楊紅濤，袁敏學 綜述，張曉姝，李津，2 審校

1.武漢博沃生物科技有限公司，湖北 武漢 430075；2.華蘭生物疫苗股份有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453003

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pn）感染可引起較常見的鼻竇炎和中耳炎等輕癥，也可導致嚴重的侵襲性疾病，如腦膜炎、敗血癥和肺炎［1］，同時也是感染性疾病發(fā)病率和致死率居高不下及全球嚴重疾病負擔的主要原因［2］。2007 年，據(jù)WHO估算，此后全球每年將有160 萬人死于S.pn 引發(fā)的疾病，其中70 萬～ 100 萬為5 歲以下兒童［3］。2000年，美國批準7 價S.pn 多糖結合疫苗（seven-valent pneumococcal conjugate vaccine，PCV7）上市［4］；2009年，PCV10 及PCV13 也相繼上市，并于2009 — 2011年取代PCV7［5］。但這些疫苗存在血清型替代及年齡組覆蓋不全等局限性。2015 年，全球5 歲以下兒童死亡人數(shù)估計為583 萬，其中由S.pn 感染所致死亡人數(shù)為29.4 萬［1］；2016 年，全球下呼吸道感染導致5 歲以下兒童死亡約65.3 萬人，S.pn 仍是引起全球各年齡組下呼吸道感染高發(fā)病率和死亡率的首要病原菌［6］。因此，研發(fā)能預防更多血清型S.pn 感染所致疾病及中低收入國家可負擔的廣譜S.pn 疫苗具有重要意義。

基于改造S.pn 毒力因子的新一代廣譜S.pn疫苗已處于研發(fā)中，其中4 項全細胞疫苗、15 種候選蛋白疫苗已展開臨床試驗。本文就新一代廣譜S.pn疫苗的最新研究進展作一綜述。

1 現(xiàn)有肺炎疫苗面臨的挑戰(zhàn)

1.1 全球普及接種PCV 的困境 澳大利亞、英國等發(fā)達國家多項研究證實，接種肺炎疫苗在減少兒童因感染S.pn 住院中起到重要作用［7-8］。據(jù)2019 年VIEWhub 報告統(tǒng)計，全球已有144 個國家將接種PCV 納入國家免疫規(guī)劃（National Immunization Program，NIP），但仍有35 個中低收入國家未決定是否納入NIP。2017 年，全球仍有4230 萬名嬰幼兒（占52%）未接種肺炎疫苗［9］。WHO 建議所有國家將PCV 納入NIP，但由于PCV 制備工藝復雜及價格昂貴，使該目標至今未能實現(xiàn)。PCV13 通過全球疫苗免疫聯(lián)盟（The Global Alliance for Vaccines and Immunisation，GAVI）和泛美衛(wèi)生組織（Pan American Health Organization，PAHO）采購的價格分別為2.90～2.95 和14.5 美元／劑［10-11］，私營企業(yè)的售價是202 美元／ 劑［12］，而全球每年接種PCV 的費用預計約160 億美元［13］。目前，中高收入國家PCV 覆蓋率僅為48%，中低收入國家覆蓋率為71%，雖然通過GAVI 采購價格相對低廉，但當一些中低收入國家成為中高收入國家時，GAVI 將結束資助，這些國家也可能無法繼續(xù)將PCV 疫苗納入NIP［14］，如肯尼亞2027 年將因經濟增長成為中收入國家，GAVI 將結束資助，國家會由于資金問題而削減疫苗全民接種計劃以減少財政開支［15］。人口總計占全球36.4%的中低收入國家的中國和印度（人口均超13 億）也未將PCV 納入NIP［16-17］。

雖然23 價S.pn 多糖疫苗（23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine，PPSV23）比PCV13 可預防更多血清型的S.pn 感染，但由于無載體蛋白，疫苗無法有效激發(fā)T 細胞依賴的抗體免疫反應及潛在免疫記憶［18］，目前僅用于65 歲以上人群和高風險感染S.pn 的2 歲以上兒童［19］，同時美國免疫實踐咨詢委員會（Advisory Committee on Immunization Practices，ACIP）建議65 歲以上人群接種PCV13 后間隔1 年再接種PPSV23［20］。由于PPSV23 本身的缺陷，不適于在全球范圍內進行全年齡段推廣接種。

