余偉，牟蕾，吳佳君，魯濤，黃琰，洪樹青，王黔川，李偉

1.成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司，四川 成都 610041；2.成都生物制品研究所有限責(zé)任公司，四川 成都 610041

人凝血酶原復(fù)合物（human prothrombin complex，簡稱PCC）是以健康人血漿為原料，經(jīng)多步離子交換層析法分離純化和相應(yīng)病毒滅活方式處理，制備的一種能促進(jìn)血液凝固的血漿蛋白類凝血因子制劑。PCC 臨床上除用于治療血友病B 外，更多用于治療因維生素K 或患肝病引起的出血性癥狀。藥品注冊(cè)管理辦法（局令第28 號(hào)）明確規(guī)定：鑒于生物制品的多樣性和復(fù)雜性，藥理毒理方面的試驗(yàn)項(xiàng)目要求可能并不適用于所有的治療生物制品。雖然PCC隸屬于生物制品，但來源于人體血漿，使用劑量不超過生理允許劑量范圍，且未進(jìn)行特殊工藝處理、未使用特殊溶劑，在提出相關(guān)資料或證明后，可免報(bào)安全性研究資料。

目前，國內(nèi)PCC 已具有數(shù)十年的臨床使用經(jīng)驗(yàn)，也證明了該產(chǎn)品的臨床安全性，但不同廠家PCC 制品在制備工藝、保護(hù)劑和干熱病毒滅活方式選擇上仍存在一定差異，也需在臨床試驗(yàn)前開展相應(yīng)的安全性評(píng)價(jià)，以保障患者的合法權(quán)益。因此，成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司（簡稱蓉生藥業(yè)）在申報(bào)過程中基于制品的作用機(jī)制和自身特點(diǎn)，參考相應(yīng)技術(shù)指導(dǎo)原則，科學(xué)、合理地進(jìn)行了PCC 的藥理毒理研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 供試品 PCC 由蓉生藥業(yè)自主研發(fā)，是以健康人血漿為原料，經(jīng)2 步離子交換層析法分離純化，并經(jīng)有機(jī)溶劑／ 去污劑（solvent／detergent，S／D）法和80 ℃、72 h 干熱法處理，制備獲得的富含人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的凍干制劑。產(chǎn)品批號(hào)：20130201、20130302 和20130303，質(zhì)量符合人凝血酶原復(fù)合物各論要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30 只SPF 級(jí)昆明系小鼠（批號(hào)：mk-20130315-178 和mk20130322-209）、12 只 清 潔 級(jí)英國種豚鼠（批號(hào)：gp20110414-034 和gp20110429-041）由成都生物制品研究所有限責(zé)任公司提供；SPF 級(jí)新西蘭兔，6 只，雌雄各半，給藥開始時(shí)動(dòng)物體重：雄性2.7 ～ 3.2 kg、雌性2.7 ～ 2.9 kg，由中國食品藥品檢定研究院提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：11400500005399。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的對(duì)新西蘭兔進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，經(jīng)北京昭衍新藥研究中心股份有限公司動(dòng)物管理與使用委員會(huì)（IACUC）批準(zhǔn)（ACU14-472）。

1.3 主要試劑及儀器 2%兔紅細(xì)胞混懸液由北京昭衍新藥研究中心股份有限公司飼養(yǎng)檢疫合格的健康兔全血經(jīng)脫纖處理后獲得；0.5%纖維蛋白原溶液（批號(hào)：20130307）、人凝血酶溶液（批號(hào)：20121105）、缺血小板血漿（批號(hào)：20120626）、腦磷脂混懸液（批號(hào)：20120618）由蓉生藥業(yè)提供；半自動(dòng)凝血儀（MC-4）購自德國美靈公司；氣相色譜儀（Agilent 7890A）購自美國安捷倫公司；紫外分光光度計(jì)（TU-1800SPC）購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.4 異常毒性試驗(yàn) 根據(jù)《中國藥典》三部（2010 版）要求進(jìn)行異常毒性試驗(yàn)，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)見表1。

