晶狀體發(fā)育過程中細(xì)胞器降解及其機(jī)制的研究現(xiàn)狀

馬婧宇 綜述 李金燕，陳奕嘉，歐陽帥，羅莉霞 審校

(中山大學(xué)中山眼科中心，眼科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省眼科視覺科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510060)

白內(nèi)障是世界首位的致盲眼病[1]，其最基本的病理變化為高分子量(high-molecular weight，HMW)蛋白聚集或晶狀體微結(jié)構(gòu)破壞，可由異常的晶狀體發(fā)育分化過程導(dǎo)致，而參與這些過程的基因突變引致嚴(yán)重蛋白損害會(huì)導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的發(fā)生，基因突變或環(huán)境因素引致較溫和的蛋白損害則與年齡相關(guān)性白內(nèi)障有關(guān)[2]。晶狀體細(xì)胞器降解過程是貫穿晶狀體整個(gè)生命周期的重要生理過程，該過程的異?？蓪?dǎo)致晶狀體微結(jié)構(gòu)破壞，與先天性及年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生均密切相關(guān)。探索晶狀體細(xì)胞器降解的機(jī)制，以期為白內(nèi)障的干預(yù)提供理論基礎(chǔ)。

脊椎動(dòng)物成熟的晶狀體無血管，由單層的晶狀體上皮細(xì)胞、伸長(zhǎng)的晶狀體纖維細(xì)胞及包繞在其周圍的晶狀體囊構(gòu)成[3]，屈光和調(diào)節(jié)是晶狀體的生理功能[4]，透明性是其生理功能的基礎(chǔ)。在物理學(xué)上，生物組織維持透明需要最大程度減少光的散射，而光散射主要取決于光程長(zhǎng)度及細(xì)胞器[5]。晶狀體的組織特性可最大程度減少光散射，其中最重要的即為晶狀體纖維細(xì)胞在在終末分化過程中發(fā)生的細(xì)胞器降解，使位于中央的纖維細(xì)胞形成無細(xì)胞器區(qū)(organelle-free zone，OFZ)；而單層的晶狀體上皮細(xì)胞由于光程太短，其對(duì)光的散射可忽略不計(jì)。因此，正常的晶狀體細(xì)胞器降解過程是保證其透明性的一個(gè)關(guān)鍵步驟，異常的細(xì)胞器降解可使其微結(jié)構(gòu)破壞，光散射增加，導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生。

1 晶狀體的發(fā)生及纖維細(xì)胞的分化

脊椎動(dòng)物晶狀體胚胎發(fā)育起源于前神經(jīng)板表面外胚層[6]。晶狀體的發(fā)生是由于表面外胚層接受到了來自視泡和眼周間質(zhì)信號(hào)的刺激[7]。形態(tài)學(xué)上，當(dāng)間腦前部?jī)蓚?cè)膨出形成視泡后，其與表面外胚層接觸，誘導(dǎo)表面外胚層形成晶狀體基板；而后，晶狀體基板逐漸向內(nèi)凹陷形成晶狀體小凹；隨著凹陷的加深，晶狀體小凹脫離表面外胚層，形成近球形中空的晶狀體泡[8]。

晶狀體泡由單層上皮細(xì)胞構(gòu)成，位于后部的上皮細(xì)胞向前延伸為初級(jí)晶狀體纖維并逐漸填滿空腔[8]。在初級(jí)纖維細(xì)胞延伸的過程中，其細(xì)胞器發(fā)生降解[6]。晶狀體泡的前部細(xì)胞始終保持上皮樣，其子細(xì)胞遷移到晶狀體的赤道區(qū)，延伸并分化為次級(jí)晶狀體纖維。整個(gè)生命過程中，新的纖維細(xì)胞不斷地包裹到晶狀體表面，形成外周同心層的皮質(zhì)[9]，在一定的信號(hào)刺激下次級(jí)纖維細(xì)胞的細(xì)胞器也不斷發(fā)生降解。由此可見，細(xì)胞器降解分別發(fā)生于晶狀體初級(jí)和次級(jí)纖維細(xì)胞的分化過程中。有研究[10]發(fā)現(xiàn)：初級(jí)纖維細(xì)胞中細(xì)胞器的降解同時(shí)發(fā)生在一簇細(xì)胞，而次級(jí)纖維細(xì)胞中細(xì)胞器降解是一個(gè)接一個(gè)細(xì)胞發(fā)生的，這提示初級(jí)纖維細(xì)胞和次級(jí)纖維細(xì)胞的降解過程存在不同。

