趙采芹　王燕碧　張福平　唐宏　周磊　韓一帆　段志強(qiáng)

摘要：【目的】分析腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）及具有叉頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域的TRAF相互作用蛋白（TIFA）基因在貴州黃雞不同發(fā)育階段各組織中的表達(dá)特點(diǎn)，為后續(xù)開(kāi)展TRAF6和TIFA基因調(diào)控雞的生長(zhǎng)發(fā)育及二者相互作用調(diào)控雞相關(guān)病毒復(fù)制打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坷肦T-PCR擴(kuò)增雞TRAF6和TIFA基因編碼區(qū)（CDS）序列，通過(guò)ProtParam、SOPMA、SWISS-MODEL及MegAlign等在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析;同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)TRAF6和TIFA基因在雞胚發(fā)育第14 d（E14d）、雞出殼第1 d（H1d）、第7 d（H7d）和第14 d（H14d）不同組織中的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】雞TRAF6和TIFA基因CDS序列全長(zhǎng)分別為1638和564 bp，編碼545和187個(gè)氨基酸殘基，對(duì)應(yīng)的編碼蛋白分子量約62和22 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為6.14和5.18。雞TRAF6蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲占47.08%、α-螺旋占38.14%、延伸鏈占11.86%、β-轉(zhuǎn)角占2.92%，雞TIFA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲占51.87%、α-螺旋占27.81%、延伸鏈占16.58%、β-轉(zhuǎn)角占3.74%，二者均以無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為主。TRAF6和TIFA基因核苷酸序列同源比對(duì)分析均顯示雞與火雞的相似性最高，分別為96.4%和92.2%，符合物種進(jìn)化規(guī)律，也表明TRAF6和TIFA基因在禽類中具有一定的遺傳保守性。TRAF6和TIFA基因在貴州黃雞不同發(fā)育階段的眼球、腦組織、心臟、肝臟、肺臟、肌胃、胸肌及腿肌中均有不同程度表達(dá)，且內(nèi)臟組織的相對(duì)表達(dá)量普遍高于肌肉組織，以肺臟中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是肝臟和肌胃;從E14d發(fā)育到H14d，雞TRAF6和TIFA基因在肺臟、肝臟和肌胃中的表達(dá)均呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，在眼球中則呈先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)，在腦組織、胸肌和腿肌的表達(dá)水平較低且趨于穩(wěn)定?！窘Y(jié)論】TRAF6和TIFA基因在雞不同發(fā)育階段各組織中均有表達(dá)，且以肺臟和肝臟中的表達(dá)水平相對(duì)較高，在腦組織、胸肌和腿肌中的表達(dá)相對(duì)較低，故推測(cè)TRAF6和TIFA基因相互作用對(duì)雞的生長(zhǎng)發(fā)育具有調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 貴州黃雞;TRAF6基因;TIFA基因;組織表達(dá)特征;發(fā)育階段

中圖分類號(hào)： S831.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）02-0546-11

Cloning and analysis tissue expression of chicken

TRAF6 and TIFA genes

ZHAO Cai-qin， WANG Yan-bi， ZHANG Fu-ping， TANG Hong，

ZHOU Lei，HAN Yi-fan， DUAN Zhi-qiang

（College of Animal Sciences， Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction in the Plateau Mountains Region， Ministry of Education/Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction in Guizhou， Guiyang? 550025， China）

