王建柱，馬永剛，方 靜

（1.恒帆醫(yī)藥科技（泰州）有限公司；2.泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院；3.泰州市藥品檢驗(yàn)院，江蘇 泰州 225300）

滸苔Enteromorpha prolifera(Müller)J.Ag.又稱青苔，屬于綠（Chlorophyta）、綠藻綱（Chlorophyceae）、石莼目（Ulvales）、石莼科（Ulvaceae）、滸苔屬（Enteromorpha（Link）Ag.）。藻體管狀，膜質(zhì)，細(xì)胞單層，主枝明顯，分枝細(xì)長，可達(dá)2m。滸苔是我國海洋野生植物中極為豐富的大型經(jīng)濟(jì)綠藻類，它廣泛地分布于海洋沿岸中、低潮區(qū)的砂礫、巖石、灘涂和石沼中，尤其在東南沿海一帶分布廣泛。滸苔藻色鮮艷，味道鮮美，營養(yǎng)價(jià)值較高[1]，含有許多人體所必需的營養(yǎng)成份[2]，自古以來即分為食用和藥用藻類。在我國《食物營養(yǎng)成分表》上記載：滸苔含鐵量為我國食物中之最?！峨S息居飲食譜》記載：滸苔“清膽，消瘰癘癭瘤，泄脹、化痰，治水土不服”，《本草綱目》記載滸苔有“燒末吹鼻止衄血；湯浸搗敷手背腫痛”，滸苔對Ehrlich癌和皮膚癌有顯著的抑制活性[3]，據(jù)報(bào)道滸苔具有明顯的降低膽固醇、降血脂[4]和抗衰老作用。除食用及藥用外，滸苔還被廣泛地應(yīng)用于化工、紡織和國防工業(yè)。目前國內(nèi)外藻類學(xué)者對于綠藻的蛋白核研究并不多。該研究對于滸苔的光合作用、生活史的研究、滸苔抗腫瘤藥物研發(fā)等方面具有重要理論和實(shí)踐意義.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 滸苔取材 本實(shí)驗(yàn)的滸苔樣品均采自江蘇東臺紫菜育苗基地紫菜筏架。所取滸苔樣品裝于附有冰塊的漂沫保鮮盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。挑選新鮮、寬大藻體用無菌海水沖洗，去除表面雜藻和原生生物，在PES培養(yǎng)液中，15℃條件下培養(yǎng)，備用。

1.1.2 培養(yǎng)液與試劑 （1）試劑。江蘇啟東港附近黃海海域的海水經(jīng)沉淀、暗處理煮沸后備用；NaNO3；甘油；磷酸鈉；Fe；EDTA；硫酸素（Thiamine）；鈷胺素（VB12）；Tris；卡諾固定液I（甲醇：冰醋酸=3∶1）；卡諾固定液II（乙醇：冰醋酸=3:1）；鹽酸；蘇木精；二甲苯；三級水。

（2）培養(yǎng)液（見表1）。

表1 PES培養(yǎng)基母液

1.1.3 試驗(yàn)儀器 光照培養(yǎng)箱（HPG-280H人工氣候箱）、移液器（Finnpoipette Digital 1～5ml，200～1000μl，40～200μl）、pH計(jì)（METTLER TOLEDO實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)EL20）、鹽度計(jì)（VR-212 Salinity ATC 0～28%）、加熱器（HB-032金屬恒溫加熱器）、顯微鏡（Olympus BH-2顯微鏡）、相機(jī)（Olympus PM-C35DX）。高溫滅菌：錐形瓶（250 ml），蓋玻片，載玻片，毛筆，鑷子，手術(shù)剪刀，培養(yǎng)皿（直徑150mm），洗瓶，EP管，針。其他：酒精燈，牙簽，打火機(jī)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白核染色法 本實(shí)驗(yàn)采用蘇木精染色法[5]，此方法能使蛋白核的輪廓保持清晰，即使用它處理蛋白核類囊體數(shù)目多而不易分散的材料，也能得到較好的效果。

