié)構(gòu)與海拔梯度之間的相關(guān)性，在線網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)MetaCoMET（http://probes.pw.usda.gov/MetaCoMET）分析組間共有的核心 OTU.Anosim 分析真菌群落組內(nèi)和組間的差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本序列信息本研究采集的25 份樣本，因3 份（OFA5、OFB3 和 OFC2）達(dá)不到建庫(kù)要求被剔除，文中只對(duì) 22 份樣本進(jìn)行結(jié)果分析.22 份樣本共獲得有效序列為1 230 692 條，各樣本有效序46 448～65 759 條，基于OTU Number 水平繪制稀釋曲線，各樣本OTU 為13～76 個(gè)，隨著樣本序列數(shù)的增加，可檢測(cè)到的OTU 趨近于平緩狀態(tài)，說明數(shù)據(jù)合理（圖2）.22 份樣本共得到445 個(gè)真菌OTUs，隸屬于3 門、13 綱、41 目、69 科、66 屬和257 種真菌物種.

圖2 稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curve

2.2 雙孢線蟲草真菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 雙孢線蟲草真菌多樣性分析 雙孢線蟲草各樣點(diǎn)α多樣性見圖3.結(jié)果表明，OFC 樣點(diǎn)多樣性最高，OFB 樣點(diǎn)次之，OFE 樣點(diǎn)多樣性最低.背陰面的樣點(diǎn)隨著海拔的升高，雙孢線蟲草真菌多樣性也呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì).真菌多樣性與海拔梯度相關(guān)性分析表明，真菌多樣性與海拔高度不存在顯著相關(guān)性（p>0.05，表2），OFD 比OFC 和OFB樣點(diǎn)真菌多樣性較低.出現(xiàn)這種結(jié)果可能是OFD、OFC 和OFB 樣點(diǎn)的植被類型不同，OFC 和OFB 樣點(diǎn)有茂密的草叢和樹林遮擋，可以有效減少光的直接照射，光禿的山頂OFD 樣點(diǎn)，其光照強(qiáng)度比向陽面OFE 樣點(diǎn)更強(qiáng).然而，OFD 樣點(diǎn)的真菌多樣性比OFE 樣點(diǎn)高，OFE 樣點(diǎn)人類活動(dòng)比較頻繁，且具有樹林遮擋.因此，雙孢線蟲草真菌群落多樣性可能受植被類型以及人為活動(dòng)的影響.

圖3 各樣本α 多樣性指數(shù)Fig.3 Alpha diversity index of each sample

雙孢線蟲草真菌豐富度最高為OFE 樣點(diǎn)，OFA、OFB、OFC 和OFD 樣點(diǎn)豐富度差異較小.隨著海拔梯度的升高雙孢線蟲草真菌豐富度呈現(xiàn)上升?下降?上升的趨勢(shì).由表2 可見，真菌豐富度與海拔梯度不存在顯著相關(guān)性（p>0.05）.OFB 樣點(diǎn)的豐富度比OFC 樣點(diǎn)高，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能OFB 樣點(diǎn)的植被與OFC 樣點(diǎn)不同.OFE 樣點(diǎn)為山的向陽面，其光照強(qiáng)度和海拔梯度比OFD 樣點(diǎn)弱，但OFE 樣點(diǎn)的豐富度卻比山頂OFD 樣點(diǎn)高，OFE 樣點(diǎn)是人類活動(dòng)比較頻繁的樣點(diǎn)，并且有針闊混交林遮擋光照.雙孢線蟲草真菌群落豐富度可能不受光照強(qiáng)度的影響，人類活動(dòng)和植被類型可能是影響雙孢線蟲草真菌多樣性的因素.

表2 α 多樣性指數(shù)與海拔梯度相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis between alpha diversity index and elevation gradients

2.2.2 雙孢線蟲草真菌群落結(jié)構(gòu)分析 雙孢線蟲草不同樣點(diǎn)共得到445 個(gè)真菌OTUs，隸屬于3 門、66 屬 和257 個(gè)真菌物種.分別為子囊菌門Ascomycota、擔(dān)子菌門Basidiomycota 和接合菌門Zygomycota（圖4），其中子囊菌門為優(yōu)勢(shì)門，相對(duì)豐度為98.84%～99.95%.擔(dān)子菌門和接合菌門相對(duì)豐度較低0.01%～1.1%.