晶狀體纖維分化包括細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞伸長(zhǎng)、晶狀體蛋白的積累、晶狀體細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生以及細(xì)胞器的降解[11]，在細(xì)胞器降解之后，處于OFZ的纖維細(xì)胞實(shí)質(zhì)上相當(dāng)于包裹晶狀體蛋白的囊袋。

2 晶狀體細(xì)胞器降解的過程

晶狀體細(xì)胞器降解是指在纖維細(xì)胞分化成熟中，細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體等膜性細(xì)胞器降解形成OFZ的過程(圖1)。

圖1 示意圖：晶狀體細(xì)胞器降解及OFZ的形成Figure 1 Organelle degradation and formation of OFZ in lens

2.1 細(xì)胞器降解發(fā)生的時(shí)間及部位

晶狀體初級(jí)纖維細(xì)胞的細(xì)胞器降解發(fā)生在胚胎期，在不同物種中發(fā)生時(shí)間略有差異。在雞晶狀體胚胎期第8天，纖維細(xì)胞中的線粒體從最內(nèi)層開始解體，同時(shí)細(xì)胞核也開始變??；在第12天，晶狀體中央細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞核已經(jīng)消失[12]。而在小鼠中，晶狀體細(xì)胞器降解開始發(fā)生在胚胎期的16.5～18.5 d之間[10]。在人晶狀體中，初級(jí)纖維的細(xì)胞器降解發(fā)生于胎兒早期；在其他哺乳動(dòng)物中，該過程大多發(fā)生在妊娠晚期[10]。晶狀體次級(jí)纖維的細(xì)胞器降解也始于胚胎期，并貫穿于整個(gè)生命周期。

晶狀體初級(jí)纖維和次級(jí)纖維中細(xì)胞器降解發(fā)生在不同部位。OFZ最初只是由初級(jí)纖維細(xì)胞構(gòu)成，隨著發(fā)育的進(jìn)展，逐漸擴(kuò)大到越來越多的次級(jí)纖維細(xì)胞[3]。新的次級(jí)纖維細(xì)胞不斷包裹在晶狀體外層，在到達(dá)晶狀體皮質(zhì)相當(dāng)于虹膜緣的位置時(shí)，其細(xì)胞器開始發(fā)生降解[12]。最終位于視軸上的纖維細(xì)胞都經(jīng)歷了細(xì)胞器降解過程，形成了晶狀體的OFZ。不同的細(xì)胞器發(fā)生降解的部位也有所不同，高爾基體在晶狀體纖維分化早期解體，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞核都是在OFZ邊緣發(fā)生降解[13]。

2.2 細(xì)胞器降解的觸發(fā)因素

次級(jí)晶狀體纖維細(xì)胞到達(dá)皮質(zhì)區(qū)的一定深度觸發(fā)細(xì)胞器降解，但具體因素仍不明確。有研究[14]表明：晶狀體內(nèi)的低氧環(huán)境可能是細(xì)胞器降解的一個(gè)觸發(fā)因素。由于成熟晶狀體缺乏血液供應(yīng)，處于低氧環(huán)境，房水中的氧氣被動(dòng)擴(kuò)散，從而導(dǎo)致晶狀體內(nèi)形成從表面到核心逐漸下降的氧氣濃度梯度。此外，Brennan等[15]在雞晶狀體外植體中發(fā)現(xiàn)低氧可使HIF1a(hypoxia-induciblefactor 1a)表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而通過影響B(tài)NIP3L(BCL2 interacting protein 3-like)的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控晶狀體纖維細(xì)胞非核細(xì)胞器降解。在低氧環(huán)境下，除了HIF1a表達(dá)上調(diào)，未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)也會(huì)被激活，Yang等[16-17]在年齡相關(guān)性、高度近視并發(fā)核性白內(nèi)障及先天性白內(nèi)障患者的晶狀體中發(fā)現(xiàn)UPR的激活，但UPR是否參與細(xì)胞器降解還有待進(jìn)一步研究。除了低氧環(huán)境的影響，有學(xué)者認(rèn)為晶狀體中離子的梯度分布可能與細(xì)胞器降解有關(guān)，已有研究[18]證明水通道蛋白AQP0-/-(Aquaporin 0)小鼠，由于影響晶狀體中鈣離子及其他反射介質(zhì)的梯度分布，破壞了晶狀體內(nèi)穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生。除了氧氣和Ca2+外，成熟晶狀體中可擴(kuò)散性的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物在晶狀體內(nèi)也是呈梯度分布的，如pH、乳酸等[19]。但這些物質(zhì)的不均勻分布是否參與了晶狀體細(xì)胞器降解也有待進(jìn)一步探索。