表1 PCC 異常毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Design of abnormal toxicity test of PCC

1.5 體外溶血試驗(yàn) 以國家食品藥品監(jiān)督管理總局（China Food and Drug Administration，CFDA）發(fā)布的《治療用生物制品非臨床安全性技術(shù)審評(píng)一般原則》和《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》為試驗(yàn)指導(dǎo)原則［1-2］，采用體外試管法，通過觀察制品在體外是否引起兔紅細(xì)胞溶血或凝聚，為臨床研究提供體外試驗(yàn)資料。取潔凈試管7支編號(hào)，1 ～ 5 號(hào)為供試品管，6 號(hào)為陰性對(duì)照管，7號(hào)為陽性對(duì)照管。向各試管依次加入2%紅細(xì)胞懸液、0.9%氯化鈉注射液、供試品溶液或滅菌注射用水，混勻后，置（37 ± 0.5）℃恒溫箱溫育。開始時(shí)每隔15 min 觀察1 次，1 h 后，每隔1 h 觀察1 次，觀察3 h。如溶液呈透明紅色，即表示溶血；如溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，振搖后不分散，表示有紅細(xì)胞凝聚作用。

1.6 刺激性試驗(yàn) 在參考CFDA 發(fā)布的《治療用生物制品非臨床安全性技術(shù)審評(píng)一般原則》和《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》［1-2］基礎(chǔ)上，取6 只新西蘭兔，雌雄各半，采用同體左右側(cè)自身對(duì)照法。于兔左耳耳緣靜脈輸注生理鹽水（陰性對(duì)照），右耳耳緣靜脈輸注供試品溶液（供試品組），給藥容量為1 mL／kg，給藥速度為1 mL／min，每天給藥1 次，連續(xù)給藥7 d。試驗(yàn)期間，每天進(jìn)行1 次臨床觀察和給藥局部觀察。末次藥后3 d（D10），每組每性別前2 只動(dòng)物實(shí)施安樂死，恢復(fù)期結(jié)束后（D21），對(duì)剩余動(dòng)物實(shí)施安樂死，給藥局部組織取材并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.7 人凝血酶活性檢查 按《中國藥典》三部（2010版）人凝血酶活性檢查（附錄ⅨN）要求，取供試品溶液0.2 mL，人凝血酶溶液0.2 mL，0.9%氯化鈉溶液0.2 mL，分別加入0.5%纖維蛋白原溶液0.2 mL，37 ℃放置24 h，觀察有無凝塊或蛋白析出。供試品做2 管，分別為供試樣1 和2，放置期間至少觀察2 次。

1.8 肝素含量 按《中國藥典》三部（2010 版）肝素含量（附錄ⅨP）要求，分別在樣品杯中加入缺血小板血漿和腦磷脂混懸稀釋液各100 μL，37 ℃放置1 min，加入供試品溶液0.1 mL，已預(yù)熱至37 ℃的0.025 mol／L 氯化鈣溶液0.1 mL，記錄凝固時(shí)間。

1.9 活化的人凝血因子活性檢查 按《中國藥典》三部（2010 版）活化的凝血因子活性檢查（附錄ⅨO）要求，取缺血小板人血漿0.1 mL，加入腦磷脂混懸液0.1 mL，混勻，37 ℃放置1 min，加入供試品溶液［用Tris 緩沖液（pH 7.5）進(jìn)行10 和100 倍稀釋］0.1 mL、已預(yù)熱至37 ℃的0.025 mol／L 氯化鈣溶液0.1 mL，記錄凝固時(shí)間。

1.10 磷酸三丁酯和聚山梨酯80 殘留量檢測 按《中國藥典》三部（2010 版）方法進(jìn)行檢測，同時(shí)將本品與市售PCC 產(chǎn)品的指標(biāo)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 異常毒性試驗(yàn)

2.1.1 小鼠異常毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)組小鼠腹腔注射供試品30 min 后，無異常反應(yīng)。飼養(yǎng)觀察期間，試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠全部健存，且無異常反應(yīng)，觀察期結(jié)束時(shí)，每只小鼠體重增加均> 50%。