圖4 門水平上的真菌群落組成Fig.4 Fungal community composition at phylum level

雙孢線蟲草屬水平分析結(jié)果顯示（圖5，6），線蟲草屬Ophiocordyceps為各樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)屬 84.85%～97.64%，圖6 將線蟲草屬移除后對(duì)相對(duì)豐度>0.01%的屬進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，優(yōu)勢(shì)屬枝穗霉屬Clonostachys相對(duì)豐度為0.62%～14.61 %，多頭霉屬Polycephalomyces相對(duì)豐度為0.14%～8.48%，木霉 屬Trichoderma0.03%～0.22%，Purpureocillium0.01%～0.16%，鐮刀菌屬Fusarium0.01%～0.04%和被孢霉屬M(fèi)ortierella0.01%～0.27%.隨著海拔梯度及光照強(qiáng)度的變化，枝穗霉屬和多頭霉屬相對(duì)豐度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，多頭霉屬相對(duì)豐度在OFB 樣點(diǎn)達(dá)到最大值，枝穗霉屬相對(duì)豐度在OFC 樣點(diǎn)達(dá)到最大值，OFB 和OFC 樣點(diǎn)植被與其他樣點(diǎn)不同，兩個(gè)優(yōu)勢(shì)屬分別在OFB 和OFC 樣點(diǎn)相對(duì)豐度達(dá)到最大值可能與植被類型有著密切的關(guān)系.

圖5 屬水平上的真菌群落組成Fig.5 Fungal community composition at genus level

圖6 移除線蟲草屬后不同樣點(diǎn)的真菌群落組成Fig.6 Fungal community composition of different samples after removed Ophiocordyceps

2.2.3 雙孢線蟲草核心OTU 分析 雙孢線蟲草組間的核心OTU 通過MetaCoMET 網(wǎng)絡(luò)在線平臺(tái)分析，結(jié)果顯示，5 組樣本得到445 個(gè)OTUs，OFA樣點(diǎn)73 個(gè)，OFB 樣點(diǎn)79 個(gè)，OFC 樣點(diǎn)71 個(gè)，OFD樣點(diǎn)92 個(gè)，OFE 樣點(diǎn)130 個(gè)，5 個(gè)采樣點(diǎn)共有41個(gè)核心OTUs（圖7）.隨著海拔梯度升高，背陰面的3 個(gè)樣點(diǎn)OTUs 差異較小，OFD 樣點(diǎn)的核心OTU比背陰面OFA、OFB 和OFC 樣點(diǎn)多，OFD 的樣本采自山頂，其光照強(qiáng)度、海拔梯度和植被類型與背陰面樣點(diǎn)均不同，可能各樣點(diǎn)核心OTU 受這3 種因素的影響.OFE 樣點(diǎn)的核心OTU 最多，該樣點(diǎn)為山的向陽面，海拔梯度比OFD 樣點(diǎn)低，光照強(qiáng)度比OFD 樣點(diǎn)弱，同時(shí)，OFE 樣點(diǎn)具有稀疏的植被遮擋和人類頻繁的活動(dòng).因此，各樣點(diǎn)核心OTUs 可能不僅受光照強(qiáng)度的影響，植被類型和人類活動(dòng)也是重要因素，這也與上文豐富度分析結(jié)果一致.

圖7 不同樣點(diǎn)的核心OTUsFig.7 Core OTUs of different sample

2.3 雙孢線蟲草真菌群落差異分析運(yùn)用Anosim分析雙孢線蟲草的真菌群落在組間的差異是否顯著大于組內(nèi)差異，從而判斷分組是否合理（圖8）.結(jié)果顯示，R=0.093，R>0 則說明各組間真菌群落具有顯著差異.通過T-test 檢驗(yàn)，OFE 和OFB 樣點(diǎn)、OFE和OFC 樣點(diǎn)、OFE 和OFD 樣點(diǎn)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，Mortierella在組間具有顯著差異P<0.05（圖9（a）～（c））.真菌群落和海拔梯度的相關(guān)性分析表明，其中14 個(gè)屬與海拔梯度呈現(xiàn)正相關(guān)（圖10）.

