王穎，王斌，陳娜娜，魏輝，徐艷玲，李景良，鄒勇

1.長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長(zhǎng)春 130062；2.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院感染科，吉林 長(zhǎng)春 130021

森林腦炎又稱蜱傳腦炎（tick-borne encephalitis，TBE），是由森林腦炎病毒（tick-borne encephalitis virus，TBEV）所致的一種經(jīng)蜱傳播的自然醫(yī)源性急性傳染病。TBEV 是一種嗜神經(jīng)病毒。TBE 臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、意識(shí)障礙、抽搐、頭痛、肢體及頸部肌肉癱瘓，以及心血管疾病、眼部病變、心肌炎、呼吸麻痹、腸易激綜合征［1-3］等。TBE 發(fā)病急，臨床癥狀復(fù)雜，診斷困難，病殘率、死亡率高，嚴(yán)重威脅廣大人民群眾的生命健康，接種疫苗是預(yù)防TBE 傳播的最有效方法。

我國(guó)TBE 疫苗是經(jīng)地鼠腎細(xì)胞（primary hamster kidney cells，PHK）制備而成的滅活疫苗，毒種是經(jīng)鼠腦傳代制備的“森張”株TBEV。該TBE 疫苗生產(chǎn)工藝需消耗大量地鼠，不符合世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）對(duì)動(dòng)物使用的“3R”（替代、減少、優(yōu)化）要求。為進(jìn)一步提高TBE 疫苗規(guī)?；a(chǎn)及產(chǎn)品安全性，亟需探索新的TBEV 適應(yīng)細(xì)胞株。

2BS 細(xì)胞是從人胚胎肺組織分離的細(xì)胞株，可進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，無(wú)外源因子污染，安全性高，具有廣泛的病毒敏感性，是制備疫苗理想的培養(yǎng)基質(zhì)［4］。目前已應(yīng)用于甲型肝炎疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、水痘疫苗等疫苗生產(chǎn)，臨床應(yīng)用證明安全性高［5］。本研究通過將“森張”株鼠腦病毒在2BS細(xì)胞上適應(yīng)后，獲得2BS 細(xì)胞適應(yīng)株TBEV，與鼠腦適應(yīng)株進(jìn)行全基因序列對(duì)比分析，以證明其基因穩(wěn)定性，為后續(xù)2BS 細(xì)胞森林腦炎疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒及細(xì)胞“森張”株TBEV 是1952 年從東北某林場(chǎng)TBEV 感染死亡者腦組織中分離，經(jīng)鼠腦組織傳代獲得的TBE 疫苗病毒株，由長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗三室保存；2BS 細(xì)胞（24代）由該室提供。

1.2 主要試劑及儀器 RNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；一步法PCR試劑盒、DNA marker DL2000 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；E-MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自日水制藥株式會(huì)社；新生牛血清購(gòu)自山西潤(rùn)生大業(yè)生物材料有限公司；MJ Mini PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad Laboratories，Inc。

1.3 2BS 細(xì)胞傳代 將凍存的24 代2BS 細(xì)胞從液氮中取出，立即至37 ℃水浴中，使其在1 min 內(nèi)全部融化后，接種至含E-MEM 培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；更換新的EMEM 培養(yǎng)液，待細(xì)胞培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)滿細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，與E-MEM 培養(yǎng)液按1 ∶4 的比例接種至新的培養(yǎng)瓶中，37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，備用。

1.4 適應(yīng)株的選育及增殖 待2BS 細(xì)胞長(zhǎng)滿單層，棄E-MEM 培養(yǎng)液，以0.01 MOI 主代鼠TBEV 感染2BS 細(xì)胞，37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d；收獲病毒液，持續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)至第10 代，依據(jù)代次不同分別命名為BST-1 ～BST-10。

1.5 蝕斑克隆純化 將24 代2BS 細(xì)胞分別按1 ×105個(gè)／mL 接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，3 mL／孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿單層；棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入稀釋好的病毒（10-6～10-8），1 mL／孔，每個(gè)稀釋度2 孔，細(xì)胞對(duì)照2 孔，37 ℃吸附1.5 h；加入第1 層覆蓋物（以100 mL 為例：2 倍E-MEM 液50 mL，新生牛血清10 mL，Hepes 液1 mL，1.77%瓊脂糖溶液34 mL，7.5%碳酸氫鈉溶液3 mL，1%谷氨酰胺溶液1 mL，非必需氨基酸1 mL），3 mL／孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)2 d；加入第2 層覆蓋物（以100 mL 為例：2 倍E-MEM 液50 mL，新生牛血清10 mL，Hepes 液1 mL，1.77%瓊脂糖溶液34 mL，7.5%碳酸氫鈉溶液3 mL，3%谷氨酰胺溶液1 mL，非必需氨基酸1 mL，中性紅溶液3 mL），3 mL／孔，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)48 ～72 h；挑取同一大小蝕斑至1 mL 維持液中，分別加至已長(zhǎng)滿單層2BS 細(xì)胞的24 孔板中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)4～5 d；挑取單克隆并擴(kuò)增。