Abstract：【Objective】The aim of this study was to analyze the expression characteristics of the tumor necrosis factor （TNF）， receptor-associated factor 6 （TRAF6） and TRAF6 interactions with a forkhead associated domain protein （TIFA） genes in tissues of Guizhou yellow chickens at different developmental stages， which provided a foundation for further studying the role of TRAF6 and TIFA genes in chicken growth and development and the replication of chicken associa-ted virus. 【Method】The coding DNA sequences （CDS） of chicken TRAF6 and TIFA genes were amplified by RT-PCR and then analyzed by bioinformatics software including ProtParam， SOPMA， SWISS-MODEL and MegAlign. Quantitative real-time PCR was used to detect the expression of TRAF6 and TIFA genes in different tissues in 14 day old （E14d） chicken embryos， and at 1 （H1d）， 7 （H7d） and 14 （H14d） days after hatching. 【Result】The CDS regions of chicken TRAF6 and TIFA genes were 1638 and 564 bp in length， respectively， which encoded 545 and 187 amino acids. The corresponding proteins had molecular weights of about 62 and 22 kD， with theoretical isoelectric points of 6.14 and 5.18. The results of protein secondary structure analysis showed that chicken TRAF6 and TIFA proteins mainly contained irregular coil （47.08% and 51.87%）， alpha helix （38.14% and 27.81%）， extended chain （11.86% and 16.58%）， and β -rotation （2.92% and 3.74%）， respectively. Therefore， the two proteins were primarily composed of irregular coil and alpha helix. The nucleotide homology analysis of TRAF6 and TIFA genes revealed that chicken and turkey had the highest similarity at 96.4% and 92.2%， respectively， indicating a certain degree of genetic conservatism among avian species. The tissue expression analysis showed that TRAF6 and TIFA genes had different expression levels in the eyeball， brain tissue， heart， liver， lung， masticatory stomach， breast muscle and leg muscle of Guizhou yellow chickens at different developmental stages， but the relative expression level in visceral tissues was much higher than that in muscle tissues， of which the highest visceral expression level was in the lung， followed by the liver and masticatory stomach. From E14d to H14d， the expression of chicken TRAF6 and TIFA genes in lung， liver and masticatory stomach first showed a trend of decrease then an increase. The expression in the eye showed first a rising trend then falling and rising again. The expression in brain tissue， breast muscle and leg muscle was initially low then tended towardsa higher， stable level. 【Conclusion】TRAF6 and TIFA genes were expressed in all tissues of chicken at different developmental stages， with relatively high expression levels in the lung and liver， but relatively low in brain tissue， breast muscle and leg muscle， suggesting that the interaction between TRAF6 and TIFA genes could regulate the growth and development of chickens.

Key words： Guizhou yellow chicken; TRAF6 gene; TIFA gene; tissue expression; developmental stages

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31760732，31960698）;Science and Technology Foundation of Guizhou Province（QKHJC〔2020〕1Y134）;Joint Project of Local Poultry Industry in Guizhou Province（QCN〔2020〕175）

