基于生物信息學(xué)技術(shù)探討補(bǔ)骨脂致肝損傷的作用機(jī)制

余 丹，遲驍瑋 （. 南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院, 江蘇 南京 003；. 國家衛(wèi)生健康委醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心, 北京 00044）

補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifoliaLinn）為豆科植物，以干燥成熟果實(shí)入藥，性溫，味辛、苦，歸腎、脾經(jīng)。有溫腎助陽，納氣平喘，溫脾止瀉等功效，主治骨質(zhì)疏松癥、骨軟化癥、關(guān)節(jié)痛、哮喘、白癜風(fēng)、銀屑病、遺尿尿頻、腎虛作喘等疾病，在中醫(yī)臨床治療中被廣泛應(yīng)用于脾腎陽虛的治療，但長期或者超量使用補(bǔ)骨脂及其制劑可導(dǎo)致肝損傷，臨床表現(xiàn)主要為皮膚鞏膜黃染、尿黃、乏力和食欲不振，同時(shí)伴有丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽紅素（T-Bil）和直接膽紅素（D-Bil）等生化指標(biāo)不同程度升高，肝臟腫大或肝臟彌漫性病變。實(shí)驗(yàn)研究也表明，長期或大劑量服用補(bǔ)骨脂可引起大鼠不同程度的肝損傷。然而，補(bǔ)骨脂肝損傷成分和潛在機(jī)制至今尚未得到闡明。在本研究中，我們通過生物信息學(xué)工具評價(jià)補(bǔ)骨脂誘導(dǎo)肝損傷的潛在作用機(jī)制，為補(bǔ)骨脂肝損傷的臨床和基礎(chǔ)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫

TCMIP (http://lsp.nwu.edu.cn/, Version 2.3)；Pharm Mapper (http://59.78.96.61/pharmmapper/)；Uniprot 數(shù)據(jù)庫中UniprotKB 檢索功能（http://www.uniprot.org/）；String 數(shù) 據(jù) 庫（https://string-db.org/,Version 4.5.0）；Disgenet（https://www.disgenet.org/）；DAVIA 基因富集分析網(wǎng)站 (http://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)；Cytoscape 軟 件(Version 2.7.1)；Chembiodraw Ultra 軟件 (Version14.0)

1.2 補(bǔ)骨脂肝損傷成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測

通過TCMIP 數(shù)據(jù)庫獲取補(bǔ)骨脂所有化學(xué)成分，再結(jié)合文獻(xiàn)挖掘與整理，篩選出補(bǔ)骨脂的主要成分，并對成分進(jìn)行預(yù)測。

登陸Pharm Mapper 服務(wù)器，上傳上述補(bǔ)骨脂成分，獲得虛擬篩選結(jié)果。利用UniProt 數(shù)據(jù)庫中UniProtKB 搜索功能，輸入蛋白名稱，限定物種為人，預(yù)測補(bǔ)骨脂成分的作用靶點(diǎn)。

在Disgenet 數(shù)據(jù)庫中搜索藥物性肝損傷相關(guān)的基因，去除重復(fù)基因和假陽性基因，與上述Pharm Mapper 服務(wù)器中返回的靶點(diǎn)相匹配，得到補(bǔ)骨脂成分誘導(dǎo)肝損傷的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將補(bǔ)骨脂誘導(dǎo)肝損傷的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，利用Multiple proteins 工具，選擇“Homo Sapiens”為生物體，獲取蛋白相互作用。將補(bǔ)骨脂成分和作用靶點(diǎn)信息以源節(jié)點(diǎn)和節(jié)點(diǎn)直接導(dǎo)入Cytoscape3.7.1，構(gòu)建藥材-成分-靶標(biāo)-疾病網(wǎng)絡(luò)。借助Network Analyzer 工具對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，并篩選出補(bǔ)骨脂誘導(dǎo)肝損傷的關(guān)鍵靶蛋白。

1.4 基因本體功能（GO）注釋和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析

用DAVID 6.7 (http://david.ncifcrf.gov/summary.jsp) 對補(bǔ)骨脂藥物性肝損傷PPI 網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO 注釋和KEGG 通路分析，并采用R 軟件對結(jié)果進(jìn)行圖形化表示。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)骨脂成分的相關(guān)信息

從TCMIP 數(shù)據(jù)庫中共篩選出的32 個(gè)相關(guān)化合物，其中補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂查爾酮、異補(bǔ)骨脂素和甲氧補(bǔ)骨脂素等22 個(gè)符合Lipinski5規(guī)則，而補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚為補(bǔ)骨脂主要成分。因此，上述22 個(gè)化合物全部納入進(jìn)一步研究，化合物名稱及詳細(xì)信息見表1。

