自釀葡萄酒香氣成分的多萃取方法分析

邱智軍，陳艷楠，原江鋒, 張 彬

(河南科技大學(xué)a.食品與生物工程學(xué)院；b.河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023)

0 引言

葡萄酒具有令人舒適的特征和性質(zhì)，中國作為葡萄酒產(chǎn)業(yè)大國，每一種葡萄酒均具有區(qū)別于其他葡萄酒所獨有的香氣和口感[1]。葡萄酒的香氣物質(zhì)主要有酯、醇、酸、醛、酮、酚、萜類和其他物質(zhì)，這些香氣物質(zhì)對葡萄酒的品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用[2-4]。目前，越來越多的人開始嘗試自釀葡萄酒，然而對其品質(zhì)好壞卻無法評估，因此對于自釀葡萄酒香氣成分的分析具有重要意義。目前，酒的香氣成分富集方法主要有液-液萃取法(liquid-liquid extraction method，LLE)[5-7]、頂空固相微萃取法(headspace solid phase microextraction method，SPME)[8-10]、水蒸氣蒸餾法(steam distillation extraction method，SDE)和攪拌棒吸附萃取法(stir bar sorptive extraction method，SBSE)[11]等。目前，對于果酒和白酒等的香氣成分的研究較多[12]，而對于自釀紅葡萄酒的香氣成分的研究尚未見報道。

為了更加全面地分析自釀葡萄酒中香氣成分的種類和含量，本研究采用LLE、SPME和SDE這3種香氣成分提取方法對自釀葡萄酒進行處理，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)對自釀半年和一年半的葡萄酒香氣成分進行分析，同時探討并比較這3種提取方法的萃取效果和特點，為自釀葡萄酒的品質(zhì)以及安全性分析提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰香葡萄(山西運城葡萄生產(chǎn)基地)；果酒酵母(湖北安琪生物集團有限公司)；二氯甲烷(CH2Cl2，質(zhì)量分數(shù)99.5%)，無水乙醇(C2H6O，質(zhì)量分數(shù)99.7%)，無水硫酸鈉(Na2SO4，質(zhì)量分數(shù)99.0%)，乙醚(C4H10O，質(zhì)量分數(shù)99.7%)等，以上均是分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

6890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀(美國 Agilent)；揮發(fā)油提取器(天津市德固特科技發(fā)展有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；微量移液器(美國Eppendorf公司)；65 μm聚二甲基硅烷/二乙烯基苯固相微萃取纖維頭及萃取手柄(美國Supelco公司)。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒的釀造

選取成熟的玫瑰香葡萄(可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)為16.7%)，洗凈晾干后除梗、破碎。攪拌均勻后，裝在玻璃瓶中。添加質(zhì)量分數(shù)為10%的白砂糖，質(zhì)量分數(shù)為0.1%的果酒酵母，在15～25 ℃下進行前發(fā)酵，期間用已消毒的勺子每天按壓葡萄皮2次防止生霉。發(fā)酵高潮過后，發(fā)酵勢頭開始減弱直至二氧化碳放出接近平靜，發(fā)酵10 d后，汁液開始清晰時將葡萄皮和葡萄籽過濾。將濾好的葡萄酒瓶封閉，放在陰涼處保存進行二次發(fā)酵，里面的雜質(zhì)會自動沉淀，密閉發(fā)酵20 d后，采用虹吸法除去酵母菌，滿灌密封陳釀半年和一年半后進行試驗。

1.3.2 液-液萃取法

取30 mL待測酒樣，分別用30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有機相，將有機相在1 500 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min后加入無水硫酸鈉脫水干燥，45 ℃減壓濃縮，4 ℃保存，供GC-MS分析。

1.3.3 水蒸氣蒸餾法

取酒樣30 mL置于揮發(fā)油提取器的蒸餾瓶中，加等體積水后連續(xù)蒸餾5 h。采用乙醚萃取含揮發(fā)油的蒸餾液3 次，含揮發(fā)油的乙醚萃取液用無水硫酸鈉脫水過夜，自然揮發(fā)除去乙醚后得到淡黃色油狀液體，待GC-MS聯(lián)用儀檢測使用。

1.3.4 頂空固相微萃取法

量取8 mL不同陳釀時間葡萄酒酒樣置于頂空瓶中，將65 μm聚二甲基硅院/二乙烯基苯固相微萃取頭插入樣品瓶中，萃取30 min后立即拔出萃取器針頭，供GC-MS分析。