2.3 細(xì)胞器降解過程中細(xì)胞器的形態(tài)學(xué)變化

晶狀體細(xì)胞器的降解過程中，首先發(fā)生形狀改變的是細(xì)胞核，由“卵狀”變成“球形”[20]，在這個(gè)過程中DNA逐漸在核的邊緣固縮，在核膜上出現(xiàn)小孔，核固縮伴隨著核蛋白，包括組蛋白和非組蛋白，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，而絲狀細(xì)胞質(zhì)組分，如CP49進(jìn)入核內(nèi)[21]，隨著染色質(zhì)的不斷濃縮，核逐漸減小，之后解體為多個(gè)凋亡樣顆粒[20]。相比于細(xì)胞核降解，線粒體降解要迅速很多，在OFZ邊緣的纖維細(xì)胞中，線粒體變得腫脹、片段化并失去其功能[12]。上述形態(tài)學(xué)變化在不同物種中是類似的。但染色質(zhì)變化存在種屬差異[5]，比如在雞晶狀體核降解過程中有染色質(zhì)邊緣化，而在鼠中該現(xiàn)象不明顯[21]。最近，Costello等[22]用高分辨率共聚焦光學(xué)顯微鏡和透射電鏡(TEM)對(duì)第12～15天的雞胚晶狀體進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在發(fā)生細(xì)胞器降解的細(xì)胞中存在一種特殊的結(jié)構(gòu)，稱為核外切體(excisosome)，由鄰近纖維細(xì)胞產(chǎn)生，參與細(xì)胞核的降解。

2.4 細(xì)胞核降解過程中胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性的變化

晶狀體纖維細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性隨核降解過程的進(jìn)行而發(fā)生變化。纖維細(xì)胞去核開始后，調(diào)控細(xì)胞器降解的相關(guān)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄；隨著降解過程的進(jìn)行，細(xì)胞核高度固縮，轉(zhuǎn)錄活性降低，但仍可觀察到纖維細(xì)胞內(nèi)特定基因的表達(dá)[20]；最終在核膜重塑和核解體之間的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄停止[5]。在核降解過程中轉(zhuǎn)錄活性逐漸降低，而成熟晶狀體纖維細(xì)胞中富含晶狀體蛋白，因此纖維細(xì)胞內(nèi)一定存在某種機(jī)制，使晶狀體蛋白即使在轉(zhuǎn)錄活性逐漸降低的情況下，也能維持較高的表達(dá)。最近，Shao等[23]在斑馬魚中揭示了RNA結(jié)合蛋白R(shí)bm24可以通過調(diào)節(jié)晶狀體蛋白mRNA的poly(A)尾的長(zhǎng)度使其在胞質(zhì)中維持一定的穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)控晶狀體蛋白的翻譯效率。晶狀體纖維細(xì)胞核降解后雖失去轉(zhuǎn)錄活性，但細(xì)胞中還殘存有RNA。至于這些殘存的RNA是否還能翻譯，F(xiàn)aulkner-Jones等[24]研究發(fā)現(xiàn)在雞晶狀體纖維細(xì)胞核降解后，現(xiàn)存的RNA在纖維細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中迅速衰變，核糖體RNA消失的半衰期估計(jì)為2.5 d；編碼管家基因如GAPDH的mRNA的半衰期為3～4 d；而晶狀體蛋白的mRNA在核降解數(shù)周后還可以檢測(cè)到，并能維持一段時(shí)間的翻譯活性，當(dāng)翻譯所需的元件都被降解后，晶狀體蛋白的產(chǎn)生也隨即停止。這提示在細(xì)胞核降解后，其RNA及蛋白合成都在一段時(shí)間后停止，因此纖維細(xì)胞在核降解之前就完成了絕大部分晶狀體蛋白的合成。

3 晶狀體細(xì)胞器降解的機(jī)制

晶狀體纖維細(xì)胞分化及細(xì)胞器降解的過程復(fù)雜，涉及多個(gè)并行和冗余的路徑，并形成相互作用的網(wǎng)絡(luò)。目前關(guān)于晶狀體細(xì)胞器降解機(jī)制主要有以下幾種學(xué)說：細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡和泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)等。