表1 補(bǔ)骨脂成分及相關(guān)信息

2.2 補(bǔ)骨脂成分肝損傷的靶點(diǎn)預(yù)測

將補(bǔ)骨脂22 個(gè)成分輸入Pharm Mapper 中，得到所有潛在蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，經(jīng)UniProt 轉(zhuǎn)化為基因ID，并與Disgenet 數(shù)據(jù)庫中8 類藥物性肝損傷挖掘的疾病基因ID 根據(jù)匹配度由高到低進(jìn)行排序，去除重復(fù)后，匹配共得到31 個(gè)補(bǔ)骨脂潛在的肝損傷作用靶點(diǎn)，見表2。

表2 補(bǔ)骨脂成分潛在肝損傷作用靶點(diǎn)

2.3 補(bǔ)骨脂成分-靶點(diǎn)-信號通路-肝損傷網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

采用Cytoscape 軟件的Merge 功能構(gòu)建補(bǔ)骨脂成分-靶點(diǎn)-信號通路-肝損傷網(wǎng)絡(luò)模型，如圖1 所示（綠色橢圓代表靶點(diǎn)，黃色橢圓代表成分，粉紅色菱形代表疾病，紫色橢圓表示補(bǔ)骨脂），節(jié)點(diǎn)代表活性或靶點(diǎn)，邊代表成分、作用靶點(diǎn)和疾病間的相互關(guān)聯(lián)，其中共有60 個(gè)節(jié)點(diǎn)，327 個(gè)邊。節(jié)點(diǎn)的大小與度的大小呈正比關(guān)系，節(jié)點(diǎn)越大表示該節(jié)點(diǎn)的度越大。依據(jù)拓?fù)浞治觯?3 個(gè)成分的度值大于10，分別為補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂酚、異新補(bǔ)骨脂查爾酮、異補(bǔ)骨脂黃酮、補(bǔ)骨脂異黃酮醛、異補(bǔ)骨脂定、雙羥異補(bǔ)骨脂定、新補(bǔ)骨脂查爾酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂查爾酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮；具有較高度值的靶點(diǎn)蛋白有血清白蛋白（ALB）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P（GSTP1）、運(yùn)甲狀腺素蛋白（TTR）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）。

圖1 補(bǔ)骨脂成分-靶點(diǎn)-肝損傷網(wǎng)絡(luò)

采用DAVID 在線富集平臺進(jìn)行生物學(xué)功能分析，獲得103 個(gè)GO 注釋（黃色表示生物學(xué)過程、綠色表示細(xì)胞組成、藍(lán)色表示分子功能）。GO 分析表明，靶蛋白大多富集于RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、信號轉(zhuǎn)錄、DNA 模板轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、氧化還原反應(yīng)、固有免疫應(yīng)答、細(xì)胞對脂多糖（LPS）的反應(yīng)、細(xì)胞氧化解毒等生物學(xué)過程，見圖2。此外，KEGG 富集分析表明，5 條通路（P＜0.05）受補(bǔ)骨脂的影響，包括化學(xué)物致癌、AMPK信號通路、PPAR 信號通路、肝藥酶P450（CYP）有害物代謝和谷胱甘肽代謝通路等，結(jié)果見圖3。

圖2 補(bǔ)骨脂肝損傷靶點(diǎn)的GO 富集圖

圖3 補(bǔ)骨脂肝損傷靶點(diǎn)的KEGG 富集圖

3 討論

在臨床上，補(bǔ)骨脂被廣泛應(yīng)用于治療骨質(zhì)疏松、銀屑病等多種疾病，其所導(dǎo)致的藥物性肝損傷已引起人們關(guān)注，但對于其肝損傷成分及分子機(jī)制的研究尚不深入。為了探究補(bǔ)骨脂所致肝損傷的作用機(jī)制，本研究從補(bǔ)骨脂的成分出發(fā)，借助生物信息學(xué)技術(shù)構(gòu)建了補(bǔ)骨脂藥材-成分-靶點(diǎn)-信號通路-肝損傷網(wǎng)絡(luò)，分析補(bǔ)骨脂中成分與靶點(diǎn)的作用關(guān)系，為其導(dǎo)致肝損傷作用機(jī)制研究提供了參考。