1.2 血清型替代風險 目前，依據(jù)莢膜特異性多糖成分可將S.pn 分為96 多種血清型［21］，PCV7 可覆蓋其中4、6B、9V、14、18C、19F、23F 7 種血清型，PCV10在此基礎上增加1、5、7F 3 種型別，PCV13 再增加3、6A、19A 3 種型別［22］。MORENO 等［23］在哥倫比亞首都波哥大對嬰幼兒接種PCV10 后展開的一項臨床研究發(fā)現(xiàn)，疫苗未覆蓋的19A 血清型S.pn 導致侵襲性肺炎病例的比例由2008 — 2011 年的4.4%上升至2014—2017 年的32.4%。在普遍接種PCV7或PCV13 的發(fā)達國家也存在類似現(xiàn)象，如在美國非PCV 覆蓋的6C、15A／B／C、23A、35B 血清型［24-25］，挪威和德國的15A、23B 血清型［26-27］，法國的12F、15A、24F、35B 血清型［28］，流行性均有所增強。因此，疫苗制造廠商紛紛研發(fā)覆蓋更多血清型的PCV，如德國Merck 公司的PCV15（新增22F、33F 血清型）［29］已成功完成2 項Ⅲ期臨床試驗（NCT0-3480763，NCT03480802），并計劃遞交上市申請；美國輝瑞公司于2020 年3 月公布了20vPnC（新增8、10A、11A、12F、15B、22F、33F 血清型）Ⅲ期臨床試驗結果（NCT-037-60146，NCT03828617，NCT03835975），并準備遞交上市申請；美國加州生物公司SutroVax 于2020 年3 月宣布完成1.1 億美元融資開發(fā)24 價PCV。

2 新一代廣譜S.pn 疫苗的候選蛋白抗原成分

為克服現(xiàn)有PPSV23 無法保護主要風險群體（2歲以下兒童）及PCV 保護血清型有限且價格昂貴的局限性［30］，迫切需要開發(fā)具有廣譜保護性的S.pn疫苗。S.pn 毒力因子及表面表達的高度保守蛋白抗原能夠誘導產生黏膜和血清抗體反應，可作為潛在的蛋白疫苗成分［31］。近年，研究者對眾多S.pn蛋白抗原的功能及免疫原性進行了研究，RICHARD等［32］利用生物信息學技術對多達52 種S.pn 保守蛋白抗原進行了動物免疫原性研究，主要的S.pn 蛋白抗原及功能見表1［33-39］。有研究通過對感染S.pn的人群進行抗體篩查，進一步分析感染S.pn 兒童樣本檢測到的特異性抗體，獲得了Ply、PspA、PspC 等蛋白抗原［34，39］。

表1 影響S.pn 毒力的主要蛋白及其功能Tab.1 Functions of main proteins influencing virulence of S.pn

目前研究最廣泛的為Ply 蛋白，其為一種膽固醇結合蛋白，在菌體自溶時釋放并在真核細胞膜上形成孔隙［40］，Ply 可通過TLR4、NLRP3 通路激活固有免疫［41-42］。天然的Ply 蛋白具有毒性，其無毒突變體已用于臨床試驗［34］。另外，PspA 也是一種高度保守的膽固醇結合蛋白，廣泛存在于各S.pn 菌株中，并可產生交叉保護反應，該蛋白可抑制C3 補體活性并使后者在菌體表面聚集，同時保護菌體免受乳鐵蛋白毒效應［34］。已有動物實驗表明，PspA 作為候選疫苗成分可激發(fā)抗體免疫保護，具有預防侵襲性S.pn感染的潛在作用［43］。

3 新一代廣譜S.pn 疫苗

3.1 S.pn 蛋白疫苗 2017 年，ODUTOLA 等［44］用Ply類毒素（dPly）、PhtD 與10 個S.pn 血清型多糖抗原混合后作為候選疫苗，對岡比亞兒童進行了Ⅱ期臨床試驗，初步結果顯示，其耐受性良好，但在鼻咽部S.pn 載量研究中未發(fā)現(xiàn)對非10 個多糖抗原血清型S.pn 的廣譜保護效應。2019 年，英國GSK 公司開發(fā)的GSK2189242A 候選疫苗（含dPly、PhtD 突變體）已完成其用于預防急性中耳炎（acute otitis media，AOM）的Ⅱ期臨床試驗［45］。另外，BROOKS 等［46］用重組表達PhtD、PlyD1、PcpA 三價候選疫苗進行的Ⅰ期臨床結果顯示，該候選疫苗能增強成年人、老年人、兒童對所有S.pn 血清型的抗體水平。目前正在進行的S.pn 蛋白候選疫苗臨床試驗見表2［47-61］。

表2 S.pn 蛋白候選疫苗臨床研究相關信息Tab.2 Data on clinical trials of candidate S.pn vaccines

目前，國內開展S.pn 蛋白疫苗研究的高校團隊均處于基礎理論研究階段，天津康希諾公司自主研發(fā)的重組S.pn 蛋白疫苗已進入Ⅰ期臨床，預計將在2020 年完成Ⅰa 期臨床試驗。另外，2019年3 月，蘭州生物制品研究所有限責任公司與英國疫苗研發(fā)公司ImmunoBiology 簽署許可協(xié)議，將獲得該公司通用型S.pn 疫苗PnuBioVax 在中國的開發(fā)和商業(yè)化權利。