3.1 細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬是廣泛存在于各種細(xì)胞內(nèi)的溶酶體降解系統(tǒng)，通過清除細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)以及衰老的細(xì)胞器，以維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[25]。除了非選擇性自噬，大多數(shù)生物體還存在選擇性自噬，即通過自噬的方式選擇性降解某類大分子或細(xì)胞器，其異常與多種疾病發(fā)生有關(guān)。線粒體自噬即為一種選擇性自噬，是細(xì)胞內(nèi)線粒體質(zhì)量控制的核心機(jī)制[26]。自噬的發(fā)生由自噬溶酶體介導(dǎo)，在自噬啟動(dòng)后，隔離膜(isolation membrane)包住一部分細(xì)胞質(zhì)形成雙膜結(jié)合的自噬體[27]，自噬體隨后與溶酶體融合成為自噬溶酶體，在這個(gè)結(jié)構(gòu)中，細(xì)胞質(zhì)來源的內(nèi)容物被溶酶體水解酶降解。自噬相關(guān)蛋白5(autophagy-related 5，ATG5)是參與自噬溶酶體形成所必需的蛋白[28]。

為研究自噬在細(xì)胞器降解過程中的作用機(jī)制，Matsui等[29]發(fā)現(xiàn)敲除小鼠Atg5后，不會(huì)影響其胚胎期晶狀體細(xì)胞器降解的正常發(fā)生。但Atg5-/-小鼠在出生后不久則死亡[30]，無法研究成體晶狀體中自噬的作用機(jī)制。隨后，Morishita等[31]特異性敲除小鼠晶狀體Atg5基因后，發(fā)現(xiàn)成體和胚胎期小鼠的晶狀體細(xì)胞器降解均不受影響。雖然ATG5是參與自噬發(fā)生的關(guān)鍵蛋白，但也有報(bào)道[32]稱“替代性自噬”(alternative autophagy)不依賴于ATG5，可由依托泊苷或星孢素誘導(dǎo)產(chǎn)生。這類自噬需要FIP200、Ulk1、Beclin 1和Pik3c3等因子的參與，為了研究替代性性自噬在晶狀體細(xì)胞器降解中的可能作用，Morishita等[31]也對(duì)小鼠晶狀體的Pik3c3基因進(jìn)行了特異性敲除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：其晶狀體細(xì)胞器在胚胎期也正常降解。以上結(jié)果均表明自噬對(duì)晶狀體細(xì)胞器降解沒有直接作用。然而，持續(xù)觀察晶狀體特異性Atg5敲除的小鼠，發(fā)現(xiàn)在21個(gè)月時(shí)所有的小鼠都出現(xiàn)了嚴(yán)重的雙側(cè)皮質(zhì)或全白內(nèi)障，伴隨多泛素化蛋白、氧化蛋白p62和不溶性晶狀體蛋白的累積[31]，提示自噬對(duì)整個(gè)晶狀體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持起關(guān)鍵作用。

以上結(jié)果雖表明細(xì)胞自噬不影響晶狀體細(xì)胞器的降解，但也有研究提示線粒體和細(xì)胞核可能是通過自噬的方式發(fā)生降解的。Joseph等[33]通過電鏡及雙標(biāo)記共聚焦成像觀察到在人和雞胚胎晶狀體上皮細(xì)胞、未成熟的纖維細(xì)胞中及早期分化的纖維細(xì)胞都有包含線粒體的自噬泡存在；在雞原代晶狀體上皮細(xì)胞中通過血清饑餓處理誘導(dǎo)了線粒體自噬的發(fā)生，提示自噬至少是晶狀體細(xì)胞降解線粒體的一種方式。DNase IIβ (DNase II-like acid DNase，DLAD)在晶狀體細(xì)胞器降解過程中通過類似于自噬的途徑發(fā)揮作用，DNase IIβ是一種在晶狀體中顯著表達(dá)的DNA酶[34]，也被證明是一種溶酶體酶[35]。研究表明DNase IIβ在晶狀體去核中起關(guān)鍵作用。Nishimoto等[34]構(gòu)建了DLAD-/-小鼠，發(fā)現(xiàn)由于中央纖維細(xì)胞中未消化的DNA異常保留而導(dǎo)致核性白內(nèi)障。Cui等[36]發(fā)現(xiàn)在斑馬魚中熱休克轉(zhuǎn)錄因子4(heat shock transcription factor 4，HSF4)通過直接與DNase IIβ啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)DNase IIβ的表達(dá)；而HSF4突變可使DNase IIβ活性降低，從而使晶狀體不完全去核[37]。此外，在小鼠晶狀體纖維細(xì)胞中觀察到DNase IIβ與溶酶體相關(guān)膜蛋白-1(lysosome-associated membrane protein，LAMP-1)共定位，在OFZ區(qū)邊緣細(xì)胞中觀察到了含DNase IIβ的溶酶體[38]。因此，DNase IIβ對(duì)核DNA的作用很可能類似于自噬溶酶體的形成，即通過含有DNase IIβ的溶酶體與核膜融合而發(fā)揮降解作用[5]。