2.1.2 豚鼠異常毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)組豚鼠腹腔注射供試品30 min 后，無異常反應(yīng)。飼養(yǎng)觀察期間，試驗(yàn)組和對(duì)照組豚鼠全部健存，且無異常反應(yīng)，觀察期結(jié)束時(shí)，每只豚鼠體重增加均> 10%。

2.2 體外溶血試驗(yàn) 自放入恒溫箱15 min 開始至3 h 觀察結(jié)束，陰性對(duì)照管上層液體均無色澄明，管底紅細(xì)胞下沉，經(jīng)振搖后均勻分散；陽性對(duì)照管均可見溶液澄明紅色，管底無紅細(xì)胞殘留；5 個(gè)供試品管上層液體均無色澄明，管底紅細(xì)胞下沉，經(jīng)振搖后均勻分散。

2.3 刺激性試驗(yàn) 試驗(yàn)期間，供試品組新西蘭兔臨床觀察均未見異常反應(yīng)。給藥局部觀察：供試品組部分新西蘭兔自D2 給藥后，給藥局部開始陸續(xù)出現(xiàn)紅斑、腫脹（自進(jìn)針位置至針尖所在位置），最多有4／6 只動(dòng)物出現(xiàn)給藥局部紅斑；D10 陰性對(duì)照和供試品組新西蘭兔給藥局部分別有0／5 和1／5 出現(xiàn)紅斑，其余動(dòng)物給藥局部均未見異常；D11 ～ D21（恢復(fù)期）未見給藥局部異常。給藥局部大體解剖觀察：D10 和D21 新西蘭兔大體解剖觀察未見異常改變。組織病理學(xué)檢查：D10 和D21 新西蘭兔給藥局部組織病理學(xué)檢查未見與供試品相關(guān)的炎性刺激改變。在本試驗(yàn)條件下，PCC 靜脈輸注（20 IU／mL，20 IU／kg，1 mL／min）給予新西蘭兔，每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d，給藥局部未見與供試品相關(guān)的刺激性反應(yīng)。

2.4 人凝血酶活性檢查、肝素含量、活化的人凝血因子活性檢查 3 項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果均符合《中國藥典》三部（2010 版）質(zhì)量要求，見表2。

表2 人凝血酶活性檢查、肝素含量、活化的人凝血因子活性檢查結(jié)果匯總Tab.2 Test results of human thrombin activity，heparin content and activated human coagulation factor activity

2.5 磷酸三丁酯和聚山梨酯80 殘留量 2 項(xiàng)指標(biāo)最終殘留量均遠(yuǎn)低于《中國藥典》三部（2010 版）對(duì)PCC 產(chǎn)品的要求（聚山梨酯80 ≤100，磷酸三丁酯≤10），同時(shí)也低于市售同類產(chǎn)品，見表3。

表3 磷酸三丁酯和聚山梨酯80 殘留量的比較（μg／mL）Tab.3 Residual contents of tributyl phosphate and Tween 80（μg／mL）