0 引言

【研究意義】腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）是白細(xì)胞介素1受體/Toll樣受體（IL-1/TLR）超家族的一種關(guān)鍵銜接蛋白，具有E3泛素連接酶作用（Dou et al.，2018），可通過(guò)激活下游的細(xì)胞核因子κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）及干擾素調(diào)節(jié)因子等信號(hào)通路，影響細(xì)胞的增殖、分化與凋亡，并調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和骨代謝等生物學(xué)過(guò)程（Jeong et al.，2007;Schnetzke et al.，2013）。具有叉頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域的TRAF相互作用蛋白[TNF receptor associated factor（TRAF）-interacting protein with a Forkhead-associated （FHA） domain，TIFA]是一種在白細(xì)胞介素1（Interleukin 1，IL-1）信號(hào)通路上將TRAF6連接到IL-1受體相關(guān)激酶1的蛋白分子（Takatsuna et al.，2003），在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用（Pennell et al.，2010）。此外，TIFA與先天性免疫相關(guān)，通過(guò)調(diào)節(jié)TRAF6蛋白的泛素化和寡聚化激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞炎性因子產(chǎn)生（Ea et al.，2004）。目前，關(guān)于人類和小鼠TRAF6、TIFA在NF-κB信號(hào)通路中抵抗微生物感染的報(bào)道越來(lái)越多，但針對(duì)其組織表達(dá)特征的研究相對(duì)較少。因此，開(kāi)展雞TRAF6和TIFA基因生物信息學(xué)及其組織表達(dá)特征分析，可為后續(xù)探討TRAF6和TIFA基因調(diào)控雞相關(guān)組織生長(zhǎng)發(fā)育及二者相互作用抵抗病毒感染的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】TRAF6在人類和不同動(dòng)物的組織中廣泛表達(dá)，尤其在肝臟、肺臟、脾臟和心臟中高表達(dá)，在腦組織中也有表達(dá)（Jin et al.，2017;Guo et al.，2019）。已有研究證實(shí)，TRAF6白不僅介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還在先天性免疫反應(yīng)及淋巴結(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胚胎發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮重要作用（Lomaga et al.，1999;Xiao et al.，2020）。此外，TRAF6是多種組織發(fā)育所必須的蛋白。Lomaga等（1999）研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠TRAF6基因后一些神經(jīng)區(qū)域出現(xiàn)神經(jīng)管缺陷和裸腦產(chǎn)生的現(xiàn)象，從而引起小鼠的非正常死亡。Akiyama 等（2005）研究表明，TRAF6基因缺乏會(huì)導(dǎo)致小鼠的胸腺基質(zhì)發(fā)育異常，從而改變其免疫耐受性。王曉芬（2019）通過(guò)生長(zhǎng)發(fā)育定量和成蠅干擾投喂試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TRAF6基因在家蠅不同發(fā)育階段均有表達(dá)，且在蛹和成蠅階段表達(dá)量較高，表明TRAF6參與家蠅蛹期生殖發(fā)育過(guò)程且在家蠅的發(fā)育中發(fā)揮免疫防御作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)TRAF6和TIFA基因在肺癌患者的肺臟組織存在高表達(dá)，沉默TIFA基因可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，并抑制肺癌細(xì)胞遷移（駱磊，2014;門萬(wàn)夫，2017）。Jin等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6基因在新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）感染前的雞肺臟和脾臟中高表達(dá)，而在感染后的雞免疫器官（法氏囊、脾臟和胸腺）中高表達(dá)，表明TRAF6基因在宿主防御雞病毒感染過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。本課題組最近研究發(fā)現(xiàn)，M蛋白的細(xì)胞質(zhì)定位能通過(guò)下調(diào)TIFA/TRAF6/NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生而促進(jìn)NDV復(fù)制（Duan et al.，2020）。綜上所述，TRAF6和TIFA基因在調(diào)控動(dòng)物組織生長(zhǎng)發(fā)育及TIFA/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路抵抗微生物感染方面發(fā)揮重要作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，TRAF6與TIFA相互作用在機(jī)體先天性免疫方面的報(bào)道僅涉及非洲爪蟾（Inoue et al.，2005）和人類（Huang et al.，2019），有關(guān)雞TRAF6和TIFA相互作用及二者在雞組織中的表達(dá)特征尚未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以貴州黃雞為研究對(duì)象，克隆雞RAF6和TIFA基因的完整編碼區(qū)（CDS）序列，運(yùn)用在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TRAF6和TIFA基因在雞胚發(fā)育第14 d（E14d）、雞出殼第1 d（H1d）、第7 d（H7d）和第14 d（H14d）不同組織中的表達(dá)情況，分析二者在雞組織發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特點(diǎn)，為后續(xù)開(kāi)展TRAF6和TIFA基因調(diào)控雞的生長(zhǎng)發(fā)育及二者相互作用調(diào)控雞相關(guān)病毒復(fù)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

雞胚成纖維細(xì)胞（DF-1）和大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞由貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。貴州黃雞受精雞蛋由貴州大學(xué)種雞場(chǎng)提供，在相同條件下進(jìn)行孵化及飼養(yǎng)管理，取樣屠宰后用高溫滅菌的剪刀和鑷子分別取E14d、H1d、H7d和H14d等4個(gè)階段貴州黃雞的眼球、腦組織、心臟、肝臟、肺臟、肌胃、胸肌及腿肌等8個(gè)組織，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。主要試劑：TRIzol Regent提取試劑盒及膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司;Star-Script Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自GenStar公司;SYBR Green qPCR Master Mix（No ROX）購(gòu)自APE×BIO公司;2×Taq PCR StarMix及DNA Marker購(gòu)自Thermo Fisher公司;pMD19-T載體、卡那霉素和氨芐青霉素購(gòu)自TaKaRa公司;其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1. 2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank已公布的雞TRAF6基因（XM_015287208.2）和TIFA基因（XM_015276339.2），利用Primer Premier 5.0分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增雞TRAF6和TIFA基因的特異性引物（表1），以GAPDH為內(nèi)參基因。所有引物均委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1. 3 雞TRAF6和TIFA基因克隆