同時(shí)，也有研究[39]發(fā)現(xiàn)FYCO1(FYVE and coiled-coil domain containing 1)基因突變可導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的發(fā)生，而FYCO1是一種自噬相關(guān)蛋白(autophagy adaptor protein)，可與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B (MAP1LC3B)、磷酸磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P)及RAB7相互作用介導(dǎo)自噬體的定向運(yùn)動(dòng)[40]，Pankiv等[41]報(bào)道，F(xiàn)YCO1突變可導(dǎo)致殘余自噬體在核周積累。因此推測(cè)FYCO1基因突變后自噬體累積，從而使蛋白聚集體形成或細(xì)胞器無法正常降解，進(jìn)而導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的發(fā)生。

總之，目前可以明確自噬參與晶狀體細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持，但是自噬是否參與了晶狀體細(xì)胞器降解過程還需進(jìn)一步研究。

3.2 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，在各種生物過程中起關(guān)鍵作用[42]，其過程伴隨DNA片段化、染色質(zhì)濃縮、核膜裂解及線粒體腫脹等形態(tài)學(xué)變化[43]。這與晶狀體細(xì)胞器降解過程的形態(tài)學(xué)變化有相似之處，且纖維細(xì)胞表達(dá)了細(xì)胞凋亡所需的大部分調(diào)節(jié)因子[44-45]，提示細(xì)胞凋亡參與了細(xì)胞器降解。

p53是參與細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[46]。Deng等[47]發(fā)現(xiàn)在bFGF誘導(dǎo)的晶狀體細(xì)胞體外分化過程中，p53或Bak的敲低導(dǎo)致晶狀體細(xì)胞分化受到顯著抑制，證實(shí)了p53-Bak凋亡信號(hào)通路在晶狀體發(fā)育分化中起重要作用。Reichel等[48]發(fā)現(xiàn)p53敲除后的小鼠發(fā)生白內(nèi)障。Gao等[45]建立了斑馬魚HSF4突變體，在HSF4敲除后p53的活性下調(diào)，同時(shí)，p53下游的Fas和Bax基因表達(dá)也下調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡通路活性降低，引起晶狀體細(xì)胞器的不完全降解；進(jìn)一步在HSF4突變體中通過顯微注射p53、Fas和Bax mRNA，發(fā)現(xiàn)可以部分挽救細(xì)胞器降解缺陷，證明了p53及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡促進(jìn)了晶狀體細(xì)胞器降解。

Bcl-2家族也是細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子，其既具有抗凋亡活性(Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w及Mcl-1等)，也具有促凋亡活性(Bax、Bak、Bcl-xs及Bad等)，處于Caspase蛋白酶家族上游[49]。為了研究晶狀體細(xì)胞器降解中是否有Bcl-2家族的參與，Sanders等[44]在雞胚胎晶狀體過表達(dá)Bcl-2，發(fā)現(xiàn)其導(dǎo)致晶狀體纖維細(xì)胞排列紊亂、去核障礙及白內(nèi)障形成；在小鼠中過表達(dá)Bcl-2后，也發(fā)現(xiàn)了類似的對(duì)細(xì)胞器降解的抑制作用[50]。也有研究[44]發(fā)現(xiàn)在雞晶狀體次級(jí)纖維細(xì)胞去核的過程中Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)增加。Brennan等[51]在小鼠中發(fā)現(xiàn)，Bcl-2家族蛋白BNIP3L在晶狀體纖維細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的降解中發(fā)揮重要作用。

Caspase蛋白酶家族是細(xì)胞凋亡的效應(yīng)因子，細(xì)胞凋亡不論是由外部或內(nèi)部信號(hào)觸發(fā)，凋亡通路最終都集中于Caspase蛋白酶家族。在受到相應(yīng)的信號(hào)刺激后，Caspases從無活性的前體被剪切為有活性的成熟體，Caspase-2、-8和-9通常處于效應(yīng)分子Caspase-3、-6和-7的上游[52]。研究表明，Caspase蛋白酶家族在晶狀體中有表達(dá)，Wride等[53]利用雞胚胎晶狀體，發(fā)現(xiàn)Caspase-1、-2、-4、-6和-9抑制劑均能顯著降低晶狀體中TUNEL標(biāo)記的程度，提示這些Caspase均在雞胚晶狀體纖維細(xì)胞去核過程中發(fā)揮作用。