1.6 病毒總RNA 提取 取BST-4 收獲液200 μL，用RNA 提取試劑盒提取總RNA，具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，置-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank 中公布的“森張”株核苷酸序列（JQ650523）設(shè)計(jì)引物，見表1，引物由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。

表1 “森張”株TBEV 全基因引物Tab.1 Primers for Senzhang strain of TBEV

1.8 目的基因片段的擴(kuò)增 以提取的2BS 適應(yīng)株病毒總RNA 為模板，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：65 ℃5 min；冰浴2 min；42 ℃30 min；85 ℃5 s 失活；4 ℃保存。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板，以對(duì)應(yīng)的F1 ～ 9／R1 ～ 9 為引物PCR 擴(kuò)增相應(yīng)片段。反應(yīng)條件：95 ℃1 min；95 ℃30 s，退火56 ～ 58 ℃30 s，72 ℃90 s，共35 次；72 ℃10 min；4 ℃保存。

1.9 基因鑒定及序列分析 每份PCR 產(chǎn)物取5 μL，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。膠回收試劑盒回收各段PCR 產(chǎn)物，送吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN 軟件進(jìn)行拼接，并與主代TBEV 鼠腦適應(yīng)株核酸序列進(jìn)行比較分析。

1.10 數(shù)據(jù)處理 采用MEGA 軟件鄰域連接方法對(duì)不同毒株E 蛋白系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)化分析；應(yīng)用DNAMAN軟件對(duì)E 蛋白進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 擴(kuò)增出的9 段產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠分析，片段大小均與理論值相符，見圖1。

圖1 2BS 細(xì)胞適應(yīng)株TBEV PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoretic profile of PCR product of 2BS cells-adapted strain of TBEV

2.2 全基因測(cè)序及其編碼的氨基酸分析 測(cè)序結(jié)果顯示，BST-4 TBEV 全基因序列共10782 個(gè)核苷酸，編碼序列130 ～ 10374，共編碼3414 個(gè)氨基酸。將該全基因序列與TBEV 主代鼠腦適應(yīng)株進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，核苷酸序列同源性為99.63%，氨基酸序列同源性為99.56%；BST-4 TBEV 全基因序列的5′端非編碼區(qū)（UTR）突變堿基C39→A，3′UTR C384→T；編碼區(qū)有14 個(gè)氨基酸發(fā)生變異，分別為C 結(jié)構(gòu)蛋白77 位點(diǎn)賴氨酸（K）→精氨酸（R），E 結(jié)構(gòu)蛋白232 位點(diǎn)谷氨酰胺（Q）→精氨酸（R）、492 位點(diǎn)亮氨酸（L）→苯丙氨酸（F），NS1 非結(jié)構(gòu)蛋白146 位點(diǎn)脯氨酸（P）→亮氨酸（L）、324 位點(diǎn)異亮氨酸（I）→苯丙氨酸（F），NS2A 非結(jié)構(gòu)蛋白122 位點(diǎn)絲氨酸（S）→甘氨酸（G），NS2B 非結(jié)構(gòu)蛋白21 位點(diǎn)色氨酸（W）→精氨酸（R），NS3 非結(jié)構(gòu)蛋白74 位點(diǎn)絡(luò)氨酸（Y）→天冬氨酸（D）、142 位點(diǎn)蘇氨酸（T）→異亮氨酸（I）、160 位點(diǎn)天冬酰胺（N）→絲氨酸（S）、339 位點(diǎn)蘇氨酸（T）→丙氨酸（A），NS5 非結(jié)構(gòu)蛋白160、372 位點(diǎn)賴氨酸（K）→精氨酸（R）、452 位點(diǎn)丙氨酸（A）→纈氨酸（V）。