使用TRIzol法從DF-1細(xì)胞中提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以特異性引物分別擴(kuò)增雞TRAF6和TIFA基因CDS序列。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，按照膠回收試劑盒說(shuō)明對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收，將膠回收產(chǎn)物與pMD19-T載體進(jìn)行連接，金屬浴16 ℃連接24 h，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取白斑單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR鑒定，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將陽(yáng)性菌液送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1. 4 雞TRAF6和TIFA蛋白生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)在線軟件ProtParam（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html/）、SOPMA（http：//npsapbil. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_ sopma.html）和SWISS-MODLE（http：//swissmodel.expasy.org/）分別對(duì)雞TRAF6和TIFA基因編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（鄧珊珊等，2017;康超等，2021）;從GenBank下載不同物種的TRAF6和TIFA基因核苷酸序列，利用MegAlign進(jìn)行多序列比對(duì)分析，并采用MEGA 6.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1. 5 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

根據(jù)TRIzol試劑盒說(shuō)明，分別提取4個(gè)階段的雞眼球、腦組織、心臟、肝臟、肺臟、肌胃、胸肌和腿肌等組織總RNA，利用超微量紫外分光光度計(jì)對(duì)各組織總RNA進(jìn)行濃度和OD測(cè)定，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明合成cDNA第一鏈。

1. 6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)雞TRAF6和TIFA基因表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TRAF6和TIFA基因在雞各組織中的表達(dá)情況。反應(yīng)體系20.0 μL：2×SYBR Green qPCR Master Mix 10.0 μL，上、下游引物各0.5 ?L，cDNA模板0.5 ?L，ROX Refeience Dye 0.4 ?L，ddH2O 8.1 ?L。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 15 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行39個(gè)循環(huán)。熔解曲線由儀器自動(dòng)設(shè)置，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。獲得的熔解曲線呈光滑的S形，可用于2^-ΔΔCt法計(jì)算，且熔解曲線全部呈單峰，峰值較好，即引物特異性良好。

1. 7 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理后，采用2^-ΔΔCt換算目的基因相對(duì)表達(dá)量（韓一帆等，2020），并通過(guò)SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 雞TRAF6和TIFA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

以DF-1細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，分別對(duì)雞TRAF6和TIFA基因CDS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果獲得與預(yù)期結(jié)果相符的TRAF6基因（圖1-A）和TIFA基因（圖1-B）目的條帶。

2. 2 雞TRAF6和TIFA基因測(cè)序結(jié)果

菌液PCR鑒定結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒pMD19-TRAF6和pMD19-TIFA分別獲得1657 bp（圖2-A）和586 bp（圖2-B）的目的條帶。與GenBank已公布的雞TRAF6和TIFA基因序列相比，送測(cè)序的9個(gè)樣品中TRAF6基因CDS序列第148位核苷酸均存在堿基突變（T→C），導(dǎo)致苯丙氨基酸（F）突變?yōu)榱涟被幔↙），都屬于疏水性氨基酸;TIFA基因CDS序列第265位核苷酸發(fā)生堿基突變（T→C），但未引起氨基酸改變。表明雞TRAF6基因和TIFA基因重組質(zhì)粒pMD19-TRAF6和pMD19-TIFA構(gòu)建成功。