上述研究表明細(xì)胞凋亡相關(guān)因子參與了晶狀體細(xì)胞器降解，但與細(xì)胞凋亡不同的是，細(xì)胞器降解的纖維細(xì)胞并未表現(xiàn)出細(xì)胞骨架破裂、凋亡小體形成等結(jié)果。針對(duì)這一問題，有人提出晶狀體細(xì)胞中可能存在抗凋亡系統(tǒng)，可以減弱細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。Christopher等[54]及Kamradt等[55]分別在人晶狀體上皮細(xì)胞及成肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)αB-晶狀體蛋白具有抗凋亡功能。Wang等[56]利用大鼠晶狀體外植體及小鼠晶狀體上皮細(xì)胞證明了過表達(dá)αB-晶狀體蛋白可抵抗由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此有研究[57]提出：晶狀體纖維細(xì)胞因富含αB-晶狀體蛋白，減弱了細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而僅表現(xiàn)為細(xì)胞器降解。

總之，細(xì)胞凋亡的組分參與了晶狀體細(xì)胞器降解，但晶狀體中可能也存一些類似于αB-晶狀體蛋白的抗凋亡因子，使晶狀體細(xì)胞器降解與細(xì)胞凋亡的機(jī)制有所不同[58]。

3.3 泛素-蛋白酶體途徑(UPP)

UPP是細(xì)胞中主要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，泛素化修飾后的蛋白質(zhì)被蛋白酶體特異性識(shí)別和降解，在細(xì)胞發(fā)育、免疫反應(yīng)和程序性細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用[59]。

晶狀體中存在UPP的全部組分[60]，泛素激活酶、泛素結(jié)合酶、19S和20S蛋白酶體亞基等UPP核心組分存在于整個(gè)晶狀體纖維中[61]。Shang等[62]發(fā)現(xiàn)泛素依賴通路在晶狀體細(xì)胞分化過程中上調(diào)。Guo等[60]在晶狀體上皮細(xì)胞外植體中發(fā)現(xiàn)晶狀體細(xì)胞增殖和分化需要泛素-蛋白酶體途徑參與。已有研究[63]證明在晶狀體纖維細(xì)胞分化晚期UPP的核心成分重新分布進(jìn)入細(xì)胞核，這提示UPP可能在細(xì)胞核降解中發(fā)揮一定作用。隨后，Zandy等[64]在發(fā)育中的雞晶狀體通過玻璃體注射乳胞素以抑制UPP途徑，發(fā)現(xiàn)其阻止了晶狀體纖維細(xì)胞中一種線粒體內(nèi)膜蛋白(琥珀酸泛醌氧化還原酶)的降解，這是第一個(gè)表明UPP參與晶狀體細(xì)胞器降解過程的證據(jù)。Caceres等[65]發(fā)現(xiàn)K6W-泛素可以與底物有效地結(jié)合，但底物不能通過UPP降解，這相當(dāng)于抑制了泛素的功能，通過在小鼠晶狀體細(xì)胞中表達(dá)K6W-泛素后，發(fā)現(xiàn)晶狀體特異性蛋白的表達(dá)下調(diào)、上皮細(xì)胞向纖維的分化減慢及纖維細(xì)胞去核障礙。這些結(jié)果均表明UPP途徑參與了晶狀體細(xì)胞器降解過程。

3.4 其他

晶狀體細(xì)胞器降解過程還有炎癥因子、生物電信號(hào)、RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein)等其他因素的參與，Wride等[66]發(fā)現(xiàn)雞的晶狀體纖維細(xì)胞表達(dá)TNFα及TNF受體，提出炎癥因子在誘發(fā)細(xì)胞器降解過程中可能起重要作用；Cao等[67]研究了哺乳動(dòng)物晶狀體赤道部Na+/K+泵電流產(chǎn)生的生物電信號(hào)，發(fā)現(xiàn)超極化膜電位差(Vmem)的去極化可以激活晶狀體纖維細(xì)胞去核；RNA結(jié)合蛋白主要介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，Siddam等[68]發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白Celf1可以通過調(diào)控p27和DNase IIβ的翻譯，進(jìn)而影響晶狀體細(xì)胞器降解，其他RNA結(jié)合蛋白，如Tdrd7、Rbm及Caprin2等也參與晶狀體的發(fā)育過程，但是否參與細(xì)胞器降解還需進(jìn)一步研究。