1.2.2 染色步驟 （1）材料培養(yǎng)：把材料培養(yǎng)到實(shí)驗(yàn)所需標(biāo)準(zhǔn)：藻體新鮮、寬大、無菌、無氣泡、表面無雜藻和原生生物。（2）取材：進(jìn)行24小時(shí)連續(xù)取材，每小時(shí)取材1次。（3）材料固定：用滲透力強(qiáng)的固定液將材料迅速殺死，使蛋白質(zhì)沉淀并盡量使其保持原有狀態(tài)。（4）光照處理：經(jīng)自然光照射可以加速滸苔色素的降解。（5）材料解離：藻類細(xì)胞有細(xì)胞壁，主要成分是果膠和纖維素；胞間層含有大量果膠，這將導(dǎo)致壓片很難達(dá)到理想的解離效果。經(jīng)過稀鹽酸解離，細(xì)胞之間的果膠層被破壞，細(xì)胞壁得到軟化，使壓片能夠取得良好效果，便于染色。（6）材料染色：指用顏料對材料進(jìn)行處理，以便觀察和分析。本實(shí)驗(yàn)采用蘇木精作為染料。（7）分色：醋酸可以使被染色的滸苔分色和軟化。（8）壓片：分涂片和常規(guī)壓片。（9）鏡檢與拍照：在顯微鏡下尋找典型的滸苔蛋白核和類囊體，記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，保存試驗(yàn)成果。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)過程 （1）材料培養(yǎng)：用毛筆刷去滸苔表面的雜質(zhì)，先用淡水沖洗然后再用消毒海水反復(fù)沖洗，把表面干凈的滸苔樣品放在合適的培養(yǎng)環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。注：培養(yǎng)環(huán)境：溫度（15℃），鹽度（2.4），光照（4500lx），pH（7.8）。（2）取材：在滸苔生長旺盛期進(jìn)行24小時(shí)取材，每小時(shí)取材1次。將所取樣品裝于已編號的1.5mlEP管內(nèi)，加固定液1ml。（3）材料固定：用固定液I（甲醇：冰醋酸=3:1）固定所取樣品，將材料迅速殺死，分解色素體，破滅熒光物質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀并盡量使其保持原有狀態(tài)，以達(dá)到觀察所需要求。一般固定24小時(shí)以上，經(jīng)常加換固定液。（4）光照：通過光照的方法加速滸苔色素體的解離。（5）材料解離：用鑷子將固定沖洗后的材料置于裝有1mol/L鹽酸的1.5ml已編號的EP管中，在60℃下解離2小時(shí)。（6）材料染色：用鑷子將解離沖洗后的材料置于5%蘇木精溶液中染色24小時(shí)以上。（7）分色：用鑷子將染色沖洗好的材料移入45%的醋酸內(nèi)進(jìn)行分色和軟化12小時(shí)以上。（8）壓片：將材料放在預(yù)先用酒精浸泡并冷凍的清潔載玻片上，加1滴甘油冰醋酸混合液（1:1），然后用鑷子迅速將材料夾到甘油冰醋酸混合液中，再用針剔去滸苔組織的部分細(xì)胞，以達(dá)到分散細(xì)胞便于觀察的目的，最后蓋上蓋玻片進(jìn)行壓片。（9）鏡檢與拍照；將做好的滸苔片子放在Olympus BH-2顯微鏡下進(jìn)行觀察，先用低倍鏡尋找滸苔細(xì)胞，然后用油鏡觀察滸苔細(xì)胞，尋找典型的蛋白核和類囊體，最后用Olympus PMC35DX相機(jī)進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

大多數(shù)種類的綠藻，細(xì)胞內(nèi)含有一個(gè)細(xì)胞核，通常位于細(xì)胞邊緣。滸苔細(xì)胞的色素體存在于載色體中，綠藻載色體和高等植物的葉綠體一樣，有光合作用片層。載色體所含的色素也和高等植物基本相同，在載色體內(nèi)通常還有一至數(shù)枚蛋白核，每個(gè)蛋白核內(nèi)有一至數(shù)枚類囊體（如圖1）。在葉綠體基質(zhì)中，有許多由單位膜封閉形成的扁平小囊狀的類囊體，類囊體內(nèi)的色素以及中央大液泡對滸苔蛋白核的觀察產(chǎn)生很大干擾（圖1～6所示）。

圖1 滸苔蛋白核中類囊體的形式 (比例尺=10μm)

滸苔藻體綠色，中空成管狀。實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)滸苔生長旺盛時(shí)，藻體內(nèi)會有氣泡，滸苔會浮在培養(yǎng)液中。本實(shí)驗(yàn)在滸苔生長旺盛期進(jìn)行24小時(shí)取材，每小時(shí)取材1次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在暗周期開始后2～3h固定效果更好。這可能與滸苔在暗周期下不進(jìn)行光合作用，相關(guān)酶的活性較低有關(guān)。