1.3.5 GC-MS條件

GC條件：起始溫度為40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，再以8 ℃/min升溫至230 ℃，保持3 min，采用不分流進樣，進樣口溫度為250 ℃，流量為1.0 mL/min，載氣為氦氣(He)。

MS條件：電離方式為電子電離，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍35～450 u。對采集到的質(zhì)譜圖利用NIST05譜庫進行檢索，并用氣相色譜峰面積歸一化定量計算出各香氣成分在酒樣中的相對百分含量(以下簡稱含量)。相對百分含量=(每個組分的峰面積/所有組分的峰面積之和)×100%。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)檢測條件，對自釀葡萄酒揮發(fā)性成分進行GC-MS分析，得到總離子流色譜圖。采用NIST圖庫檢索，按照檢索匹配度>80%的標準進行待測組分定性，以峰面積歸一法計算自釀葡萄酒中揮發(fā)性成分的相對百分含量，所得結(jié)果見表1。

2.1 不同萃取方法下自釀葡萄酒的香氣物質(zhì)分析

2.1.1 LLE的結(jié)果

通過液-液萃取與GC-MS聯(lián)用對陳釀半年和陳釀一年半的自釀葡萄酒香氣成分進行提取與分析，經(jīng)計算機貯存信號的檢索及質(zhì)譜圖進行解析，確定化合物[13]，并采用峰面積歸一化法測定各成分相對百分含量，鑒定出陳釀一年半的葡萄酒中主要香氣成分包括酯類15種、醇類8種、酸類7種，分別占總組分的35.98%、49.18%、2.39%。在陳釀半年的葡萄酒中鑒定出揮發(fā)性風味物質(zhì)包括酯類15種、醇類10種、酸類6種，分別占總組分的18.64%、72.06%、1.54%。

2.1.2 SDE的結(jié)果

通過水蒸氣蒸餾法與GC-MS聯(lián)用對陳釀一年半和陳釀半年的自釀葡萄酒香氣成分進行提取與分析，共鑒定出陳釀一年半葡萄酒中的主要香氣成分有酯類6種、醇類6種，分別占總組分的16.86%、71.85%。陳釀半年葡萄酒中鑒定出揮發(fā)性風味物質(zhì)包括酯類5種、醇類6種，分別占總組分的13.65%、81.62%。采用SDE方法可以富集含量較高的香氣成分。

2.1.3 SPME的結(jié)果

通過SPME與GC-MS聯(lián)用對陳釀一年半和陳釀半年的自釀葡萄酒香氣成分進行提取與分析，并參考文獻[14]用SPME后用GC-MS檢測出的多種揮發(fā)性成分對結(jié)果進行分析比對后，鑒定出主要香氣成分有酯類21種、醇類8種、酸類7種，陳釀一年半的自釀葡萄酒中香氣成分占總組分的57.33%、35.57%、2.68%，陳釀半年的自釀葡萄酒香氣成分占總組分的44.15%、43.97%、3.45%。文獻[15]也應(yīng)用SPME對4種紅葡萄酒進行揮發(fā)性成分分析，在香氣成分的主要化合物類型組成上與上述結(jié)果十分相似，即酯類和醇類占比80%以上，其他類型化合物占比基本都低于5%。

從鑒定物質(zhì)種類及數(shù)量來看，3種萃取方法中的任何單獨一種都無法提取到表1中所列的所有化合物。這提示，全面地考察葡萄酒香氣化合物組成可能需要使用多萃取方法聯(lián)合分析。通過比較化合物種類發(fā)現(xiàn)，SDE提取到的化合物全都可以被LLE和SPME中的一種或兩種同時提取得到，在不考慮提取效率的情況下，LLE和SPME完全可以替代SDE的作用，甚至可以提取到更為豐富的化合物種類。LLE和SPME兩者比較，有31種化合物不能被兩種方法單獨使用時同時提取得到，占所有鑒定到的58種香氣物質(zhì)中的53.45%。這說明LLE和SPME具有很強的互補性。

3種萃取方法得到的提取物的主體化合物種類是一致的，都是酯類和醇類，兩者之和占比都在85%以上，決定了葡萄酒香氣的主體基調(diào)。酸類、酚類、醛類等非主體化合物在葡萄酒中含量雖少，但它們在決定葡萄酒的品質(zhì)和安全性方面也起著重要的作用。SDE對于相對稀有的化合物種類提取效率較低，所以葡萄酒香氣物質(zhì)提取建議采用LLE和SPME聯(lián)合萃取方法，充分利用兩者在提取效果方面的互補作用，從而更全面地評價葡萄酒香氣的性質(zhì)。LLE和SPME的互補作用可以由圖1來說明，兩者的提取差異主要在非主體化合物方面。LLE單獨提取到了酮類和其他類，而SPME單獨提取到了酚類和萜醇類，所以能夠明顯看出，兩者聯(lián)合使用可以大大提高香氣化合物的提取效率。