此外，其他多種信號(hào)通路和分子也參與細(xì)胞器降解的發(fā)生，Subhasre等[69]發(fā)現(xiàn)在雞胚胎晶狀體體外培養(yǎng)和分化系統(tǒng)中，化學(xué)抑制MAPK/JNK和mTORC1可導(dǎo)致細(xì)胞器降解提前發(fā)生；Rowan及Lyu等[35,70]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控因子p27的異常累積也可導(dǎo)致去核障礙；He等[71]發(fā)現(xiàn)Hippo通路的下游效應(yīng)分子Yap在晶狀體上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，而在小鼠中條件性敲除Yap可使上皮細(xì)胞減少及纖維細(xì)胞去核障礙。另外，最近的研究[72]揭示了PLAAT家族磷脂酶是參與晶狀體細(xì)胞器降解的關(guān)鍵分子，在細(xì)胞器降解過程中移位至細(xì)胞器膜介導(dǎo)膜的裂解。

盡管目前對(duì)參與晶狀體細(xì)胞器降解過程的基因表達(dá)調(diào)控和參與的信號(hào)通路已有一定的認(rèn)識(shí)，但對(duì)于另一種調(diào)控基因表達(dá)的重要方式—表觀遺傳學(xué)在晶狀體細(xì)胞器降解中的作用還知之甚少。表觀遺傳學(xué)是指在不改變基因組DNA序列的情況下，對(duì)基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。DNA甲基化是表觀遺傳調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵方式，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1，DNMT3A和DNMT3B)催化哺乳動(dòng)物DNA甲基化[73]。Tittle等[74]利用Uhrf1和Dnmt1斑馬魚突變體發(fā)現(xiàn)Uhrf1和Dnmt1在晶狀體上皮中表達(dá)，在缺失Uhrf1和Dnmt1后晶狀體上皮細(xì)胞基因表達(dá)發(fā)生變化，增殖減少，伴隨次級(jí)晶狀體纖維的解體，這首次證明了Uhrf1和Dnmt1在晶狀體發(fā)育中發(fā)揮重要作用。隨后，Hoang等[75]利用Le-Cre小鼠和Dnmt1 Floxed小鼠進(jìn)行晶狀體條件性敲除Dnmt1，發(fā)現(xiàn)Dnmt1缺失導(dǎo)致晶狀體DNA整體呈低甲基化狀態(tài)，晶狀體上皮細(xì)胞大量凋亡，但晶狀體纖維細(xì)胞的分化基本沒有受到影響。Liu等[76]也揭示了表觀遺傳修飾在先天性白內(nèi)障中的作用，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)散發(fā)性雙眼或單眼先天性白內(nèi)障患者和無白內(nèi)障患者的外周血進(jìn)行了全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序(whole genome bisulfite sequencing)，用于全基因組DNA甲基化檢測(cè)，結(jié)果提示先天性白內(nèi)障患者的DNA甲基化狀態(tài)與對(duì)照組有顯著不同，同時(shí)揭示了5個(gè)甲基化狀態(tài)顯著不同的核心基因(ACTN4、ACTG1、TUBA1A、TUBA1C及TUBB4B)，這些核心基因編碼的蛋白質(zhì)主要參與了細(xì)胞骨架和細(xì)胞間連接的構(gòu)建。這些研究揭示了表觀遺傳修飾在晶狀體發(fā)育中的重要作用，但細(xì)胞器降解作為晶狀體發(fā)育分化的關(guān)鍵生物學(xué)過程是否受到表觀遺傳機(jī)制的調(diào)控還需進(jìn)一步研究和探索。

4 結(jié)語

目前手術(shù)仍是治療白內(nèi)障最有效的方式。藥物研發(fā)受到許多因素的阻礙，雖已有一些針對(duì)氧化應(yīng)激的抗氧化藥物，但由于給藥方式等因素的影響，其療效不甚理想[77]。劉奕志教授團(tuán)隊(duì)在2015年揭示了羊毛甾醇逆轉(zhuǎn)蛋白聚集體的作用，在體內(nèi)外都驗(yàn)證了羊毛甾醇可使白內(nèi)障嚴(yán)重程度下降和晶狀體透明度提高[78]，這給白內(nèi)障的藥物治療帶來了曙光。而隨著對(duì)細(xì)胞器降解等重要生理過程機(jī)制的深入研究，探索發(fā)動(dòng)和參與這些生理過程的核心基因和分子，有望通過設(shè)計(jì)針對(duì)這些分子的藥物甚至通過基因工程的手段干預(yù)這些過程而進(jìn)行白內(nèi)障的治療。白內(nèi)障治療另一個(gè)關(guān)鍵的問題即為嬰幼兒白內(nèi)障的治療，由于小于2歲的嬰幼兒眼球處于發(fā)育階段，不宜植入人工晶狀體，尚缺乏較理想的治療方式。在干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，劉奕志教授團(tuán)隊(duì)在2016年發(fā)現(xiàn)并利用晶狀體上皮干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了人晶狀體原位再生，已成功用于臨床治療嬰幼兒白內(nèi)障[79]。但體內(nèi)再生的晶狀體存在透明度不足的問題，因此，探索晶狀體細(xì)胞器降解的機(jī)制也有望為解決該問題提供線索。