3 討論

引發(fā)血管溶血和刺激性的因素較多，包括生產(chǎn)工藝有無對(duì)雜蛋白的去除能力、藥物自身的毒性、血漿滲透壓的改變、各種微粒因素和醫(yī)務(wù)人員操作不當(dāng)?shù)取３朔撬幬镄砸蛩赝?，?yīng)重點(diǎn)考察產(chǎn)品相關(guān)的引發(fā)血管溶血和刺激性的因素。PCC 是蓉生藥業(yè)自主研發(fā)的凍干制劑，參考文獻(xiàn)［3-4］，在制備工藝中采用離心法去除冷沉淀，并采用第2 步DEAE Sephadex A50 凝膠對(duì)可能引發(fā)溶血的雜蛋白進(jìn)行去除。在配方選擇上，借鑒國內(nèi)外同類產(chǎn)品經(jīng)驗(yàn)［5-9］，選擇甘氨酸和鹽酸賴氨酸為凍干和干熱配方。按PCC 產(chǎn)品的最大輸注量4000 IU（約200 mL，50 kg，80 IU／kg）計(jì)算，患者接受甘氨酸的最大劑量為0.08 g／kg，遠(yuǎn)低于甘氨酸LD50量?；颊邌未巫⑸潲}酸賴氨酸劑量為0.02 g／kg，遠(yuǎn)低于鹽酸賴氨酸LD50量［10］。對(duì)制品中潛在的脂包膜和非脂包膜病毒采用2 步病毒滅活，也確保了患者臨床用藥的安全性。在采取上述措施情況下，進(jìn)行的溶血刺激性試驗(yàn)表明，濃度為20 IU／mL 的PCC 在體外對(duì)兔紅細(xì)胞無溶血作用，不引起紅細(xì)胞凝聚，且多次靜脈輸注新西蘭兔，對(duì)兔血管無刺激性作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告結(jié)果相符［11-12］。

聚山梨酯80 和磷酸三丁酯是S／D 病毒滅活劑，反應(yīng)液中二者最終加量分別為10 和3 mg／mL，在病毒滅活后，大部分會(huì)經(jīng)精制純化步驟、再經(jīng)超濾透析最終達(dá)到極低殘留。根據(jù)《中國藥典》三部（2010版）規(guī)定，PCC 制品中聚山梨酯80 和磷酸三丁酯殘留量分別不得高于100 和10 μg／mL?；颊咴谑褂肞CC 時(shí)的單次最大劑量約4000 IU（約200 mL，50 kg，80 IU／kg），即使按最大劑量輸注，聚山梨酯80 輸注量也不超過250 μg／kg，遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道中提到的閥值［13］，無毒性表現(xiàn)。磷酸三丁酯對(duì)小鼠的最低毒性劑量為10000 μg／kg，即使患者按最大劑量輸注，也不過2000 μg／kg，遠(yuǎn)低于最低毒性劑量。此外，國外已進(jìn)行了很多針對(duì)磷酸三丁酯和聚山梨酯80 的遺傳毒性研究，未發(fā)現(xiàn)二者在體內(nèi)或體外的遺傳毒性影響［14-15］。本研究對(duì)連續(xù)3 批制品進(jìn)行了異常毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明，小鼠和豚鼠均正常生長，體重增加，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無毒性。

PCC 的早期臨床使用中發(fā)現(xiàn)，患者使用后出現(xiàn)潛在血栓形成，包括出現(xiàn)彌散性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）、淺表靜脈血栓、深靜脈血栓、肺水腫，以及一些連續(xù)接受大劑量的病例［>200 IU ／（kg·d）］中出現(xiàn)致死的心肌梗塞等。產(chǎn)生這種副作用的確切原因尚未完全闡明，可能是制劑中含有少量活化或部分活化的凝血因子［16-17］。非活化部分凝血活酶時(shí)間（non-activated partial thromboplastin time，NAPTT）試驗(yàn)和凝血酶纖維蛋白原凝血時(shí)間（thrombin fibrinogen clotting time，TFCT）試驗(yàn)是目前常用的體外評(píng)價(jià)PCC 潛在血栓性的方法。這兩種方法簡單、有效，被載入《歐洲藥典》（10.0 版）和《中國藥典》三部（2010 版）人凝血酶原復(fù)合物各論中。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格控制生產(chǎn)工藝參數(shù)，選擇合適的配方和保護(hù)劑避免制備過程中凝血因子的活化，結(jié)果表明，該2 項(xiàng)指標(biāo)均符合質(zhì)量要求，表明蓉生藥業(yè)制備的PCC 在減少潛在血栓性方面的措施是成功的。

綜上所述，蓉生藥業(yè)生產(chǎn)的PCC 各項(xiàng)安全性指標(biāo)均在控制范圍內(nèi)，可初步判定本制品具有臨床安全性，且本制品已完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)，在臨床試驗(yàn)過程中未發(fā)生任何與此相關(guān)的不良反應(yīng)。