3.2 S.pn 全細胞疫苗 由于S.pn 全細胞疫苗（pneumococcal whole cell vaccine，PWCV）不需要純化蛋白抗原的工藝步驟、不涉及多糖-蛋白結合制備工藝、生產成本遠低于PCV，適合發(fā)展中國家及低收入國家生產及大范圍覆蓋使用。目前已有動物試驗研究證明，無莢膜PWCV 可有效激發(fā)體液免疫及細胞免疫，從而預防多種S.pn 感染［62］。

KIM 等［63］將D39 型S.pn 的pep27 基因（△pep27）敲除，獲得的減毒菌株無法在肺部、血液及大腦定植。為進一步降低△pep27 減毒株回復突變?yōu)橐吧投局甑娘L險，以增加其安全性，研究者進一步敲除其comD基因，獲得的雙突變減毒株△pep27△comD 可有效誘導PspA 特異性IgG。在對小鼠進行的D39、6B S.pn血清型攻毒試驗中發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，該雙突變株可有效提高小鼠存活率（＞80%）；同時，該候選疫苗還可有效抑制其他已分型、未分型S.pn 定植。JANG 等［64］通過敲除莢膜脯氨酸二酰甘油轉移酶基因（lgt）獲得的TIGR4（TIGR4△lgt）減毒株毒力、炎癥活性均降低，該減毒株可在鼻咽部有效誘導黏膜特異性IgA 和IgG2b 抗體反應，小鼠鼻腔給藥的2 型S.pn（D39）、3 型（wu2）及6B、9V、19F 和23F 型攻毒挑戰(zhàn)試驗顯示，該減毒株可產生廣譜預防效果。TERRA 等［65］將1 型（519／43）S.pn 菌株Ply 基因突變（519／43△Ply）獲得喪失溶血能力的減毒株，但隨后的動物試驗發(fā)現(xiàn)，雖然血液中S.pn 定植有所減少，卻未能對S.pn 侵襲產生理想的保護效果。

MELLROTH 等［66］將2 型S.pn 突變?yōu)闊o莢膜的RX1 菌株，進一步敲除其自溶素基因（lytA）并用乙醇滅活，在以霍亂毒素（cholera toxin，CT）為候選疫苗佐劑的大鼠、小鼠鼻腔給藥挑戰(zhàn)試驗中發(fā)現(xiàn)，該候選疫苗對有莢膜的6B、3 型S.pn 在鼻腔定植及侵襲有保護效果。LU 等［67］將溶血素基因（Ply）突變?yōu)闇p毒的PdT 基因，進而敲除全lytA 基因并換為卡那霉素抗性基因，獲高產RM200（RX1EPdT△lytA）菌株。該研究以β-丙內酯滅活，并以氫氧化鋁為佐劑制備試驗疫苗，對6B 型S.pn 的攻毒試驗發(fā)現(xiàn)，該候選疫苗可有效預防鼻咽部定植且可激活白介素-17A。帕斯適宜衛(wèi)生科技組織（Program for Appropriate Technology in Health，PATH）在肯尼亞展開Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗，用于評價此前接種過PCV，而后接種其滅活全細胞鋁佐劑候選疫苗（PATH-wSP）的安全性和耐受性［68］。目前正在進行的S.pn 全細胞候選疫苗臨床試驗見表3［68-71］。

表3 S.pn 全細胞候選疫苗臨床研究相關信息Tab.3 Data on clinical trials of candidate whole cell S.pn vaccines

4 小結與展望

目前，全球范圍內感染S.pn 導致死亡率仍較高，特別是嬰幼兒、老年人、免疫功能低下者（如艾滋病患者）等人群。盡管隨著多糖型PPSV23 和蛋白結合型PCV10／13 疫苗在全球的廣泛使用，使S.pn 感染人數(shù)大幅降低，但仍有問題亟待解決。如針對現(xiàn)有疫苗覆蓋以外S.pn 血清型及無莢膜S.pn 的預防效果不足；PPSV23 免疫原性低且無法產生有效的免疫記憶（低齡兒童）；面對血清型替代問題，不斷增加PCV 抗原以覆蓋更多流行株，將面臨巨大的技術及經濟挑戰(zhàn)。重組蛋白、全細胞廣譜肺炎疫苗生產成本低，能在發(fā)展中國家大規(guī)模生產，同時可潛在地覆蓋各年齡組人群并誘發(fā)免疫記憶，產生非血清型依賴性保護。

雖然目前有眾多候選廣譜疫苗進入臨床Ⅰ／Ⅱ期研究，但全球尚無廣譜S.pn 疫苗進入Ⅲ期臨床試驗。蛋白疫苗的組合方式、遞送系統(tǒng)、給藥途徑，如何保持全細胞疫苗生產批間一致性及減少副反應還有待進一步的臨床研究及評價。隨著技術的進步，結構生物學、生物信息學的發(fā)展，更為精準、有效、安全的短肽納米顆粒疫苗將會進一步推動廣譜肺炎疫苗的研發(fā)，快速推動新一代疫苗上市。