由于晶狀體發(fā)育分化過程調(diào)控的復(fù)雜性，要實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)還有很多尚待解決的問題，如什么因素誘發(fā)了晶狀體細(xì)胞器降解，晶狀體中梯度分布的物質(zhì)有何特點(diǎn)；參與細(xì)胞器降解過程的眾多通路中的核心通路是哪條；細(xì)胞凋亡、自噬等途徑發(fā)揮什么樣的作用，不同途徑是否有協(xié)同作用；不同細(xì)胞器的降解機(jī)制是否相同；細(xì)胞器降解后纖維細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)是怎么樣的，其新陳代謝如何進(jìn)行；豐富的晶狀體蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯是否有特殊的調(diào)控機(jī)制；如何通過這些核心分子或關(guān)鍵通路干預(yù)細(xì)胞器降解障礙等。

以上問題的解決也有賴于更好的研究模型。在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，除了動(dòng)物及細(xì)胞模型，已有研究者在體外建立了類晶狀體誘導(dǎo)體系，這為進(jìn)一步研究晶狀體發(fā)育分化提供了平臺(tái)。Yang等[80]在2010年用hESC(human embryonic stem cell)通過順序添加Noggin、FGF和BMP4、BMP7及FGF和Wnt3a的三階段誘導(dǎo)方法在體外成功誘導(dǎo)出透明的類晶狀體，表達(dá)晶狀體特異性蛋白，并通過電子顯微鏡觀察到了細(xì)胞器降解過程開始發(fā)生，但類晶狀體體積很小且功能不確定。在此誘導(dǎo)體系基礎(chǔ)上，F(xiàn)u等[81]利用尿液細(xì)胞來源的iPSC(induced pluripotent stem cell)，用“煎蛋法”誘導(dǎo)產(chǎn)生了體積更大的且有放大功能的類晶狀體。Murphy等[82]從分化的多能干細(xì)胞中純化出晶狀體上皮細(xì)胞團(tuán)塊，從而更高效的產(chǎn)生可以聚焦光線的類晶狀體，該類晶狀體在形態(tài)、細(xì)胞排列、mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)等方面與人晶狀體細(xì)胞和晶狀體更具相似性。因此，利用這些成熟的體外誘導(dǎo)體系可進(jìn)行細(xì)胞器降解等晶狀體發(fā)育分化過程調(diào)控機(jī)制的探索，而這些發(fā)育分化過程的深入研究也有望促進(jìn)晶狀體體外誘導(dǎo)體系進(jìn)一步成熟，為晶狀體發(fā)育分化的研究及白內(nèi)障的治療開辟新的思路。

此外，需要強(qiáng)調(diào)的是晶狀體的透明性是綜合因素作用的結(jié)果。細(xì)胞器降解是保證晶狀體透明性的重要生理過程，但不是唯一因素。晶狀體纖維細(xì)胞中的高濃度、有序堆積的晶狀體蛋白，也是其透明性的來源。晶狀體內(nèi)運(yùn)行著一個(gè)內(nèi)部微循環(huán)系統(tǒng)通過維持晶狀體內(nèi)的離子流和代謝穩(wěn)態(tài)保持晶狀體的透明度[83]。AQP0是晶狀體中最豐富的膜蛋白，占質(zhì)膜蛋白的50%～60%，也對(duì)維持晶狀體透明度和穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用[84]。晶狀體纖維細(xì)胞之間緊密結(jié)合，存在大量的黏附蛋白，使細(xì)胞邊緣的散射最小，這也是晶狀體透明性的來源[85]。總而言之，晶狀體透明不是由單一因素造成的，使晶狀體透明的關(guān)鍵是脈管系統(tǒng)的缺乏、晶狀體有序細(xì)胞結(jié)構(gòu)、胞內(nèi)細(xì)胞器的降解以及纖維細(xì)胞的膜和細(xì)胞質(zhì)折射率匹配等綜合因素的結(jié)果[3]。因此，對(duì)于晶狀體透明性的研究應(yīng)全面考慮，綜合分析。

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