2. 3 雞TRAF6和TIFA蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果

2. 3. 1 雞TRAF6和TIFA蛋白理化性質(zhì) 利用ProtParam對(duì)雞TRAF6和TIFA蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示，雞TRAF6基因CDS序列全長(zhǎng)1638 bp，分子式為C₂₆₉₆H₄₂₃₃N₇₇₉O₈₁₉S₅₂，共編碼545個(gè)氨基酸殘基，含量較高的氨基酸是亮氨酸（8.4%）、谷氨酸（8.4%）和精氨酸（6.0%），含量較低的是色氨酸（0.4%）和酪氨酸（2.2%），帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（天冬氨酸+谷氨酸）有68個(gè)，帶正電荷的氨基酸殘基（精氨酸+賴氨酸）有58個(gè);編碼蛋白分子量約62 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為6.14。雞TIFA基因CDS序列全長(zhǎng)564 bp，分子式為C₉₆₂H₁₄₉₁N₂₅₃O₂₉₃S₁₇，共編碼187個(gè)氨基酸殘基，含量較高的氨基酸是谷氨酸（10.2%）、異亮氨酸（8.6%）、絲氨酸（7.0%）和賴氨酸（7.0%），帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（天冬氨酸+谷氨酸）有29個(gè)，帶正電荷的氨基酸殘基（精氨酸+賴氨酸）有21個(gè);編碼蛋白分子量約22 kD，pI為5.18。

2. 3. 2 雞TRAF6和TIFA蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu) 采用SOPMA和SWISS-MODEL分別對(duì)雞TRAF6和TIFA蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，雞TRAF6蛋白由4種結(jié)構(gòu)組成，其中無(wú)規(guī)則卷曲占47.08%、α-螺旋占38.14%、延伸鏈占11.86%、β-轉(zhuǎn)角占2.92%;雞TIFA蛋白也由4種結(jié)構(gòu)組成，其中無(wú)規(guī)則卷曲占51.87%、α-螺旋占27.81%、延伸鏈占16.58%、β-轉(zhuǎn)角占3.74%。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖3）表明，雞TRAF6和TIFA蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)相符，主要由無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成。

2. 3. 3 雞TRAF6和TIFA基因核苷酸序列相似性及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù) 采用MegAlign對(duì)雞與火雞、日本鵪鶉和綠頭鴨等禽類的TRAF6和TIFA基因核苷酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果（圖4-A）顯示，禽類TRAF6基因核苷酸序列相似性在85.9%～96.4%，其中雞與火雞的相似性最高，相似性為96.4%，與短嘴鴉的相似性最低（僅為85.9%）;將雞與牛、褐家鼠及人類等非禽類的TRAF6基因核苷酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果顯示雞與馬的相似性最高（72.7%），與石斑魚(yú)的相似性最低（40.6%）。禽類TIFA基因核苷酸序列相似性在61.7%～92.2%（圖4-B），其中雞與火雞的相似性最高，相似性為92.2%，與冠小嘴烏鴉的相似性最低（61.7%）;將雞與羊、褐家鼠及人類等非禽類的TIFA基因核苷酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果表明雞與人類的相似性最高（45.1%），與穴兔的相似性最低（31.4%）?；赥RAF6和TIFA基因核苷酸序列相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，TRAF6基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖5-A）顯示，雞與火雞在同一分支上，其遺傳距離最近，而與石斑魚(yú)的遺傳距離最遠(yuǎn);TIFA基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖5-B）顯示，雞與火雞位于同一分支上，其遺傳距離最近，而與穴兔的遺傳距離最遠(yuǎn)。