(a) 陳釀半年

(b) 陳釀一年半

2.2 葡萄酒香氣的有效成分分析

通過GC-MS分析，從3種提取物中共鑒定出58種香氣物質(zhì)，包括22種酯類、12種醇類、3種醛類、9種酸類、3種酮類、2種萜醇類、1種酚類和6種其他類物質(zhì)，詳細結(jié)果見表1。由表1可知：陳釀半年酒樣LLE所得提取物中鑒定出40種，SPME所得提取物中鑒定出41種，SDE所得提取物中鑒定出16種；陳釀一年半酒樣LLE所得提取物中鑒定出41種，SPME所得提取物中鑒定出41種，SDE所得提取物中鑒定出17種。從這3種提取方式獲得的物質(zhì)鑒定結(jié)果來看，陳釀半年和陳釀一年半的自釀葡萄酒在香氣成分的種類數(shù)量方面相差并不大。

2.2.1 酯類揮發(fā)性成分

酯類物質(zhì)是葡萄酒中組分最豐富及相對百分含量較多的重要成分，是使得葡萄酒風味濃郁的物質(zhì)基礎(chǔ)，由表1可知：酯類是葡萄酒最重要的香氣組成成分，3種方法下共鑒定出22種酯類物質(zhì)，乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁二酸二乙酯是最主要的酯類物質(zhì)，且酯類物質(zhì)在SPME提取物中鑒定出的種類最多，陳釀半年和陳釀一年半的葡萄酒在SPME提取物中鑒定出酯類物質(zhì)21種，相對百分含量分別為44.15%和57.33%；陳釀半年和陳釀一年半的葡萄酒在LLE提取物中鑒定出 15種，相對百分含量分別為19.06%和35.98%；陳釀半年和陳釀一年半的葡萄酒在SDE提取物中分別鑒定出5種和6種，相對百分含量分別為13.65%和16.86%。就酯類物質(zhì)而言，文獻[16-17]對紅葡萄酒中的揮發(fā)性成分分析顯示檢測到最多的香氣物質(zhì)是酯類和醇類。陳釀一年半的自釀葡萄酒的酯類物質(zhì)相對百分含量要高于陳釀半年的樣品，這可能是因為葡萄酒的陳釀生成酯類化合物較多，并且SPME能萃取到更多的物質(zhì)種類。

自釀葡萄酒檢測到的乙酸乙酯，在每種提取方法下各樣本中均為相對百分含量最高的酯類物質(zhì)，是自釀葡萄酒香氣的主要組成物質(zhì)；辛酸乙酯、癸酸乙酯僅在SPME方法檢測到，并且相對百分含量較高，這些酯因為自身具有的特殊香氣，能夠豐富葡萄酒的酒香。

2.2.2 醇類揮發(fā)性成分

由表1可知：醇類物質(zhì)是自釀葡萄酒的第2種主體香氣物質(zhì)，共有12種醇類物質(zhì)被鑒定出來，其中有11種屬于高級醇。高級醇一般會影響葡萄酒的口感協(xié)調(diào)性，其含量過少使風味寡淡，含量過高則增加苦澀感。LLE分離鑒別出醇類物質(zhì)10種；SDE分離鑒別出醇類物質(zhì)6種；SPME分離鑒別出醇類物質(zhì)8種。就醇類物質(zhì)而言，LLE較SPME和SDE能萃取到更多的物質(zhì)種類。

從陳釀一年半的酒樣對比可以看出，高級醇在陳釀過程中與有機酸緩慢酯化產(chǎn)生新物質(zhì)，降低了高級醇的含量。LLE方法提取到的醇類物質(zhì)種類高于SDE和SPME；3種方法提取到的醇類物質(zhì)種類有所不同，異戊醇、異丁醇、β-苯乙醇和2-甲基-丁醇等高級醇相對百分含量較高，在高級醇的組分中以異戊醇和β-苯乙醇對葡萄酒的風味影響最大[18]，并且陳釀半年酒樣中異戊醇在高級醇組成中高于陳釀一年半酒樣的相對百分含量。β-苯乙醇具有玫瑰香氣，有助于葡萄酒具有良好的感官特性，陳釀半年酒樣中β-苯乙醇的含量高于陳釀一年半酒樣的相對百分含量；另外，2-甲基丁醇和2,3-丁二醇均具有特殊香味，對葡萄酒風味形成也具有重要作用[19]。