為了破壞色素體，本實(shí)驗(yàn)延長了固定時(shí)間，經(jīng)常更換固定液，同時(shí)進(jìn)行24小時(shí)光照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)固定和光照時(shí)間在24小時(shí)以上時(shí)，滸苔細(xì)胞被殺死，色素大量溶于固定液中。因?yàn)樯氐谋举|(zhì)是蛋白質(zhì)，固定液I（甲醇：冰醋酸=3:1）滲透力很強(qiáng)，能將材料迅速殺死，使蛋白質(zhì)沉淀并盡量使其保持原有狀態(tài)，而且材料死亡后，細(xì)胞內(nèi)的色素見光極易分解，從而達(dá)到較好的染色效果，以利于觀察。

植物材料一般在1mol/L的鹽酸中60℃下解離10～20分鐘。但是本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：滸苔在60℃下酸解2小時(shí)以上時(shí)效果更好。在不加熱情況下，可以把解離時(shí)間延長到24小時(shí)以上。

本實(shí)驗(yàn)中材料的染色是重點(diǎn)內(nèi)容，本實(shí)驗(yàn)采用蘇木精染色法，此方法能使染色體的輪廓保持清晰，即使用它處理蛋白核多而不易分散的材料，也能得到較好的拍照效果，利于標(biāo)本長期保存。

當(dāng)染色時(shí)間過長時(shí)，可以用45%的醋酸進(jìn)行分色，一般染色的時(shí)間與分色的時(shí)間成正比。常規(guī)壓片經(jīng)常會產(chǎn)生氣泡，在壓片時(shí)點(diǎn)一滴油冰醋酸混合物（甘油∶冰醋酸=1:1）即可解決。

3 問題與討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：蛋白核中類囊體數(shù)目n=1～4，類囊體的形態(tài)有“C”形（圖1-3箭頭2所示）、“U”形（圖1-4箭頭所示）、“S”形（圖1-5箭頭2、3所示）、“V”形（圖1-6箭頭所示）。Kapraun等認(rèn)為Enteromorpha prolifera的染色體數(shù)為n=10，2n=20。但我們在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)滸苔的染色體數(shù)目n=6～10，因此我認(rèn)為滸苔可能是二倍體[6]。

滸苔細(xì)胞的細(xì)胞壁分兩層，內(nèi)層主要成分是纖維素，外層是果膠。這給材料的解離軟化帶來不便，本實(shí)驗(yàn)通過延長解離時(shí)間達(dá)到較好的解離效果，但是當(dāng)時(shí)間過長時(shí)細(xì)胞會出現(xiàn)裂解現(xiàn)象。

滸苔屬于低等植物，大量的色素體對實(shí)驗(yàn)的觀察干擾很大。為了破壞色素體，本實(shí)驗(yàn)延長了固定時(shí)間，經(jīng)常更換固定液，并進(jìn)行24小時(shí)不間斷光照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：固定可迅速殺死滸苔細(xì)胞，且當(dāng)固定和光照時(shí)間分別在24小時(shí)以上時(shí)，色素大量溶于固定液中。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)固定液I（甲醇∶冰醋酸=3∶1）對滸苔的固定效果比固定液II（乙醇∶冰醋酸=3∶1）的固定效果好；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，材料預(yù)處理時(shí)，秋水仙素的使用對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不明顯。

材料的染色是本次實(shí)驗(yàn)的又一大研究重點(diǎn)。有文獻(xiàn)提到了鐵礬—蘇木精染色法，但是本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：鐵礬對滸苔染色體媒染效果影響不大，當(dāng)染色時(shí)間超過24小時(shí)，滸苔染色體觀察的效果較好。隨著染色時(shí)間的增加，醋酸分色的時(shí)間也應(yīng)相應(yīng)延長。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：材料染色24小時(shí)以上時(shí)，醋酸分色在12小時(shí)左右為宜。在滸苔染色實(shí)驗(yàn)中蘇木精的染色效果比苯酚品紅好。

由于時(shí)間有限，我們只發(fā)現(xiàn)了已被染色的染色體在細(xì)胞邊緣的黑點(diǎn)，這對于滸苔核型分析研究具有實(shí)踐意義。在實(shí)驗(yàn)中還遇到了一些其他問題如：在蛋白核周圍也存在一些類似染色體的黑點(diǎn)、整個(gè)細(xì)胞中均勻地分散著黑點(diǎn)，黑點(diǎn)數(shù)量超過20個(gè)[6]。這些問題有待于進(jìn)一步探討。