2. 4 不同發(fā)育階段雞TRAF6基因的組織表達(dá)差異

如圖6所示，雞TRAF6基因在E14d、H1d、H7d和H14d等4個(gè)階段各組織中均有表達(dá)，且不同發(fā)育階段雞TRAF6基因的組織表達(dá)水平存在明顯差異。以腦組織為對(duì)照，TRAF6基因在肺臟中的相對(duì)表達(dá)量最高，且在E14d、H1d和H14d階段存在極顯著差異（P<0.01，下同）。在E14d階段的各組織中，TRAF6基因在雞肺臟、肝臟和肌胃中的相對(duì)表達(dá)量也極顯著高于其他組織，在8個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)椋悍闻K>肝臟>肌胃>腿肌>腦組織>眼球>心臟>胸肌;在H1d階段的各組織中，TRAF6基因在肺臟和肝臟的相對(duì)表達(dá)量較高，胸肌中的相對(duì)表達(dá)量最低，在8個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)椋悍闻K>肝臟>肌胃>眼球>腿肌>心臟>腦組織>胸肌;在H7d階段的各組織中，TRAF6基因在肺臟和肝臟中的相對(duì)表達(dá)量也較高，且極顯著高于其他組織，胸肌中的相對(duì)表達(dá)量最低，在肌胃、心臟和眼球中的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著（P>0.05，下同），在8個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)椋悍闻K>肝臟>肌胃>心臟>眼球>腦組織>腿肌>胸肌;在H14d階段的各組織中，TRAF6基因在腦組織中的表達(dá)量最低，且在眼球、肌胃和腿肌中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于腦組織，在8個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)椋悍闻K>肝臟>眼球>肌胃>腿肌>腦組織>心臟>胸肌。

2. 5 不同發(fā)育階段雞TIFA基因的組織表達(dá)差異

如圖7所示，不同發(fā)育階段雞TIFA基因的組織表達(dá)水平存在明顯差異。以腦組織為對(duì)照，TIFA基因在E14d、H1d、H7d和H14d等4個(gè)階段的各組織中均能檢測(cè)到，且以肺臟中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是肝臟。在E14d階段的各組織中，TIFA基因在腦組織中的相對(duì)表達(dá)量最低，在肺臟中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他組織，在8個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)椋悍闻K>肝臟>肌胃>心臟>眼球>腿肌>胸肌>腦組織;在H1d階段的各組織中，TIFA基因在肝臟和肺臟中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他組織，在眼球、心臟、肌胃、胸肌和腿肌中的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著，具體排序?yàn)椋悍闻K>肝臟>眼球>心臟>肌胃>胸肌>腿肌>腦組織;在H7d階段的各組織中，TIFA基因在肺臟和肝臟中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他組織，以胸肌中的相對(duì)表達(dá)量最低，在8個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)椋悍闻K>肝臟>肌胃>心臟>眼球>腦組織>腿肌>胸肌;在H14d階段的各組織中，TIFA基因在肺臟中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他組織，肌胃、心臟和眼球中的相對(duì)表達(dá)量也極顯著高于腦組織，在8個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)椋悍闻K>肝臟>肌胃>心臟>眼球>腦組織>胸肌>腿肌。

2. 6 雞TRAF6和TIFA基因在不同發(fā)育階段各組織中的表達(dá)變化趨勢(shì)

雞TRAF6和TIFA基因在4個(gè)階段各組織中的表達(dá)變化趨勢(shì)如圖8所示。從E14d發(fā)育到H14d，TRAF6基因在肺臟、肝臟和肌胃中的表達(dá)均呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，于H7d階段降至最低值，整體上呈V形變化模式;腦組織中的TRAF6基因表達(dá)在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)均趨于穩(wěn)定;在眼球中，TRAF6基因的表達(dá)呈先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)。TIFA基因在肝臟、肺臟、心臟和肌胃中的表達(dá)也呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，但最低值出現(xiàn)的發(fā)育階段不同，肝臟、肺臟和心臟在H7d階段降至最低值，肌胃則在H1d階段降至最低值;TIFA基因在眼球中的表達(dá)呈先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)，在其他組織中的表達(dá)整體上趨于穩(wěn)定。