通過數(shù)據(jù)庫檢索，我們發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂主要含有補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂定、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚等22 個(gè)成分[1-5]，其中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚等為主要成分[5-6]。補(bǔ)骨脂中個(gè)別成分已被發(fā)現(xiàn)具有導(dǎo)致肝損傷的作用，如研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂素與補(bǔ)骨脂酚可通過降低BSEP 蛋白的表達(dá)，升高NTCP 和CYP7A1 蛋白的表達(dá)，使得進(jìn)入肝細(xì)胞的膽汁酸增多，進(jìn)而肝細(xì)胞中膽汁酸的含量異常升高，最終導(dǎo)致膽汁淤積性肝損傷[7-9]；此外，補(bǔ)骨脂素通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白E1 和p27 蛋白水平并下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1 的水平，使肝細(xì)胞周期阻滯進(jìn)而導(dǎo)致肝再生和代償能力下降而誘發(fā)小鼠輕度肝損傷和L02 肝細(xì)胞損傷；而異補(bǔ)骨脂素通過抑制MRP2 和MRP3 導(dǎo)致HepG2的細(xì)胞肝損傷[10-11]。補(bǔ)骨脂酚在體外的生物利用度遠(yuǎn)低于補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，但在體內(nèi)補(bǔ)骨脂酚的CYP450 代謝作用較強(qiáng)[12]，補(bǔ)骨脂酚在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境中的吸收和代謝可能是導(dǎo)致其在體內(nèi)外肝損傷差異的主要原因。

通過GO 分析整合預(yù)測，得到補(bǔ)骨脂導(dǎo)致肝損傷生物功能包括氧化還原反應(yīng)、固有免疫應(yīng)答、細(xì)胞對LPS 的反應(yīng)、細(xì)胞氧化解毒等。目前已知，氧化還原反應(yīng)與免疫應(yīng)答在藥物性肝損傷發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)，可溶性T 細(xì)胞免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和含黏蛋白結(jié)構(gòu)域分子-3（sTIM-3）通過促進(jìn)自噬和調(diào)節(jié)單核/巨噬細(xì)胞功能，減輕炎癥反應(yīng)和肝損傷[13]。氧化應(yīng)激介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化可導(dǎo)致膠原合成增加，氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡會干擾線粒體功能障礙進(jìn)而導(dǎo)致藥物引起的肝損傷。ROS 可影響過氧化物酶體增殖物激活的受體調(diào)節(jié)脂肪酸氧化以及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和相關(guān)的應(yīng)激敏感激酶活力而調(diào)節(jié)肝細(xì)胞凋亡[14]。LPS 參與了肝損傷中炎癥或免疫破壞，可通過激活TLR-2和TLR-4 途徑促進(jìn)炎癥活動(dòng)，并且LPS 誘導(dǎo)的短暫缺血破壞了呼吸鏈復(fù)合物的活性，增強(qiáng)了ROS，從而進(jìn)一步增強(qiáng)腸道高通透性，并能顯著誘導(dǎo)肝損傷[15-16]。

KEGG 富集分析結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂所致肝損傷可能涉及AMPK、PPAR、CYP 等多條信號通路。AMPK 是NF-κB 的上游蛋白，被認(rèn)為是維持ADP/AMP/ATP 水平的關(guān)鍵細(xì)胞代謝傳感器，AMPK 信號通路的激活可抑制非典型NF-κB 途徑，從而保護(hù)肝臟免受損傷[17-18]。PPAR 信號通路在肝損傷和肝纖維化中起著關(guān)鍵作用，在活化的HSCs 中，PPAR-γ活性降低，從而導(dǎo)致HSCs 從維甲酸儲存狀態(tài)向產(chǎn)生ECM 的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可促進(jìn)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷和纖維化，然而，抑制PPARG 可阻止Fsp27α mRNAs 的表達(dá)，進(jìn)而減少乙醇誘導(dǎo)小鼠線粒體活性氧生成所導(dǎo)致的肝損傷[19-20]。肝臟CYP 酶在藥物代謝和清除中發(fā)揮關(guān)鍵作用，例如CYP2E1 可增加活性氧的數(shù)量，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激肝損傷[21-22]?；谏鲜鼋Y(jié)果和理論基礎(chǔ)，有必要開展補(bǔ)骨脂AMPK、PPAR 等信號通路的作用研究，從而為其肝損傷機(jī)制提供理論依據(jù)。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)構(gòu)建補(bǔ)骨脂藥材-成分-靶點(diǎn)-信號通路-肝損傷網(wǎng)絡(luò)對補(bǔ)骨脂成分所致肝損傷作用機(jī)制進(jìn)行分析預(yù)測，研究結(jié)果充分表明了補(bǔ)骨脂多成分-多靶點(diǎn)-多通路的肝損傷作用特點(diǎn)，為進(jìn)一步開展補(bǔ)骨脂致肝損傷作用機(jī)制的研究提供了新思路。