2.3 TBEV E 蛋白基因同源性分析 應(yīng)用MEGA 軟件采用鄰域連接方法，進(jìn)行BST-4 與遠(yuǎn)東亞型（TBEVFe）、歐洲亞型（TBEV-Eu）、西伯利亞亞型（TBEVSib）毒株E 蛋白系統(tǒng)的進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，BST-4與Xinjiang-01 最接近，見圖2。應(yīng)用DNAMAN 分析軟件，將BST-4 與中國(guó)區(qū)域毒株進(jìn)行E 蛋白同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，與DXAL-12、DXAL-13、DXAL-21毒株E 蛋白同源性為99.34%；與MDJ01、WH2012 毒株E 蛋白同源性為99.6%；與Xinjiang-01 毒株E 蛋白同源性為99.4%；與JLCB11-08、JLCB11-35、JLCB11-40 毒株E 蛋白同源性為99.85%。

圖2 2BS 細(xì)胞適應(yīng)株TBEV 與其他亞型E 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic tree of E protein of 2BS cells-adapted strains and other subtypes

3 討論

TBEV 基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng)約11000 bp，由1 個(gè)閱讀框架編碼病毒蛋白。UTR 位于閱讀框架兩側(cè)，靠近5′UTR 區(qū)域的全基因約25%基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白［衣殼蛋白C、膜蛋白prM（M）、包膜蛋白E］，剩余約75%基因編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5）［6］。其中E 蛋白是最重要的病毒蛋白，參與受體結(jié)合、膜融合，影響病毒毒力，與病毒的血凝活性有關(guān)，還可誘導(dǎo)宿主的體液免疫應(yīng)答［6-7］。

基因序列分析結(jié)果顯示，與主代鼠腦適應(yīng)株核苷酸序列同源性為99.63%，氨基酸序列同源性為99.56%，其中5′UTR 和3′UTR 分別有1 個(gè)堿基突變；傳代過程中的氨基酸突變主要集中在非結(jié)構(gòu)蛋白，共有9 個(gè)氨基酸突變，而結(jié)構(gòu)蛋白中僅有3 個(gè)氨基酸突變，其中結(jié)構(gòu)蛋白C 有1 個(gè)氨基酸突變，E蛋白有2 個(gè)氨基酸突變，無(wú)基因缺失或插入。表明“森張”株TBEV 適應(yīng)2BS 細(xì)胞傳代過程中，基因組保持整體穩(wěn)定。

TBEV 的5′UTR 有131 ～134 核苷酸（nt），內(nèi)含潛在參與二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的保守元件（element），5′UTR 共有4 個(gè)莖-環(huán)區(qū)，其中后3 個(gè)在TBEV 的RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起到重要作用［8］。2BS 細(xì)胞適應(yīng)株TBEV 的5′UTR 有1 個(gè)堿基突變點(diǎn)（C39A），位于第1 個(gè)莖-環(huán)區(qū)，該位點(diǎn)不影響TBEV 的RNA 環(huán)化和復(fù)制作用。3′UTR 內(nèi)含蜱傳病毒群特有的保守序列，黃病毒屬所有成員3′UTR 末端約100 nt 形成穩(wěn)定長(zhǎng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（3′-LSH），序列各異但構(gòu)象保守，同細(xì)胞蛋白、病毒RNA 聚合酶間存在特定相互作用，直接參與病毒負(fù)鏈RNA 的起始合成以及影響病毒毒力［9-10］。2BS 細(xì)胞適應(yīng)株TBEV 的3′UTR 有1 個(gè)堿基突變點(diǎn)（C384T），位于末端長(zhǎng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)，該堿基的突變可能影響病毒毒力，致病性等。

包膜蛋白E 是TBEV 最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，其單聚體折疊成3 個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其中E（Q232R）突變位點(diǎn)在結(jié)構(gòu)域Ⅱ，該結(jié)構(gòu)域在所有黃病毒中幾乎完全保守，對(duì)病毒的融合和組裝具有重要作用，此位點(diǎn)突變不會(huì)影響結(jié)構(gòu)域Ⅱ?qū)Σ《镜娜诤匣钚裕?，11］。結(jié)構(gòu)域Ⅲ中的L492F 位于跨膜區(qū)，由于該區(qū)域（E 蛋白氨基酸473 ～496）在黃病毒蛋白合成過程中作為非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 的信號(hào)序列，因此其可能在成熟E 蛋白中無(wú)進(jìn)一步的功能作用［12］，因此推測(cè)該位點(diǎn)的突變不影響TBEV 與受體結(jié)合能力，對(duì)E 蛋白結(jié)構(gòu)形式及生物學(xué)功能無(wú)影響。