3 討論

已有研究證實(shí)，在非洲爪蟾中TIFA與TRAF6相互作用后可激活NF-κB信號(hào)通路（Inoue et al.，2005）。Huang等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，人類TRAF6蛋白TRAF結(jié)構(gòu)域與TIFA蛋白FHA結(jié)構(gòu)域相互作用是介導(dǎo)NF-κB激活的重要因素。近年來(lái)，關(guān)于TRAF6上游蛋白分子介導(dǎo)TRAF6/NF-kB信號(hào)通路的研究報(bào)道越來(lái)越多，包括TLR4/TRAF6/NF-κB、IRAK1/TRAF6/NF-κB和IL-17RA/TRAF6/NF-κB等（Edmonds et al.，2011;Ding et al.，2013;Ahmedy et al.，2020）。已有研究表明，志賀氏菌感染可抑制宿主的TRAF6/NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而抑制炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，促進(jìn)志賀氏菌復(fù)制（Ying and Ferrero，2019）?？梢?jiàn)，TRAF6介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路在揭示病毒和細(xì)菌感染機(jī)理方面具有重要意義。在NF-κB信號(hào)通路中，TIFA與TRAF6的相互作用在抵抗微生物感染方面也逐漸得到關(guān)注。TRAF6作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要的銜接作用（Ishida et al.，1996）。TRAF6的組織分布是其功能的重要決定因素，且影響細(xì)胞在不同組織中監(jiān)測(cè)不同微生物的能力（Cheng et al.，2015）;TRAF6對(duì)正常的骨骼形成也至關(guān)重要（Naito et al.，2002）。Kobayashi等（2001）利用基因敲除技術(shù)在胚胎發(fā)育過(guò)程中敲除TRAF6基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRAF6基因缺陷型小鼠因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷而導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松和缺乏淋巴結(jié)，同時(shí)表現(xiàn)出汗?jié)裥酝馀邔影l(fā)育不良。Naito等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6對(duì)于X相關(guān)的外異蛋白A2受體（X-linked ectodysplasin-A2 receptor，XEDAR）介導(dǎo)的NF-κB激活必不可少，TRAF6能轉(zhuǎn)導(dǎo)XEDAR發(fā)出與表皮發(fā)育有關(guān)的信號(hào)。Inoue等（2005）研究表明，在非洲爪蟾的胚胎期TRAF6基因不僅在神經(jīng)節(jié)的頭部區(qū)域和神經(jīng)管中表達(dá)，還在咽及頭部和神經(jīng)管中表達(dá)。Zhou等（2015）研究認(rèn)為，TRAF6基因在雌雄梭子蟹各組織中的表達(dá)量存在差異可能與其不同發(fā)育存在聯(lián)系，即TRAF6在組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)TRAF6基因在人類（Starczynowski et al.，2011）、病毒感染小鼠（Mason et al.，2004）和鴨（Zhai et al.，2015）的免疫相關(guān)組織中高表達(dá)，且TRAF6是負(fù)責(zé)病原體識(shí)別受體介導(dǎo)先天免疫應(yīng)答的關(guān)鍵細(xì)胞質(zhì)銜接分子，表明TRAF6在抗病毒先天免疫應(yīng)答的激活中扮演重要角色。

TIFA是通過(guò)酵母菌雙雜交技術(shù)首次篩選獲得并被鑒定的一種TRAF6相互作用蛋白（Takatsuna et al.，2003）。在結(jié)構(gòu)上，TIFA具有N末端叉形頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域（Forkhead-associated，F(xiàn)HA）及C末端共同的TRAF6結(jié)合基序（Huang et al.，2019）。在國(guó)內(nèi)，針對(duì)TIFA基因的研究報(bào)道相對(duì)較少，且主要集中在各類癌癥中的表達(dá)分析。TIFA在肺腺癌中通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路并影響下游蛋白表達(dá)，而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖（門萬(wàn)夫，2017）。TIFA基因在人體內(nèi)的很多組織中均有表達(dá)，且以在脾臟中的表達(dá)量最高，而在骨骼肌中幾乎不表達(dá)（Takatsuna et al.，2003）。Ding等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷和失血性休克后，TIFA基因在肝臟早期顯著上調(diào)而引發(fā)炎癥反應(yīng)。近年來(lái)，ALPK1控制TIFA/TRAF6/NF-κB依賴的先天免疫抵抗細(xì)菌感染也逐漸被報(bào)道（Milivojevic et al.，2017;Xue and Man，2018;Ying and Ferrero，2019），且在宿主抵抗微生物感染的免疫調(diào)控機(jī)制研究方面發(fā)現(xiàn)TIFA/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路活化也是產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的關(guān)鍵通路。