圖8 不同樣點(diǎn)Anosim 分析Fig.8 Anosim analysised in different of samples

圖9 雙孢線蟲草真菌群落組間 T-test 檢驗(yàn)Fig.9 Between groups of Ophiocordyceps bispora fungal community be T-tested

圖10 真菌群落和海拔梯度相關(guān)性分析Fig.10 The correlation analysised of fungal community and elevation gradients

3 討論

本文基于 Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì) 5組雙孢線蟲草樣本進(jìn)行 ITS2（internal transcribed spacer2）區(qū)域測(cè)序，以比較不同海拔梯度和光照強(qiáng)度下真菌多樣性、豐富度和群落結(jié)構(gòu).測(cè)序結(jié)果表明，從22 份樣本中共得到445 個(gè)真菌OTUs，隸屬于3 門、13 綱、41 目、69 科、66 屬和257 個(gè)真菌物種，顯示出豐富的真菌資源.子囊菌門是廣泛存在于蟲草中的優(yōu)勢(shì)門，與冬蟲夏草、蟬花蟲草以及新古尼異蟲草研究結(jié)果一致[7-9].除線蟲草屬為優(yōu)勢(shì)屬外，還存在一些其他優(yōu)勢(shì)屬，表明雙孢線蟲草也存在定植現(xiàn)象，這與蟬花蟲草和新古尼異蟲草研究結(jié)果相似[7-8].各樣點(diǎn)其他優(yōu)勢(shì)屬分別為枝穗霉屬、多頭霉屬、木霉屬、鐮刀菌屬、被孢屬和Purpureocillium，隨著海拔梯度及光照強(qiáng)度的變化，在各個(gè)樣點(diǎn)真菌優(yōu)勢(shì)屬相對(duì)豐度變化較小，但枝穗霉屬和多頭霉屬相對(duì)豐度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，OFB 和OFC 樣點(diǎn)的植被類型不同可能是影響枝穗霉屬和多頭霉屬相對(duì)豐度變化的因素.值得關(guān)注的是，本文中真菌優(yōu)勢(shì)屬與前人研究冬蟲夏草優(yōu)勢(shì)屬類群有所不同[9,13]，已有研究結(jié)果顯示，枝穗霉屬、木霉屬、鐮刀菌屬在農(nóng)作物病蟲害防治和改善土壤環(huán)境方面具有重要作用[14-15]，并且還是土壤質(zhì)量重要的檢測(cè)指標(biāo)，本文研究結(jié)果也側(cè)面表明該地區(qū)受重金屬污染較小，土壤環(huán)境質(zhì)量較好[16].

隨著海拔梯度的升高，雙孢線蟲草真菌多樣性和豐富度呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢(shì).雙孢線蟲草真菌多樣性和豐富度與海拔梯度相關(guān)性分析結(jié)果表明，真菌多樣性和豐富度與海拔梯度沒有顯著相關(guān)性（P>0.05），然而真菌群落和海拔梯度相關(guān)性分析結(jié)果顯示，其中14 個(gè)屬與海拔梯度呈正相關(guān).這與暴家兵等[17]研究海拔梯度對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著差異不一致.可能本文中各樣點(diǎn)設(shè)置的海拔梯度距離較小，以及本文研究對(duì)象是真菌群落導(dǎo)致.雙孢線蟲草真菌群落多樣性和豐富度除了受光照強(qiáng)度的影響外，可能還受植被類型以及人為活動(dòng)的影響，適當(dāng)?shù)娜藶楦蓴_是促成真菌群落多樣性和豐富度較高的一個(gè)重要因素，與前人研究雙孢線蟲草微生物群落結(jié)構(gòu)受生境影響的結(jié)果相似[4].

雙孢線蟲草核心 OTU 結(jié)果顯示，隨著海拔梯度升高，OFA、OFB、OFC 和OFD 樣點(diǎn)OTUs 差異較小，向陽面OFE 樣點(diǎn)的OTUs 明顯多于其他4個(gè)樣點(diǎn)，該樣點(diǎn)的微生境（海拔梯度、光照強(qiáng)度、植被類型和人為活動(dòng)）與其他樣點(diǎn)不同，可能各樣點(diǎn)核心OTUs 同時(shí)受海拔梯度、光照強(qiáng)度、植被類型和人為活動(dòng)的影響.通過T-test 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Mortierella屬在OFB、OFC、OFD 和OFE 樣點(diǎn)均具有顯著差異（P<0.05）.研究報(bào)道，Mortierella對(duì)重金屬污染較為敏感[16]，本文研究結(jié)果說明OFB、OFC、OFD和OFE 樣點(diǎn)的重金屬污染程度可能不同，導(dǎo)致差異形成的原因還有待進(jìn)一步研究.