2.2.3 萜類揮發(fā)性成分

萜類化合物僅有SPME提取檢測到兩個化合物—香茅醇和芳樟醇，兩者均具有花香味。萜類化合物在陳釀半年的自釀葡萄酒中的相對百分含量要高于陳釀一年半的樣品，由于檢測結(jié)果中也未發(fā)現(xiàn)其相關(guān)衍生物，推測萜類化合物在自釀葡萄酒陳釀的過程中發(fā)生了氧化降解。

2.2.4 醛酮酚類揮發(fā)性成分

醛和酮主要是由酸的脫羧和醇的氧化形成，3種萃取方法下共計鑒定出醛類物質(zhì)和酮類物質(zhì)各3種。在LLE、SDE和SPME的條件下，陳釀一年半的葡萄酒分離鑒別出的醛類物質(zhì)相對百分含量分別為0.66%、0.22%和0.37%，陳釀半年的葡萄酒分離鑒別出的醛類物質(zhì)相對百分含量分別為0.51%、0.14%和0.26%。在LLE和SDE的條件下，陳釀一年半的葡萄酒分離鑒別出的酮類物質(zhì)相對百分含量分別為0.56%和0.15%，陳釀半年的葡萄酒分離鑒別出的酮類物質(zhì)相對百分含量分別為0.44%和0.06%。由此可以看出：LLE較SPME和SDE能萃取到更高含量的醛類物質(zhì)和酮類物質(zhì)。酚類物質(zhì)相對百分含量由陳釀半年時的5.31%降到陳釀一年半時的1.29%，隨著陳釀時間的延長而下降[20]?？啡┦遣捎貌煌臋z測方法檢測到相對百分含量較高的醛類化合物，陳釀一年半自釀葡萄酒糠醛的相對百分含量高于陳釀半年糠醛相對百分含量，其變化可能與貯藏時間、環(huán)境等因素有關(guān)。一定劑量的糠醛被機體吸收后，會對肝臟、腎臟、心臟等器官產(chǎn)生不良影響[21]，因此自釀葡萄酒在長時間陳釀的過程中存在潛在的安全問題。

2.2.5 酸類揮發(fā)性成分

酸類物質(zhì)是構(gòu)成葡萄酒果香香氣的重要組成成分之一，共有9種酸被鑒別出，陳釀一年半的自釀葡萄酒采用LLE和SPME均鑒別出7種，相對百分含量分別為2.39%和2.68%；陳釀半年的自釀葡萄酒采用LLE和SPME分離鑒別出的相對百分含量分別為1.54%和3.45%；采用SDE沒有得到酸類成分。由此可以看出：LLE和SPME均能很好地提取到酸類物質(zhì)。己酸和辛酸是紅葡萄酒常見的脂肪酸，在自釀葡萄酒中也檢測到了這些化合物。通過兩個不同陳釀時間自釀葡萄酒的比較發(fā)現(xiàn)，酸類化合物盡管要參與酯類物質(zhì)生成而發(fā)生消耗，但其在香氣物質(zhì)總組成中所占比例并未發(fā)生太大變化；自釀葡萄酒發(fā)酵過程中需定時攪酒、倒桶、過濾，會使得乙醇部分揮發(fā)，生成的醋酸相對百分含量相應(yīng)下降，也促使自釀葡萄酒口感變好。

3 結(jié)論

(1)自釀葡萄酒香氣包含酯、醇、酸、醛、酮、酚、萜類等成分，其中，酯類與醇類物質(zhì)占比較大，這與紅葡萄酒揮發(fā)性成分分析相關(guān)報道類似。說明自釀葡萄酒中香氣成分種類豐富，具有較好的飲用品質(zhì)。

(2)就富集的自釀葡萄酒香氣成分的種類而言，SDE提取到的揮發(fā)性物質(zhì)種類最少，而LLE和SPME表現(xiàn)出很強的互補性，通過聯(lián)合這兩種方法對自釀葡萄酒香氣成分進行提取，相較于單一提取方法可以獲得更加全面的物質(zhì)種類，可為自釀葡萄酒的品質(zhì)評價提供更為充足的數(shù)據(jù)支持。

(3)自釀葡萄酒陳釀時間從半年到一年半，可以發(fā)現(xiàn)香氣成分種類和含量上明顯的差異和變化，其中包括糠醛等有害物質(zhì)相對百分含量升高，這提示自釀葡萄酒的飲用也需充分考慮適飲期和陳年能力。