本研究成功克隆獲得雞TRAF6和TIFA基因CDS序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞TRAF6和TIFA蛋白二、三級(jí)主要以無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，為混合型蛋白。無(wú)規(guī)則卷曲是蛋白肽鏈中構(gòu)成配體、受體結(jié)合的組成部分，會(huì)受側(cè)鏈的影響而改變其空間結(jié)構(gòu)。TRAF6和TIFA蛋白的無(wú)規(guī)則卷曲可能是通過(guò)影響蛋白肽鏈的結(jié)合活性而調(diào)節(jié)其功能。TRAF6和TIFA基因核苷酸序列同源比對(duì)分析結(jié)果均顯示，雞與火雞的相似性最高，且分別與石斑魚(yú)和穴兔的相似性最低，符合物種進(jìn)化規(guī)律，表明TRAF6和TIFA基因在禽類中具有一定的遺傳保守性。同時(shí)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TRAF6和TIFA基因在雞發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果表明TRAF6和TIFA基因在貴州黃雞不同發(fā)育階段的眼球、腦組織、心臟、肝臟、肺臟、肌胃、胸肌及腿肌中均有不同程度表達(dá)，且內(nèi)臟組織的相對(duì)表達(dá)量普遍高于肌肉組織，說(shuō)明TRAF6和TIFA基因?qū)儆趶V譜表達(dá)基因，在肌肉組織中低表達(dá)暗示貴州黃雞的TRAF6和TIFA基因可能已獲得非免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。雞TRAF6和TIFA基因表達(dá)量受生長(zhǎng)發(fā)育的影響，在不同發(fā)育階段的肺臟、肝臟和肌胃中，TRAF6和TIFA基因的相對(duì)表達(dá)量均隨貴州黃雞日齡增長(zhǎng)呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，表明TRAF6和TIFA基因在雞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的不同階段可能發(fā)揮著不同的調(diào)控作用。此外，TRAF6和TIFA基因在貴州黃雞4個(gè)發(fā)育階段肺臟中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是肝臟，與駱磊（2014）、賈生美（2017）、Jin等（2017）、丁少青等（2019）的研究結(jié)果一致，即在E14d階段肺臟中高表達(dá)，暗示TRAF6和TIFA基因可能參與雞肺臟的發(fā)育及早期胚胎的形成;在H1d、H7d和H14d階段肺臟中高表達(dá)，故推測(cè)TRAF6和TIFA基因還參與雞肺臟中的先天免疫;在肝臟中高表達(dá)則表明TRAF6和TIFA基因可能與脂代謝及糖代謝等調(diào)控功能相關(guān)。此外，TRAF6基因在貴州黃雞4個(gè)階段腦組織、胸肌和腿肌中的表達(dá)量相對(duì)較低，與駱磊（2014）、Jin等（2017）研究發(fā)現(xiàn)TRAF6基因在白來(lái)航雞和黑康三世蛋雞中的表達(dá)規(guī)律一致，故推測(cè)TRAF6基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中也發(fā)揮重要作用。TRAF6基因在貴州黃雞不同發(fā)育階段肌胃中的表達(dá)呈中等水平，而Inoue等（2005）研究發(fā)現(xiàn)TRAF6基因在非洲爪蟾胃中的表達(dá)水平較低，可能是物種差異所致。TRAF6和TIFA基因在不同物種各組織和胚胎發(fā)育階段的特異性表達(dá)，揭示二者在生命體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，尤其與生長(zhǎng)發(fā)育、骨代謝和先天免疫等密切相關(guān)，但是否影響貴州黃雞組織生長(zhǎng)發(fā)育尚未明確。

4 結(jié)論

TRAF6和TIFA基因在雞不同發(fā)育階段各組織中均有表達(dá)，且以肺臟和肝臟中的表達(dá)水平相對(duì)較高，在腦組織、胸肌和腿肌中的表達(dá)相對(duì)較低，故推測(cè)TRAF6和TIFA基因相互作用對(duì)雞的生長(zhǎng)發(fā)育具有調(diào)控作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）