非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 是由E 蛋白C-末端信號(hào)肽引導(dǎo)產(chǎn)生，參與病毒外源和內(nèi)源性雙鏈RNA 形成。NS1能夠明顯增加病毒的神經(jīng)侵襲力，并在TBEV 通過血腦屏障中發(fā)揮重要作用［13］。BST-4 的NS1（P146L、I324F）突變位點(diǎn)可能會(huì)減弱補(bǔ)體系統(tǒng)在病毒入侵神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)的促進(jìn)作用，從而導(dǎo)致其神經(jīng)毒力降低。非結(jié)構(gòu)蛋白NS3 在黃病毒屬中的主要功能是參與病毒復(fù)制，以及免疫逃逸，具有蛋白水解酶和RNA解旋酶活性，其中，蛋白水解酶功能是可與宿主細(xì)胞內(nèi)的水解酶一同將病毒基因組轉(zhuǎn)錄翻譯后的總蛋白質(zhì)水解為有功能活性的單個(gè)蛋白質(zhì)，解旋酶功能與病毒基因組RNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄翻譯密切相關(guān)［14］。NS3 蛋白中氨基酸的突變（Y74D、T142I、N160S、T339A）可能有利于在細(xì)胞培養(yǎng)中蝕斑的形成，嗜神經(jīng)毒力減弱，并可能影響其溫度敏感性。非結(jié)構(gòu)蛋白NS5具有甲基轉(zhuǎn)移酶和RNA 依賴的RNA 聚合酶活性，在病毒基因組的復(fù)制以及病毒的致病中發(fā)揮重要作用［15］。研究表明，在NS5 蛋白的甲基轉(zhuǎn)移酶（Met 2606 Lys）和RNA 依賴的RNA 聚合酶（S2969F）部分，盡管M2606K 的疏水-親水堿性轉(zhuǎn)變可能具有結(jié)構(gòu)上的意義，但并不影響甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的其他重要功能基序［16］。NS5 蛋白第160 和372 位的精氨酸（R）取代賴氨酸（K），兩者均為極性、堿性氨基酸，第452 位丙氨酸（A）突變?yōu)槔i氨酸（V），其氨基酸極性未變，推測(cè)可能未造成其結(jié)構(gòu)的改變，并不影響其生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，NS2、NS3 和NS5 氨基酸的替換與TBEV 從人腦到豬腎、人腎和小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的適應(yīng)有關(guān)，在適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［17］

本研究進(jìn)一步分析了BST-4 編碼的E 蛋白序列與歐洲亞型、遠(yuǎn)東亞型、西伯利亞亞型TBEV 同源性，結(jié)果顯示，BST-4 基因序列與我國(guó)境內(nèi)東北區(qū)域J LCB11-08、JLCB11-35、JLCB11-40、DXAL-12、DXAL-13、DXAL-21、MDJ01 流行株同源性相近，與Xinjiang-01 株最接近，均屬于遠(yuǎn)東亞型［18-20］，適應(yīng)2BS 細(xì)胞培養(yǎng)后的TBEV 與流行株保持較高的基因穩(wěn)定性，為疫苗免疫保護(hù)性的提高提供了保證。

病毒基因單位點(diǎn)的突變可能對(duì)病毒株的致病性、感染性等造成影響，適應(yīng)細(xì)胞傳代會(huì)對(duì)病毒毒力造成影響，多次傳代及更換細(xì)胞傳代后仍可能發(fā)生回復(fù)突變。推測(cè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS2a、NS3 和NS5 部分基因在TBEV 適應(yīng)不同細(xì)胞培養(yǎng)中起到關(guān)鍵性作用。森林腦炎病毒2BS 適應(yīng)株的15 個(gè)氨基酸突變與TBEV 的宿主細(xì)胞適應(yīng)性及毒力變化相關(guān)性尚有待進(jìn)一步研究。

本研究將“森張”株TBEV 感染2BS 細(xì)胞適應(yīng)傳代，全基因測(cè)序結(jié)果顯示其基因穩(wěn)定性較好，特別是結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列與鼠腦適應(yīng)株和其他遠(yuǎn)東亞型TBEV 均具有極高的同源性。在分子水平方面證明相對(duì)于鼠腦株TBEV 基因穩(wěn)定，為2BS 細(xì)胞森林腦炎疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。